يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

2.4K مشاهدة

DOI:

10.3791/62780

أكتوبر 4, 2021

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكول لتسمية الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الصفائح الدموية لرصد هجرتها وامتصاصها في النباتات الخارجية الغضاريف المستخدمة كنموذج لهشاشة العظام.

الملخص

تستخدم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في دراسات مختلفة لإثبات إمكاناتها كعلاج خال من الخلايا بسبب حمولتها المستمدة من مصدرها الخلوي ، مثل lysate الصفائح الدموية (PL). عند استخدامها كعلاج، من المتوقع أن تدخل المركبات الكهربائية الخلايا المستهدفة وتؤثر على استجابة من هذه. في هذا البحث، تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من PL كعلاج خال من الخلايا لهشاشة العظام (OA). وهكذا، تم إعداد طريقة لتسمية المركبات الكهربائية واختبار امتصاصها على النباتات الغضاريف. وصفت المركبات الكهربائية المشتقة PL مع صبغة الدهون PKH26، وغسلها مرتين من خلال عمود، ومن ثم اختبارها في نموذج الزراعة العضوية في المختبر يحركها الالتهاب لمدة 5 ساعة بعد تحديد كمية الجسيمات عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). كل ساعة، يتم إصلاح النباتات الغضاريف، paraffined، مقطعة إلى أقسام 6 ميكرومتر لتركيب على الشرائح، ولاحظ تحت المجهر confocal. وهذا يسمح بالتحقق مما إذا كانت المركبات الكهربائية تدخل الخلايا المستهدفة (chondrocytes) خلال هذه الفترة وتحلل تأثيرها المباشر.

المقدمة

هشاشة العظام (OA) هو مرض تنكسي مفصلي ينطوي على التهاب تدريجي ولا رجعة فيه وتدمير المصفوفة خارج الخلية للغضاريف المفصلية1. على الرغم من أن أشكال مختلفة من التهاب المفاصل لديها العديد من العلاجات2,3,4, هذه مقيدة بآثارها الجانبية وفعالية محدودة. تقنيات هندسة الأنسجة باستخدام زرع chondrocyte الذاتية يتم تطبيقها بشكل روتيني للعلاج التجديدي للغضاريف المصابة في آفات غضروف الزراعة العضوية في وقت مبكر4. تقتصر العلاجات المستندة إلى الخلايا بشكل رئيسي بسبب العدد المحدود من الخلايا الشوندروجينية المستقرة أو المتجانسات القادرة على إصلاح الغض....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم الحصول على نباتات الغضروف من البنك الحيوي IdISBa (IB 1995/12 BIO) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بعد الموافقة الأخلاقية للمشروع من قبل CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. إعداد العمود

  1. أعمدة متساوية تتبع إرشادات الشركة المصنعة أو كما يلي:
    1. قم بإزالة غطاء العمود وتوازن العمود. قم بإزالة المخزن المؤقت للتخزين بواسطة الوضوء.
    2. اغسل العمود 3 مرات مع 2.5 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS). أثناء كل غسل، انتظر حتى يمتص العمود الحجم بالكامل.
      ملاحظة: لا تدع العمود الجاف.
    3. قم بتغطية العمود بالغطاء بعد الغسيل الأخير وحتى إعداد العينة.

2. EV وضع العلامات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم عرض نظرة عامة تخطيطية ل EV وضع العلامات ومراقبة امتصاص في الشكل 1. يظهر تركيز الجسيمات وحجم EV الذي اكتشفه NTA في الجدول 1 أن تركيز EV ينخفض أثناء العملية بسبب خطوة التنقية التي أجريت مرتين بعد وضع العلامات مع العمود. ومع ذلك، فإن الكمية التي تم الحصول عليها هي في النطاق الأمثل لعدد الجسيمات لاستخدامها في العلاج. يتم استخدام هذا التركيز الجسيمات لحساب حجم PKH-PL-EV والتحكم التي تستخدم لعلاج النباتات الخارجية الغضاريف المفاصل.

بمجرد معالجة النب.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يساعد التصوير EV على فهم خصائص EV، مثل آليات إطلاقها واستيعابها. يسمح تصويرهم بمراقبة التوزيع الحيوي وتوصيف خصائصهم الدوائية كمركبات دوائية. ومع ذلك، قد يكون التصوير EV وتتبع صعبة نظرا لأحجامها الصغيرة، على الرغم من أن العديد من أجهزة التصوير وتقنيات وضع العلامات قد وضعت لمساعدة الباحثين مراقبة المركبات الكهربائية تحت في المختبر وفي ظروف الجسم الحي 23،24،25.

هناك احتمالان عند تتبع ال.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

شكر وتقدير

وقد مول هذا البحث معهد سالود كارلوس الثالث، الوزير الاقتصادي، الذي شارك في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي التابع للصندوق الأوروبي للتنمية الاقتصادية (MS16/00124؛ CP16/00124); بواسطة PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS، construyendo SALUD، جينيراندو فالور (JUNIOR01/18)، بتمويل من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار؛ من قبل Direcció العام d'Investigació، كونسيليريا دي إنفيستيغاسيو، الحكم بالار (FPI/2046/2017)؛ من برنامج FOLIUM ما بعد الدكتوراه (FOLIUM 17/01) ضمن FUTURMed ، الممول بنسبة 50٪ من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار و 50٪ من قبل ESF ؛ ومن قبل لجنة دوسينسيا إي إنفيستياسيو دي لا فونداسيو بانك دي سانغ إي تيكسيتس دي لي....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > مادة < / قوي > 1.5
مل أنبوب الطرد المركزيSPL علوم الحياةPLC60015
1 مل حقنة BD PlastipakBD303174
2-بروبانول (إيزوبروبانول)Panreac AppliChem1.310.901.211محضر بنسبة 20٪ مع
لوحة ثقافة المياه Milli-Q 96 بئرSPL علومالحياةPLC30096
الإيثانول المطلق فارمبورشارلاب ET0006005Pيستخدم لتحضير 96٪ و 75٪ من الإيثانول مع Milli-Q Water
Punch مع مكبس 3 ممScandidactMTP-33-32
مصل البقر   ؛ الألبومين (BSA)Sigma-AldrichA7030محضر بنسبة 5٪ مع
نباتات الغضروفIdISBa Biobank
أنبوب التركيز 15 مل Nanosep 100 kD أوميغابال MCP100C41
أنبوب التركيز 500 & micro ؛ L Nanosep 100 kD أوميغابال OD003C33
غطاء زجاجي 24 × 60 ممDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX mediumBiowestL0092
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
كتل أنسجة البارافين المدمجةIdISBa رسوم البنكالحيوي للخدمة
أعمدة Exo-spin mini-HDأنظمة توجيه الخليةEX05
Feather S35 Microtome BladeFeather43037
Filtropur S 0.2 & micro ؛ مرشح حقنة mSarstedt83.1826.001
Fluoroshield مع DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatin M HumanSigma-AldrichO9635-10UGتحضير محلول مخزون للتركيز النهائي 0.1 & micro ؛ ز /& مايكرو ؛ L diluten في PBS-0.1٪ BSA
ParaformaldehydeSigma-Aldrich8.18715.1000محضرة بنسبة 4٪ مع PBS ومخزنة عند 4 درجات ؛ C
Penicillin-Streptomycin Solution 100xBiowestL0022
PKH26 مجموعة ربط الخلايا الفلورية الحمراء لوضع العلامات على غشاء الخلية العامةSigma-AldrichMINI26PKH26 و Dliuent C المضمنة
سترات الصوديوم ثنائي هيدراتScharlabSO019911000
Superfrost Plus Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
TNF& ألفا.R & أنظمة D210-TA-005إعداد محلول مخزون بتركيز نهائي قدره 0.01 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ L مخفف في PBS-0.1٪ BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787يستخدم لتحضير محلول سترات الصوديوم 0.1٪ تريتون-0.1٪ مع ماء Milli-Q
XyleneScharlabXI0050005P<
strong>Equipment< / قوي >
جهاز طرد مركزي 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 الدوار
NanoSight NS300جهاز MalvernNS300مع ليزر مدمج في &lambda ؛ = 532 نانومتر والكاميرا sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual MicrotomeThermo Scientific & trade ؛A78100101
المجهر متحد البؤر TCS-SPELeica Microsystems5200000271
Biopsy PBS

المراجع

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

وسم الحويصلات خارج الخلويةهجرة الحويصلات خارج الخلويةامتصاص الحويصلات خارج الخلويةالمجهر البؤريالحويصلات خارج الخلوية المشتقة من نضحة الصفائح الدمويةتتبع الجسيمات النانويةنموذج الفصال العظمي في المختبرامتصاص الخلايا الغضروفية