هنا، نقدم بروتوكول لتسمية الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الصفائح الدموية لرصد هجرتها وامتصاصها في النباتات الخارجية الغضاريف المستخدمة كنموذج لهشاشة العظام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تستخدم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في دراسات مختلفة لإثبات إمكاناتها كعلاج خال من الخلايا بسبب حمولتها المستمدة من مصدرها الخلوي ، مثل lysate الصفائح الدموية (PL). عند استخدامها كعلاج، من المتوقع أن تدخل المركبات الكهربائية الخلايا المستهدفة وتؤثر على استجابة من هذه. في هذا البحث، تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من PL كعلاج خال من الخلايا لهشاشة العظام (OA). وهكذا، تم إعداد طريقة لتسمية المركبات الكهربائية واختبار امتصاصها على النباتات الغضاريف. وصفت المركبات الكهربائية المشتقة PL مع صبغة الدهون PKH26، وغسلها مرتين من خلال عمود، ومن ثم اختبارها في نموذج الزراعة العضوية في المختبر يحركها الالتهاب لمدة 5 ساعة بعد تحديد كمية الجسيمات عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). كل ساعة، يتم إصلاح النباتات الغضاريف، paraffined، مقطعة إلى أقسام 6 ميكرومتر لتركيب على الشرائح، ولاحظ تحت المجهر confocal. وهذا يسمح بالتحقق مما إذا كانت المركبات الكهربائية تدخل الخلايا المستهدفة (chondrocytes) خلال هذه الفترة وتحلل تأثيرها المباشر.
المقدمة
هشاشة العظام (OA) هو مرض تنكسي مفصلي ينطوي على التهاب تدريجي ولا رجعة فيه وتدمير المصفوفة خارج الخلية للغضاريف المفصلية1. على الرغم من أن أشكال مختلفة من التهاب المفاصل لديها العديد من العلاجات2,3,4, هذه مقيدة بآثارها الجانبية وفعالية محدودة. تقنيات هندسة الأنسجة باستخدام زرع chondrocyte الذاتية يتم تطبيقها بشكل روتيني للعلاج التجديدي للغضاريف المصابة في آفات غضروف الزراعة العضوية في وقت مبكر4. تقتصر العلاجات المستندة إلى الخلايا بشكل رئيسي بسبب العدد المحدود من الخلايا الشوندروجينية المستقرة أو المتجانسات القادرة على إصلاح الغض....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم الحصول على نباتات الغضروف من البنك الحيوي IdISBa (IB 1995/12 BIO) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بعد الموافقة الأخلاقية للمشروع من قبل CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. إعداد العمود
- أعمدة متساوية تتبع إرشادات الشركة المصنعة أو كما يلي:
- قم بإزالة غطاء العمود وتوازن العمود. قم بإزالة المخزن المؤقت للتخزين بواسطة الوضوء.
- اغسل العمود 3 مرات مع 2.5 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS). أثناء كل غسل، انتظر حتى يمتص العمود الحجم بالكامل.
ملاحظة: لا تدع العمود الجاف. - قم بتغطية العمود بالغطاء بعد الغسيل الأخير وحتى إعداد العينة.
2. EV وضع العلامات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم عرض نظرة عامة تخطيطية ل EV وضع العلامات ومراقبة امتصاص في الشكل 1. يظهر تركيز الجسيمات وحجم EV الذي اكتشفه NTA في الجدول 1 أن تركيز EV ينخفض أثناء العملية بسبب خطوة التنقية التي أجريت مرتين بعد وضع العلامات مع العمود. ومع ذلك، فإن الكمية التي تم الحصول عليها هي في النطاق الأمثل لعدد الجسيمات لاستخدامها في العلاج. يتم استخدام هذا التركيز الجسيمات لحساب حجم PKH-PL-EV والتحكم التي تستخدم لعلاج النباتات الخارجية الغضاريف المفاصل.
بمجرد معالجة النب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يساعد التصوير EV على فهم خصائص EV، مثل آليات إطلاقها واستيعابها. يسمح تصويرهم بمراقبة التوزيع الحيوي وتوصيف خصائصهم الدوائية كمركبات دوائية. ومع ذلك، قد يكون التصوير EV وتتبع صعبة نظرا لأحجامها الصغيرة، على الرغم من أن العديد من أجهزة التصوير وتقنيات وضع العلامات قد وضعت لمساعدة الباحثين مراقبة المركبات الكهربائية تحت في المختبر وفي ظروف الجسم الحي 23،24،25.
هناك احتمالان عند تتبع ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
شكر وتقدير
وقد مول هذا البحث معهد سالود كارلوس الثالث، الوزير الاقتصادي، الذي شارك في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي التابع للصندوق الأوروبي للتنمية الاقتصادية (MS16/00124؛ CP16/00124); بواسطة PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS، construyendo SALUD، جينيراندو فالور (JUNIOR01/18)، بتمويل من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار؛ من قبل Direcció العام d'Investigació، كونسيليريا دي إنفيستيغاسيو، الحكم بالار (FPI/2046/2017)؛ من برنامج FOLIUM ما بعد الدكتوراه (FOLIUM 17/01) ضمن FUTURMed ، الممول بنسبة 50٪ من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار و 50٪ من قبل ESF ؛ ومن قبل لجنة دوسينسيا إي إنفيستياسيو دي لا فونداسيو بانك دي سانغ إي تيكسيتس دي لي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > مادة < / قوي > 1.5 | |||
| مل أنبوب الطرد المركزي | SPL علوم الحياة | PLC60015 | |
| 1 مل حقنة BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-بروبانول (إيزوبروبانول) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | محضر بنسبة 20٪ مع |
| لوحة ثقافة المياه Milli-Q 96 بئر | SPL علوم | الحياةPLC30096 | |
| الإيثانول المطلق فارمبور | شارلاب ET0006005P | يستخدم لتحضير 96٪ و 75٪ من الإيثانول مع Milli-Q Water | |
| Punch مع مكبس 3 مم | Scandidact | MTP-33-32 | |
| مصل البقر ؛ الألبومين (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | محضر بنسبة 5٪ مع |
| نباتات الغضروف | IdISBa Biobank | ||
| أنبوب التركيز 15 مل Nanosep 100 kD أوميغا | بال MCP100C41 | ||
| أنبوب التركيز 500 & micro ؛ L Nanosep 100 kD أوميغا | بال OD003C33 | ||
| غطاء زجاجي 24 × 60 مم | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| كتل أنسجة البارافين المدمجة | IdISBa رسوم البنك | الحيوي للخدمة | |
| أعمدة Exo-spin mini-HD | أنظمة توجيه الخلية | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 & micro ؛ مرشح حقنة m | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield مع DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | تحضير محلول مخزون للتركيز النهائي 0.1 & micro ؛ ز /& مايكرو ؛ L diluten في PBS-0.1٪ BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | محضرة بنسبة 4٪ مع PBS ومخزنة عند 4 درجات ؛ C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 مجموعة ربط الخلايا الفلورية الحمراء لوضع العلامات على غشاء الخلية العامة | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 و Dliuent C المضمنة |
| سترات الصوديوم ثنائي هيدرات | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNF& ألفا. | R & أنظمة D | 210-TA-005 | إعداد محلول مخزون بتركيز نهائي قدره 0.01 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ L مخفف في PBS-0.1٪ BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | يستخدم لتحضير محلول سترات الصوديوم 0.1٪ تريتون-0.1٪ مع ماء Milli-Q |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P< | |
| strong>Equipment< / قوي > | |||
| جهاز طرد مركزي 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 الدوار |
| NanoSight NS300 | جهاز Malvern | NS300 | مع ليزر مدمج في &lambda ؛ = 532 نانومتر والكاميرا sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific & trade ؛ | A78100101 | |
| المجهر متحد البؤر TCS-SPE | Leica Microsystems | 5200000271 |
المراجع
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
