يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

2.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62780

⸱

أكتوبر 4, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكول لتسمية الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الصفائح الدموية لرصد هجرتها وامتصاصها في النباتات الخارجية الغضاريف المستخدمة كنموذج لهشاشة العظام.

الملخص

تستخدم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في دراسات مختلفة لإثبات إمكاناتها كعلاج خال من الخلايا بسبب حمولتها المستمدة من مصدرها الخلوي ، مثل lysate الصفائح الدموية (PL). عند استخدامها كعلاج، من المتوقع أن تدخل المركبات الكهربائية الخلايا المستهدفة وتؤثر على استجابة من هذه. في هذا البحث، تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من PL كعلاج خال من الخلايا لهشاشة العظام (OA). وهكذا، تم إعداد طريقة لتسمية المركبات الكهربائية واختبار امتصاصها على النباتات الغضاريف. وصفت المركبات الكهربائية المشتقة PL مع صبغة الدهون PKH26، وغسلها مرتين من خلال عمود، ومن ثم اختبارها في نموذج الزراعة العضوية في المختبر يحركها الالتهاب لمدة 5 ساعة بعد تحديد كمية الجسيمات عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). كل ساعة، يتم إصلاح النباتات الغضاريف، paraffined، مقطعة إلى أقسام 6 ميكرومتر لتركيب على الشرائح، ولاحظ تحت المجهر confocal. وهذا يسمح بالتحقق مما إذا كانت المركبات الكهربائية تدخل الخلايا المستهدفة (chondrocytes) خلال هذه الفترة وتحلل تأثيرها المباشر.

المقدمة

هشاشة العظام (OA) هو مرض تنكسي مفصلي ينطوي على التهاب تدريجي ولا رجعة فيه وتدمير المصفوفة خارج الخلية للغضاريف المفصلية1. على الرغم من أن أشكال مختلفة من التهاب المفاصل لديها العديد من العلاجات2,3,4, هذه مقيدة بآثارها الجانبية وفعالية محدودة. تقنيات هندسة الأنسجة باستخدام زرع chondrocyte الذاتية يتم تطبيقها بشكل روتيني للعلاج التجديدي للغضاريف المصابة في آفات غضروف الزراعة العضوية في وقت مبكر4. تقتصر العلاجات المستندة إلى الخلايا بشكل رئيسي بسبب العدد المحدود من الخلايا الشوندروجينية المستقرة أو المتجانسات القادرة على إصلاح الغضاريف3بشكل فعال. لذلك ، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع تطور المرض وتجديد آفات الغضاريف الكبيرة له أهمية قصوى.

الحويصلات خارج الخلية (EVs) وقد اقترح كعلاج لOA من قبل مؤلفين مختلفين5,6. المركبات الكهربائية هي أجسام ممبرانية تفرزها غالبية أنواع الخلايا ، وتشارك في الإشارات بين الخلايا ، وقد ثبت أنها تمارس الآثار العلاجية للخلايا الجذعية7،8،9، والتي أثارت مؤخرا اهتماما بالطب التجديدي10. المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا النجمية المتوسطة (MSCs) هي المركبات الكهربائية العلاجية الرئيسية التي تم التحقيق فيها ل OA ، على الرغم من استخدام الخلايا الأخرى ذات الصلة بالمفاصل كمصادر EV ، على سبيل المثال ، chondroprogenitors أو الخلايا المناعية11،12.

وتستخدم تركيزات الصفائح الدموية، مثل lysates الصفائح الدموية (PLs)، لتعزيز التئام الجروح في إصابات مختلفة، مثل قرحة القرنية13،14،15 أو في تجديد أنسجة الأوتار16،بسبب فرضية أن مكون EV من مركزات الصفائح الدموية قد تكون مسؤولة عن هذه الآثار17 . تستخدم بعض الدراسات المتعلقة بالأمراض المرتبطة بالمفاصل المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية (PL-EVs) كعلاج لتحسين حالات هشاشة العظام. PL-EVs تحسين انتشار chondrocyte وهجرة الخلايا عن طريق تفعيل Wnt / β-catenin المسار18, تعزيز التعبير عن علامات الشوندروجيني في chondrocytes هشاشة العظام19, أو تظهر مستويات أعلى من البروتينات الشوندروجينية وتشوهات أقل تيسي في الأرانب هشاشة العظام تعامل مع PL-EVs18.

تحتوي المركبات الكهربائية على البروتينات والدهون والأحماض النووية التي يتم تحريرها إلى الخلية المستهدفة ، مما يؤسس للاتصال من خلية إلى خلية ، وهي الميزة الرئيسية المتعلقة بتطبيقاتها العلاجية20. تعتمد آثار المركبات الكهربائية على وصولها إلى الخلايا وإطلاق الشحنات اللاحقة. يمكن تأكيد هذا التأثير بشكل غير مباشر من خلال التغيرات التي تحدث في الخلايا، مثل النشاط الأيضي أو تعديل التعبير الجيني. ومع ذلك، لا تسمح هذه الطرق تصور كيفية وصول المركبات الكهربائية إلى الخلايا لممارسة وظيفتها. وهكذا، تقدم هذه الورقة طريقة لتسمية هذه المركبات الكهربائية المشتقة من PL لاستخدامها كعلاج لنباتات غضروف الزراعة العضوية التي يحركها الالتهاب. تم استخدام المجهر Confocal لرصد امتصاص EV والتقدم إلى chondrocytes موجودة في explants في الفاصل الزمني من 5 ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم الحصول على نباتات الغضروف من البنك الحيوي IdISBa (IB 1995/12 BIO) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بعد الموافقة الأخلاقية للمشروع من قبل CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. إعداد العمود

  1. أعمدة متساوية تتبع إرشادات الشركة المصنعة أو كما يلي:
    1. قم بإزالة غطاء العمود وتوازن العمود. قم بإزالة المخزن المؤقت للتخزين بواسطة الوضوء.
    2. اغسل العمود 3 مرات مع 2.5 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS). أثناء كل غسل، انتظر حتى يمتص العمود الحجم بالكامل.
      ملاحظة: لا تدع العمود الجاف.
    3. قم بتغطية العمود بالغطاء بعد الغسيل الأخير وحتى إعداد العينة.

2. EV وضع العلامات

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول وضع العلامات EV عينة PL-EV معزولة مسبقا عن طريق اللونيات استبعاد الحجم (SEC) مع الشروط الموضحة سابقا21,22. ومع ذلك، قد يتم استخدام أي نموذج EV من أي مصدر مع هذا البروتوكول.

  1. ركز عينة EV والتحكم (PBS) باستخدام أنبوب التركيز.
    1. ضع العينات في أنبوب تركيز 15 مل أو 500 ميكرولتر، اعتمادا على حجم بدء تشغيل عينة EV. طرد الأنابيب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة حتى يتم الحصول على عينة شبه جافة.
      ملاحظة: عينة عنصر التحكم ضروري للتحقق من أي خلفية صبغ. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تتطلب أي حجم أولي محدد ، إلا أنه ينبغي النظر إلى أن حوالي 10٪ من الجسيمات ستفقد أثناء خطوات التنقية.
  2. إعادة تشغيل العينات المركزة مع عينات EV C. Resuspend مع 200 ميكرولتر ومجموعة التحكم مع 100 ميكرولتر ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل جديدة.
  3. فصل عينة EV إلى اثنين من aliquots من 100 ميكرولتر. مارك واحد مع صبغ واستخدامها كعلاج (PKH-PL-EV); ترك أخرى غير ملحوظ ولكن معالجته (NTA-PL-EV) مثل عينة EV واستخدامه لتحديد تركيز EV بواسطة NTA.
  4. إعداد محلول صبغ 2x، مما أدى إلى 8 ميكرومتر PKH26 الحل في C diluent.
  5. مزيج 1 ميكرولتر من 1 mM PKH26 رابط لكل 125 ميكرولتر من درجة C في العينة. إعداد وحدة تخزين مطلوبة لإضافتها إلى العينات بنسبة 1:1.
  6. إضافة محلول صبغ 2X إلى PKH-PL-EV وعينات التحكم في نسبة 1:1 لتحقيق تركيز صبغة 1x وتركيز 4 μM PKH26. إضافة نفس حجم برنامج تلفزيوني إلى عينة NTA-PL-EV. حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. إضافة 5٪ مصل البقر الألبومين-PBS الحل للعينات في نسبة 1:1 وضمان أن الحجم النهائي هو ~ 400 ميكرولتر.
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بإزالة التفاعلات الصبغية غير المحددة أو الصبغة غير المنضمة.
  8. تابع فصل المركبات الكهربائية المسماة عن الصبغة غير المنضمة والتفاعلات غير المحددة للصبغة مع العمود.

3. وصفت EV العزلة

  1. قم بإزالة الغطاء من العمود، وأضف 400 ميكرولتر من العينة (PKH-PL-EV أو NTA-PL-EV أو التحكم)، وتجاهل جميع السائل المفرغ.
  2. انتظر حتى تدخل العينة العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع السائل الملوت.
  3. انتظر برنامج تلفزيوني لإدخال العمود تماما قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وجمع جزء من 600 ميكرولتر في 1.5. mL أنبوب الطرد المركزي (EVs أو التحكم).
    ملاحظة: هذه الخطوات مطلوبة لإزالة الصبغة الزائدة من العينات. هناك حاجة إلى فصل آخر حسب العمود للحصول على أنقى المركبات الكهربائية. وهكذا، يجب تنفيذ الخطوات التالية في عمود جديد متساوية (الخطوة 4.1.) أو العمود نفسه بعد خطوة غسل أولية (الخطوة 4.2).
  4. قم بإعداد العمود لخطوة فصل EV جديدة للحصول على المركبات الكهربائية أنقى. إذا كان عمود جديد كرر الخطوات 2.1. و2.2. إذا كان نفس العمود، اغسل العمود ب 2.5 مل من 20٪ ايزوبروبانول ثم كرر الخطوتين 2.1 و2.2.
  5. إضافة 600 ميكرولتر من EVs التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5 إلى العمود وتجاهل وحدة التخزين eluted. انتظر حتى يدخل السائل العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  6. إضافة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع حجم eluted. انتظر حتى يدخل السائل العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  7. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وجمع جزء من 600 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. استخدم المركبات الكهربائية وعينات التحكم لإجراء مزيد من التحليلات أو تخزينها بين عشية وضحاها عند 4 oC.
  8. تخزين الأعمدة المستخدمة للاستخدام في المستقبل.
    1. غسل العمود مع 25 مل من 20٪ isopropanol وتجاهل حجم eluted. غسل العمود 3 مرات مع 2.5 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة المخزن المؤقت التخزين إزالة في الخطوة 1.1.1 وانتظر المخزن المؤقت لإدخال العمود. قم بتغطية العمود بالغطاء وتخزينه عند 4 oC حتى الاستخدام اللاحق.

4. EV القياس الكمي

  1. إعداد 1:1,000 تخفيف عينة NTA-PL-EV وعينة PL-EV الأولية كما هو موضح في الخطوتين التاليتين.
    1. إعداد 1 مل من 1:10 المخفف NTA-PL-EV و 1 مل من 1:10 المخفف الأولي PL-EV مع برنامج تلفزيوني تصفيتها من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
    2. إعداد 1 مل من تخفيف 1:100 من العينات المخففة السابقة مع برنامج تلفزيوني تصفيتها من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  2. حقن 1:1,000 المخفف NTA-PL-EV عينة أو عينة PL-EV الأولية باستخدام حقنة معقمة في مضخة NTA. اتبع إرشادات الشركة المصنعة وتوصياتها لتركيز الجسيمات وتحديد توزيع الحجم.
    ملاحظة: بما أن تركيز EV يعتمد على حجم بداية العينة، فقد يكون من الضروري قراءة المخففات المتوسطة وإجراء تعديلات للحصول على تحديد NTA الصحيح.

5. المركبات الكهربائية المستخدمة كعلاج لالتهاب الزراعة العضوية يحركها

  1. غسل الغضروف مرتين مع برنامج تلفزيوني والمكوس باستخدام لكمة خزعة قطرها 3 ملم في ظل ظروف معقمة.
    ملاحظة: تنفيذ الإجراء من الخطوات 5.1 إلى 5.6 في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
  2. وضع explants في لوحات ثقافة 96 جيدا مع DMEM-F12 المتوسطة تكملها مع 1٪ البنسلين-streptomycin في 37 oC، 5٪ CO2،والرطوبة 80٪.
    1. لإنشاء نموذج الزراعة العضوية يحركها الالتهاب، تكملة المتوسطة ثقافة الخلية مع 10 نانوغرام / مل أونكوستاتين M و 2 نانوغرام / مل عامل نخر الورم ألفا (TNFα).
  3. علاج explants مع 1 × 109 جزيئات / بئر من المركبات الكهربائية المسماة (PKH-PL-EV) أو التحكم في زراعة الخلايا المتوسطة تكملها oncostatin M و TNFα.
    ملاحظة: قياس حجم العينة التي تحتوي على 1 × 109 جزيئات / جيدا واستخدام نفس حجم التحكم.
  4. إزالة المتوسطة من لوحات ثقافة الخلية 96 جيدا التي تحتوي على explants الغضاريف. إضافة 200 ميكرولتر من الخلايا الثقافة المتوسطة الموصوفة في الخطوة 5.3 إلى كل بئر.
    ملاحظة: إذا كانت اللوحات المكونة من 96 بئرا على اتصال بمصل الأبقار الجنيني (FBS)، فاغسل كل بئر ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإزالة أي مركبات كهربائية من FBS.
  5. أوقف الفحص في المختبر في أوقات مختلفة: 0 و1 و2 و3 و4 و5 ساعة.
  6. غسل آبار ثقافة الخلية التي تحتوي على explants الغضاريف مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى الأنسجة لإصلاحه لمدة 3 ساعة في 4 oC.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التي تتضمن PFA في غطاء الدخان باتباع توصيات ورقة بيانات الأمان.
  8. إزالة PFA، إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وتخزين الأنسجة الثابتة في 4 درجة مئوية، ومعالجة العينات في غضون 48 ساعة.

6. إعداد المجهر والتصور

ملاحظة: يتكون هذا الإجراء النسيجي من الجفاف، وتضمين البارافين، وخطوات الإماهة. قد تقلل هذه الخطوات من تفلور الصبغة بشكل عام (وهو قيد مذكور في ورقة البيانات ل PKH26). لذلك ، قد تكون الإجراءات الأخرى ، مثل تقسيم المجمدة ، أكثر ملاءمة للتصور EV عن طريق المجهر confocal.

  1. تضمين الأنسجة الثابتة في كتل البارافين. قطع الأنسجة إلى 6 أجزاء ميكرومتر سميكة.
  2. إزالة الأنسجة من الأقسام.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات باستخدام xylene في غطاء محرك السيارة fume.
    1. تزج أقسام الأنسجة في xylene لمدة 30 دقيقة، 100٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، 96٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، 75٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة، وأخيرا في الماء المقطر لمدة 30 s.
  3. Permeabilize أقسام الأنسجة.
    1. إعداد 0.1٪ تريتون-0.1٪ محلول سيترات الصوديوم لبيرميابيليز الأنسجة. أضف قطرة 20 ميكرولتر إلى كل قسم من أقسام الأنسجة واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل كل قسم مرتين مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  4. على الشريحة المجهرية، إضافة قطرة من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) مع وسط تصاعد مائي للحفاظ على مضان. قم بتغطية الشريحة التي تحتوي على 3 أقسام نسيجية من الخطوة 6.3.1.
  5. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
  6. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، محمي من الضوء حتى الفحص المجهري البؤري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم عرض نظرة عامة تخطيطية ل EV وضع العلامات ومراقبة امتصاص في الشكل 1. يظهر تركيز الجسيمات وحجم EV الذي اكتشفه NTA في الجدول 1 أن تركيز EV ينخفض أثناء العملية بسبب خطوة التنقية التي أجريت مرتين بعد وضع العلامات مع العمود. ومع ذلك، فإن الكمية التي تم الحصول عليها هي في النطاق الأمثل لعدد الجسيمات لاستخدامها في العلاج. يتم استخدام هذا التركيز الجسيمات لحساب حجم PKH-PL-EV والتحكم التي تستخدم لعلاج النباتات الخارجية الغضاريف المفاصل.

بمجرد معالجة النب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يساعد التصوير EV على فهم خصائص EV، مثل آليات إطلاقها واستيعابها. يسمح تصويرهم بمراقبة التوزيع الحيوي وتوصيف خصائصهم الدوائية كمركبات دوائية. ومع ذلك، قد يكون التصوير EV وتتبع صعبة نظرا لأحجامها الصغيرة، على الرغم من أن العديد من أجهزة التصوير وتقنيات وضع العلامات قد وضعت لمساعدة الباحثين مراقبة المركبات الكهربائية تحت في المختبر وفي ظروف الجسم الحي 23،24،25.

هناك احتمالان عند تتبع ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

شكر وتقدير

وقد مول هذا البحث معهد سالود كارلوس الثالث، الوزير الاقتصادي، الذي شارك في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي التابع للصندوق الأوروبي للتنمية الاقتصادية (MS16/00124؛ CP16/00124); بواسطة PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS، construyendo SALUD، جينيراندو فالور (JUNIOR01/18)، بتمويل من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار؛ من قبل Direcció العام d'Investigació، كونسيليريا دي إنفيستيغاسيو، الحكم بالار (FPI/2046/2017)؛ من برنامج FOLIUM ما بعد الدكتوراه (FOLIUM 17/01) ضمن FUTURMed ، الممول بنسبة 50٪ من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار و 50٪ من قبل ESF ؛ ومن قبل لجنة دوسينسيا إي إنفيستياسيو دي لا فونداسيو بانك دي سانغ إي تيكسيتس دي ليه إيلي بالار (CDI21/03).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > مادة < / قوي > 1.5
مل أنبوب الطرد المركزيSPL علوم الحياةPLC60015
1 مل حقنة BD PlastipakBD303174
2-بروبانول (إيزوبروبانول)Panreac AppliChem1.310.901.211محضر بنسبة 20٪ مع
لوحة ثقافة المياه Milli-Q 96 بئرSPL علومالحياةPLC30096
الإيثانول المطلق فارمبورشارلاب ET0006005Pيستخدم لتحضير 96٪ و 75٪ من الإيثانول مع Milli-Q Water
Punch مع مكبس 3 ممScandidactMTP-33-32
مصل البقر   ؛ الألبومين (BSA)Sigma-AldrichA7030محضر بنسبة 5٪ مع
نباتات الغضروفIdISBa Biobank
أنبوب التركيز 15 مل Nanosep 100 kD أوميغابال MCP100C41
أنبوب التركيز 500 & micro ؛ L Nanosep 100 kD أوميغابال OD003C33
غطاء زجاجي 24 × 60 ممDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX mediumBiowestL0092
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
كتل أنسجة البارافين المدمجةIdISBa رسوم البنكالحيوي للخدمة
أعمدة Exo-spin mini-HDأنظمة توجيه الخليةEX05
Feather S35 Microtome BladeFeather43037
Filtropur S 0.2 & micro ؛ مرشح حقنة mSarstedt83.1826.001
Fluoroshield مع DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatin M HumanSigma-AldrichO9635-10UGتحضير محلول مخزون للتركيز النهائي 0.1 & micro ؛ ز /& مايكرو ؛ L diluten في PBS-0.1٪ BSA
ParaformaldehydeSigma-Aldrich8.18715.1000محضرة بنسبة 4٪ مع PBS ومخزنة عند 4 درجات ؛ C
Penicillin-Streptomycin Solution 100xBiowestL0022
PKH26 مجموعة ربط الخلايا الفلورية الحمراء لوضع العلامات على غشاء الخلية العامةSigma-AldrichMINI26PKH26 و Dliuent C المضمنة
سترات الصوديوم ثنائي هيدراتScharlabSO019911000
Superfrost Plus Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
TNF& ألفا.R & أنظمة D210-TA-005إعداد محلول مخزون بتركيز نهائي قدره 0.01 وميكرو ؛ ز /& مايكرو ؛ L مخفف في PBS-0.1٪ BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787يستخدم لتحضير محلول سترات الصوديوم 0.1٪ تريتون-0.1٪ مع ماء Milli-Q
XyleneScharlabXI0050005P<
strong>Equipment< / قوي >
جهاز طرد مركزي 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 الدوار
NanoSight NS300جهاز MalvernNS300مع ليزر مدمج في &lambda ؛ = 532 نانومتر والكاميرا sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual MicrotomeThermo Scientific & trade ؛A78100101
المجهر متحد البؤر TCS-SPELeica Microsystems5200000271
Biopsy PBS

المراجع

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029(2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

وسم الحويصلات خارج الخلويةهجرة الحويصلات خارج الخلويةامتصاص الحويصلات خارج الخلويةالمجهر البؤريالحويصلات خارج الخلوية المشتقة من نضحة الصفائح الدمويةتتبع الجسيمات النانويةنموذج الفصال العظمي في المختبرامتصاص الخلايا الغضروفية
وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.