يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل تحويل عامل النمو ß منتجات الانقسام الأسرة تفرز في Blastocoele من الأجنة Xenopus laevis

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62782

⸱

يوليو 21, 2021

 , 
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

عند تحويل عامل النمو ß البروتينات السلائف الأسرة يتم التعبير عنها خارج الرحم في الأجنة Laevis Xenopus، فإنها تغمغم، والحصول على مشقوق وتفرز في blastocoele، الذي يبدأ في وقت متأخر blastula إلى مرحلة gastrula في وقت مبكر. نحن نصف طريقة لاستنشق منتجات الانقسام من تجويف الانفجار لتحليل المناعة.

الملخص

الذراعين من عامل النمو تحويل ß (Tgfß) superfamily، ممثلة Tgfß / العقدة أو العظام البروتين المورفوجيني (Bmp) ليغاندس، على التوالي، تلعب أدوارا أساسية في التنمية الجنينية وهوس العظام الكبار. يتم إجراء أعضاء الأسرة Tgfß والسلائف غير نشطة أن تتناقص وأضعاف داخل الشبكية endoplasmic. يتم شق السلائف في وقت لاحق إلى شظايا ليغاند وبروتدومين. على الرغم من أن فقط ليغاند ثنائية يمكن إشراك مستقبلات Tgfß وتفعيل الإشارات المصب، وهناك اعتراف متزايد بأن moiety prodomain يساهم في النشاط ليغاند. توضح هذه المقالة بروتوكول يمكن استخدامه لتحديد منتجات الانقسام التي تم إنشاؤها أثناء تنشيط بروتينات السلائف Tgfß. يتم أولا حقن سلائف ترميز RNA Tgfß في أجنة X. laevis. في اليوم التالي ، يتم جمع منتجات الانقسام من blastocoele من أجنة مرحلة gastrula وتحليلها على البقع الغربية. يمكن إكمال هذا البروتوكول بسرعة نسبيا، لا يتطلب الكواشف باهظة الثمن ويوفر مصدرا للمنتجات الانقسام Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية.

المقدمة

يتم تصنيع أعضاء عامل النمو التحويلي ß (Tgfß) بشكل فائق كبروتينات سلائف غير نشطة وخافتة. ثم يتم شق السلائف من قبل أعضاء عائلة تحويل البربروتين (PC) ، إما داخل المسار الافرازي أو خارج الخلايا. وهذا يخلق نشطة، disulfide المستعبدين ليغند ديمر واثنين من شظايا prodomain1. على الرغم من أنه كان معروفا لأكثر من 30 عاما أن مطلوب من السلائف الأسرة Tgfß لتوليد ليغاند نشط2, فهم كيفية prodomains المساهمة في وظيفة ليغاند غير مكتملة.

على الرغم من أن فهم عملية التنشيط البروتيوليكي لأفراد عائلة Tgfß لا يزال غير مكتمل ، إلا أن هناك اهتماما متزايدا بفهم أي عزر توافق PC (ق) مشقوق في الجسم الحي، وما إذا كان الانقسام يحدث في مقصورة فرعية أو خارج الخلية محددة ، وما إذا كان المجال الأساسي لا يزال مرتبطا بشكل متناقض أو غير متناقض مع الليغندالمشقوق 3. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن prodomain ليس فقط أدلة ليغاند للطي قبل الانقسام4,5, ولكن يمكن أيضا التأثير على استقرار عامل النمو ومجموعة من العمل6,7,8,9, محرك تشكيل homodimers أو heterodimers10, مرساة ليغاند في مصفوفة خارج الخلية للحفاظ على الكمون ليغاند11, وفي بعض الحالات, وظيفة باعتبارها ليغاند في حد ذاتها لتنشيط heterologous إشارة12. وترتبط الطفرات نقطة Heterozygous داخل نطاق العديد من أفراد الأسرة Tgfß مع العين والعظام والكلى والهيكل العظمي أو غيرها من العيوب في البشر3. تسلط هذه النتائج الضوء على الدور الحاسم للبروتودمين في توليد والحفاظ على ليغاند نشط وتشدد على أهمية تحديد وفك شفرة دور منتجات الانقسام التي تم تطويرها أثناء النضج البروتيوليكي للسلائف العائلية Tgfß.

هنا نصف بروتوكول مفصل لمنتجات شق القرصنة المتولدة أثناء نضوج السلائف الأسرة Tgfß من blastocoele من الأجنة X. laevis ومن ثم تحليلها على الخلايا المناعية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان واحد أو أكثر من عزر توافق الآراء PC (ق) في بروتين السلائف هي مشقوق في الجسم الحي10،13، وتحديد PC الذاتية (ق) التي تلتصق كل عزر13،1 14، قارن في تشكيل الجسم الحي من المثليات الأسرة Tgfß مقابل heterodimers10 أو تحليل ما إذا كانت الطفرات نقطة المرتبطة بالأمراض البشرية في السلائف Tgfß تؤثر على قدرتها على تشكيل ليغاندس ثنائية الأبعاد وظيفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الإجراءات المذكورة معتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في جامعة يوتا. يتم إيواء الضفادع في منشأة معتمدة من IACUC. يتم قتل الضفادع الذكور عن طريق الانغماس في tricaine التالية عن طريق قص البطين من القلب. يتم إيواء الضفادع الإناث في المختبر لمدة أقصاها 24 ساعة بعد التعريفي الهرموني للتفريخ للسماح بجمع البيض ثم إعادتها إلى مرفق الرعاية.

1. مجموعة من X. laevis الخصيتين

  1. تخدير ذكر ناضج جنسيا في 0.2٪ Tricaine (الجدول 1) لمدة 30-40 دقيقة حتى لا يستجيب الحيوان لقرصة مخلب.
  2. استخدام ملقط حاد لسحب الجلد بعيدا عن جدار الجسم. إجراء شق أفقي في الجلد عبر أسفل البطن باستخدام مقص الجراحية. إجراء شق مواز في جدار الجسم الأساسي، ومن ثم شق ثالث عمودي من خلال جدار الجسم حتى من خلال القفص الصدري.
    1. أضعاف مرة أخرى اللوحات الناتجة، وتحديد موقع البطين من القلب ومقطع قاعدة لإكسانجوينات وضمان الموت.
  3. سحب الأجسام الدهون الصفراء من البطن مع ملقط حاد وتحديد الخصيتين على كل جانب، الكامنة وراء قاعدة الأجسام الدهون. إزالة كل الخصية عن طريق قص بعيدا عن الأجسام الدهنية وأي الأحشاء المرفقة باستخدام مقص الجراحية.
  4. نقل الخصيتين إلى طبق بيتري يحتوي على حل بارث المعدل (MBS)(الجدول 1). شطف وإزالة أي الأوعية الدموية الملتصقة أو الأحشاء المرفقة.
    1. نقل testis واحد إلى طبق بيتري 35 ملم تحتوي على testis العازلة (الجدول 1) للاستخدام الفوري وتخزين الآخر في أنبوب مخروطي 10 مل مليئة مخزن testis للاستخدام في وقت لاحق. يجب تخزين الخصية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية عند عدم استخدامها وستظل قابلة للتطبيق لمدة أسبوعين على الأقل.
      ملاحظة: يمكن العثور على صور عزل الخصيتين في المرجع 15.

2. جمع وإخصاب البيض X. laevis

ملاحظة: يجب التعامل مع الضفادع بقفازات الفينيل أو غسل اليدين قبل وبعد التعامل مع الضفادع. قفازات اللاتكس والمستحضرات وبقايا المنظفات على أيدي الإنسان سوف تضر الجلد الهش للضفادع.

  1. في المساء قبل التفريخ، حقن 0.3 مل (1200 وحدة) من gonadotropin chorionic الإنسان (الجدول 1) في الكيس الليمفاوي الظهري من اثنين أو ثلاثة ناضجة X. laevis الإناث باستخدام حقنة 1 مل مزودة إبرة 26 G. استخدم إبرة جديدة لكل حقنة.
  2. بعد الحقن، ضع الإناث في حاوية مغلقة (وليس محكم الهواء) في حاضنة بيولوجية 18 درجة مئوية. التفريخ يبدأ عموما 14-16 ساعة في وقت لاحق.
    ملاحظة: الأدراج البلاستيكية أو الحاويات البلاستيكية مع ثقوب الهواء مقطعة إلى غطاء العمل بشكل جيد لعقد الإناث بين عشية وضحاها. تأكد من أن الغطاء يعمل بحزم لمنع الضفادع من الهروب و المجفف في الحاضنة.
  3. عقد الأنثى أكثر من 100 ملم طبق بيتري التي تحتوي على MBS 1x وتطبيق ضغط لطيف على بطن الضفدع لطرد البيض في الطبق.
  4. قطع قطعة صغيرة من الخصية (~ 1/5) باستخدام شفرة حلاقة ونقله إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على ~ 500 ميكرولتر من 1x MBS. سحق مع البيليت أو الأنسجة المتجانس. تخزين تعليق الحيوانات المنوية الناتجة على الجليد أو في 4 درجة مئوية للإخصاب اللاحقة في نفس اليوم.
  5. إمالة طبق بيتري 100 ملم لتصب قبالة أكبر قدر ممكن من MBS 1x، وإزالة ما تبقى باستخدام ماصة نقل البلاستيك. تطبيق ما يقرب من 100 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية، إضافة حوالي 1 مل من MBS 0.1x ودوامة لخلط.
    1. بعد 5 دقائق، غمر الطبق بمياه الصنبور المكلورة أو 0.1x MBS واتركه لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن إزالة الكلور من المياه باستخدام فلتر أو مياه الصنبور البلدية يمكن تركها واقفة دون الكشف عن ما لا يقل عن 24 ساعة للسماح للكلور بتبدد في المناطق التي يضاف فيها الكلور التقليدي إلى الماء. في المناطق التي يضاف فيها الكلورامين لتطهير مياه الشرب ، يجب بدلا من ذلك معالجة المياه بمكيف متاح تجاريا يمكنه تحطيم الكلورامين.
      ملاحظة: يتم جمع البيض في محلول ملح عال (1x MBS) لمنع تكوين معطف هلام، والذي من شأنه أن يوفر حاجزا أمام الإخصاب. بعد الإخصاب، والمحلول الملح المنخفض (الماء المكلور أو 0.1x MBS) يسمح لتشكيل معطف هلام والبيض سوف تلتزم بعضها البعض والطبق. البيض التي تم تخصيبها سوف تدور بحيث القطب الحيوان مصطبغة يواجه صعودا في غضون 30 دقيقة. إذا لم يحدث هذا، والبيض تبدو صحية تحت المجهر، الحيوانات المنوية البقاء هو المشتبه به، وأنه قد يكون من الضروري حصاد الخصيتين جديدة.
  6. صب قبالة الحل الذي يغطي البيض وملء طبق بيتري مع محلول السيستين الطازجة 2٪(الجدول 1). دوامة الحل في الطبق لمدة 3-5 دقائق حتى يذوب معطف هلام والبيض لم تعد التمسك بعضها البعض أو الطبق.
    1. إمالة الطبق وتصب بعناية قبالة محلول السيستين، أو إزالة مع ماصة بلاستيكية. استبدال مع 1x مياه بركة ديبور(الجدول 1). دوامة لشطف وdecant.
    2. كرر غسل واحد مع حل ديبور، واحد مع 0.1x MBS، وإعادة ملء الطبق مع 0.1x MBS. بعد إزالة معطف هلام، والبيض تصبح أكثر هشاشة ويجب أن لا تتعرض لواجهة الهواء السائل.
  7. نقل البويضات المخصبة إلى حاضنة بيولوجية 16 درجة مئوية أو تركها على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة. إذا تركت في درجة حرارة الغرفة، فإن الانقسام الأول يحدث 1-1.5 ساعة بعد الإخصاب، وسوف تحدث الانشقاقات اللاحقة كل 30 دقيقة تقريبا. وعلى النقيض من ذلك، إذا تم احتضان الأجنة عند 15-16 درجة مئوية، فإن الانشقاقات ستحدث كل ساعة تقريبا وسيكون من الممكن حقن عدد أكبر من الأجنة من تفريخ معين.

3. الميكرويكشن من الأجنة X. laevis

  1. تسخين وسحب الشعيرات الدموية الزجاج إلى نقطة غرامة باستخدام سحب micropipette مع الإعدادات التالية: سحب خطوتين; الحرارة 1: 67.4 درجة مئوية؛ الحرارة 2: 62 °C.
    ملاحظة: هذه الإعدادات محددة لمسحب micropipette والشعيرات الدموية الزجاجية المستخدمة هنا(جدول المواد).
  2. تحت المجهر تشريح، مقطع قبالة غيض من إبرة سحبت على مقربة من النهاية باستخدام دومون # 5 ملقط. يجب أن تكون الإبرة حادة ولكنها ليست رقيقة لدرجة أن الطرف ينحني عندما يتصل بالجنين. ويبين الشكل 1 مثالا لإبرة سحبت بشكل مناسب لم يتم قصها للاقتصاص الدقيق (A) وإبرة تم قصها (B).
  3. أدخل الإبرة في حامل إبرة متصل بالمسحث الدقيق. إرفاق حامل الإبرة إلى ميكرومانيبولاتور. مكان 2-4 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الاصطناعية توج ترميز البروتين السلائف Tgfß ليتم تحليلها على قطعة صغيرة من البارافيلم تحت المجهر تشريح.
    1. باستخدام micromanipulator، خفض الإبرة في قطرة واستخدام وظيفة ملء على microinjector لاسبر الحمض النووي الريبي في الإبرة. تأكد من إبقاء الإبرة تحت سطح قطرة، ومشاهدة التقدم تحت المجهر لتجنب تسرب الهواء إلى الإبرة.
      ملاحظة: إذا لم تتوفر الأجسام المضادة التي تتعرف على المجال prodomain و/أو ligand من السلائف Tgfß لتحليلها، تسلسل ترميز علامة epitope (على سبيل المثال، V5، myc، العلم) يمكن إدراجها في الإطار في cDNA التي سيتم استخدامها كقالب للنسخ الحمض النووي الريبي. وينبغي مقارنة النشاط الحيوي في الجسم الحي من البروتين الموسومة مع أن من البروتين غير الموسومة لضمان أن epitope لا تتداخل مع للطي السليم، والانقسام أو النشاط.
  4. إخراج قطرة من محلول الحمض النووي الريبي في الهواء وقياس حجم قطرة باستخدام ميكرومتر محمولة على مرحلة الحقن أو في العدسة من المجهر. ضبط حجم الإسقاط إلى ما يقرب من 10 nL باستخدام الوقت والضوابط الضغط على microinjector.
    ملاحظة: تركيزات الحمض النووي الريبي في نطاق 5-20 نانوغرام /ميكرولتر مناسبة لتقديم 50-200 pg من الحمض النووي الريبي في كل جنين. هذا المبلغ من الحمض النووي الريبي عموما كافية للكشف عن منتجات الانقسام في أسبيراتس من 10-20 الأجنة. فمن الأفضل أن تهدف إلى أدنى جرعة من الحمض النووي الريبي الذي يعطي إشارة يمكن الكشف عنها على اللوت المناعي. كميات أعلى من الحمض النووي الريبي يمكن أن يسبب عيوب غاستريبشن، والتي تتداخل مع التوسع في blastocoele.
  5. نقل الأجنة إلى طبق حقن أو صينية تحتوي على 5٪ Ficoll في 0.1x MBS (الجدول 1) عندما تصل إلى مرحلة الخلية 2-4. طبق بيتري 35 ملم مزودة قطعة من شبكة النايلون في الجزء السفلي يمكن أن تكون بمثابة طبق حقن غير مكلفة من شأنها أن تبقي الأجنة مشلولة. أدخل الإبرة بالقرب من القطب الحيواني وحقن 10 nL من الحمض النووي الريبي في خلية واحدة من كل جنين.
    ملاحظة: يمكن حقن الأجنة بسهولة في أي وقت بين مرحلتي الخلية الواحدة والسادسة عشرة. حقن الجنين بعد أن يكون قد شق يضمن أن البويضة كانت مخصبة وأن الجنين بصحة جيدة. الموقع الدقيق للحقن ليست ضرورية. ويمكن الاطلاع على وصف أكثر تفصيلا للتفريخ والثقافة والتحنيم الدقيق للرنانات الريبية في أجنة X. laevis في المرجع 15.
  6. نقل الأجنة المحقونة إلى طبق بيتري 35 ملم مليئة 5٪ Ficoll في MBS 0.1x (الجدول 1). ضع الأطباق الصغيرة داخل طبق بيتري مقاس 150 ملم وغطيها بغطاء فضفاض لمنع الوسائط الثقافية من التبخر. زراعة الأجنة بين عشية وضحاها في 15-16 درجة مئوية.
    ملاحظة: يساعد زراعة الأجنة في Ficoll على شفاء موقع الحقن. إذا تم استخدام الإبر الدقيقة، وزراعة في 2-3٪ فيكول كافية، في حين يفضل 5٪ فيكول إذا لوحظ ضرر واضح. الحفاظ على الأجنة في محلول Ficoll لمدة 1-2 ساعة بعد الحقن يكفي للمساعدة في الشفاء ، ولكن الحضانة بين عشية وضحاها لا تضر الجنين طالما تم تغيير الحل قبل بداية الاختراق.

4. Blastocoele استخراج وتحليل منتجات Tgfß الانقسام

  1. في صباح اليوم التالي بعد الحقن، قم بإزالة محلول Ficoll وإزالة أي أجنة ميتة أو تحتضر. شطف الأجنة مرة أو مرتين مع 0.1x MBS وزراعة الأجنة في 0.1x MBS على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن أيضا إعادة الأجنة إلى الحاضنة البيولوجية التي 16 درجة مئوية لإبطاء التطور.
  2. الحرارة وسحب الشعيرات الدموية الزجاج إلى نقطة غرامة باستخدام سحب micropipette مع الإعدادات التالية: سحب خطوتين; الحرارة 1: 67.4 درجة مئوية؛ الحرارة 2: 62 °C.
    ملاحظة: هذه الإعدادات محددة للمسحب والشعيرات الدموية الزجاجية المستخدمة هنا (جدول المواد).
  3. تحت المجهر تشريح، مقطع قبالة غيض من إبرة سحبت باستخدام ملقط. لمنع انسداد, فتح إبرة تستخدم لطموح blastocoele ينبغي أن تكون أكبر من ذلك في إبرة تستخدم لmicroinjection. مثال على إبرة جيدة سحبت وقص لاستخدامها لطموح blastocoele يظهر في الشكل 1C. أدخل إبرة الشفط في حامل الإبرة المتصلة بالمزلق الدقيق واربط حامل الإبرة بمثقف دقيق.
    ملاحظة: يتم تحديد قطر الإبرة الأمثل تجريبيا عن طريق التجربة والخطأ. الإبر مع قطر كبير ملء بسرعة كبيرة جدا وتجعل من المرجح أن الحطام الخلوي سيدخل الإبرة. وعلى النقيض من ذلك، من المرجح أن تصبح الإبر ذات القطر الصغير جدا مسدودة. بمجرد إنشاء إبرة مناسبة ، من المفيد توليد إبر متعددة مقطوعة في نفس الموضع.
  4. ضع الأجنة في صينية حقن أو طبق مملوء ب 0.1x MBS عندما تصل إلى مرحلة مبكرة إلى مرحلة منتصف المعدة (المرحلة 10-11).
  5. أدخل الإبرة أسفل سطح الجنين بالقرب من القطب الحيواني. اضغط على زر التعبئة على الحقن المجهري أثناء النظر من خلال المجهر تشريح لإبقاء العين على الإبرة والجنين. على مدى بضع ثوان، فإن مستوى السائل واضحة ترتفع في الإبرة والجنين سوف تنهار وتصبح مقعرة.
    1. إذا دخلت المادة البيضاء الملبدة بالغيوم الإبرة، اترك زر التعبئة ونبض زر الحقن مرة واحدة أو أكثر لإخراج أي مادة غائمة، والتي تتكون من الحطام الخلوي الذي من المرجح أن يحتوي على بروتياس.
      ملاحظة: إذا انهار blastocoele ودخل حطام الخلية الإبرة بمجرد الضغط على زر التعبئة، فهذا يشير إلى أن الفتحة في الإبرة كبيرة جدا. إذا فشل blastocoele في الانهيار ولكن المادة البيضاء تدخل الإبرة على الفور ، فهذا يدل على أن الإبرة تم إدخالها بعمق كبير جدا وتلمس أرضية blastocoele. أخرج المادة البيضاء، و انتقل إلى الجنين التالي. يمكن التحكم في معدل الطموح بعناية أكبر عن طريق نبض زر التعبئة بدلا من الضغط عليه باستمرار. وهذا مهم بشكل خاص إذا كان الفتح في الإبرة أكبر من الأمثل.
  6. كرر الخطوة 4.5 حتى يستنشق السائل من الكيسة الناسفة من 10-20 جنينا.
    ملاحظة: عموما، سائل البلوكويلي يستنشق من 10-20 أجنة كافية للكشف عن منتجات الانقسام على اللوتات المناعية. ومع ذلك، يمكن أن يختلف هذا اعتمادا على جودة الأجسام المضادة ويجب أن يتم تحديده تجريبيا.
  7. ضع قطعة من البارافين على صينية الحقن وماصة 1 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز عليها. غمر الإبرة تحت قطرة الماء واضغط على زر الحقن لتبديل سائل الانفجار في الماء.
    1. بدلا من ذلك، قم بإخراج السائل مباشرة إلى البارافيلم، ولكن في هذه الحالة، قم بنبض زر الحقن بدلا من الضغط عليه. هذا يطرد السائل تحت ضغط أقل ، مما يمنعه من التسطيح على البارافيلم ، مما يجعل من الصعب رسمه في ماصة.
  8. نقل السائل blastocoele في أنبوب الطرد المركزي الدقيق العقيمة على الجليد. نتوقع أن حصاد ما يقرب من 0.3-0.5 ميكرولتر من سائل الانفجار لكل جنين. أضف ماء خالي من النيوكليز لضبط الحجم النهائي إلى 30 ميكرولتر.
  9. نقل الأجنة المنضبة السائل blastocoele إلى أنبوب منفصل على الجليد. إزالة الزائدة 0.1x MBS وإضافة 200 ميكرولتر من المبردة (4 درجة مئوية) الجنين lysate العازلة (10 ميكرولتر لكل جنين) (الجدول 1). ماصة الأجنة صعودا وهبوطا 10-20 مرة باستخدام micropipette حتى يتم تجانسها تماما ولا كتل لا تزال قائمة.
  10. طرد مركزي الأجنة المتجانسة في جهاز طرد مركزي مبرد على 10,000 x g لمدة 10 دقائق. إزالة 160 ميكرولتر من supernatant باستخدام ماصة P200 ونقلها إلى أنبوب جديد على الجليد، مع الحرص على تجنب البروتينات صفار أبيض وغيرها من الحطام الخلوي في النصف السفلي من الأنبوب.
    1. كرر الطرد الدقيق مرة واحدة ونقل 128 ميكرولتر من supernatant واضحة إلى أنبوب جديد على الجليد. عند هذه النقطة، يمكن تخزين lysates الأجنة مسح والسوائل blastocoele في -80 درجة مئوية لطالما رغبت في ذلك.
      ملاحظة: مع استثناءات قليلة، لا تفرز البروتينات السلائف Tgfß في blastocoele وسيتم الكشف عنها فقط في lysates الجنين المنضب. وعلى النقيض من ذلك، ينظر إلى منتجات الانقسام الأسرة Tgfß في المقام الأول في السائل blastocoele. من المفيد حصاد وتحليل كل من تحلل الأجنة وسوائل البروستوكويل لمعظم الأغراض. وهذا يوفر، كحد أدنى، رقابة إيجابية لضمان ترجمة السلائف بصورة قوية ومستقرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح للمرء أن يقارن النسب النسبية للمنتجات الانقسام إلى السلائف بين نوع البرية المختلفة أو البروتينات المتحولة، لتحديد الطفرات التي تمكن السلائف سليمة أن تفرز في السائل blastocoele (على سبيل المثال، الطفرات داخل عزر توافق PC التي تسمح للطي السليم والإفراز دون انشقاق، وفي هذه الحالة يتم الكشف عن السلائف سليمة في كل من الجنين والسائل blastocoele) أو الطفرات التي تولد مطوية بشكل خاطئ، البروتينات غير المشقوقة (وفي هذه الحالة سيتم الكشف عن السلائف في ليسات الجنين ، ولكن منتجات الانقسام ستكون غائبة في سائل الانفجار).
  11. Deglycosylate البروتينات الموجودة في سائل الانفجار مع PNGase F في هذه المرحلة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة ليست هناك حاجة إلى deglycosylate البروتينات السلائف الموجودة في ليسات الجنين لأن هذه تمثل reticulum endoplasmic (ER)--أشكال المقيمين من السلائف التي تفتقر إلى oligosaccharides N المرتبطة المعقدة إزالتها من قبل PNGase F. وعلى النقيض من ذلك، انتقلت منتجات الانقسام الموجودة في سائل الانفجار من خلال شبكة ترانس غولجي (TGN) حيث يتم تعديل الكربوهيدرات بشكل أكبر ويمكن إزالتها الآن عن طريق PNGase F. بعد إزالة التخثر ، تهاجر منتجات الانقسام كفرقة مكثفة أكثر إحكاما على المواد الهلامية SDS ، والتي يمكن أن تساعد في تصور منتجات الانقسام وكميةها وتحديدها بدقة. هذا ليس مطلوبا بدقة ، ولكنه يمكن أن يكون مفيدا ، على سبيل المثال ، إذا كنت تحاول التمييز بين المتجانسات والهيدروديمرز استنادا إلى أنماط الهجرة أو إذا كان منتج الانقسام يحتوي على كربوهيدرات غير متجانسة تسبب له الهجرة كفرقة ضبابية واسعة.
  12. إضافة 5 ميكرولتر من تقليل 4x عينة العازلة (الجدول 1) إلى 15 ميكرولتر من سائل الانفجار و 15 ميكرولتر من lysate الجنين توضيح. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة عينة 4x عدم الحد (الجدول 1) إلى المتبقية 15 ميكرولتر من سائل blastocoele. الحرارة إلى 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ومكان على الجليد.
    ملاحظة: تحليل البروتينات في ظل ظروف غير الحد ضروري لتحليل تشكيل المشقوقات المشقوقة أو الليجاندات الهتيريوديميرية ولكن ليست هناك حاجة إلا إذا كان تحليل مواقع الانقسام أو مستويات البروتينات المشقوقة. مع استثناءات قليلة، يتم إفراز شظايا النطاقات كمونومرات. وعلاوة على ذلك، يتم الكشف عن البروتينات السلائف الموجودة في lysate الجنين في المقام الأول، مونومرات المقيمين ER. وبالتالي، ليست هناك حاجة لتحليل هذه المنتجات في ظل ظروف غير الحد.
  13. حل البروتينات السلائف ومنتجات الانقسام عن طريق الكهربائي على 15٪ SDS / المواد الهلامية البولي أكريلاميد.
  14. نقل البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF باستخدام نقل الكهربائية.
  15. احتضان الأغشية ذات الأجسام المضادة المناسبة التي تتعرف على النطاق الخارجي والمجال الليجاندي (أو علامات epitope المدرجة في تلك المجالات) ، وغسل واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة. تصور البروتينات مع chemiluminescence أو التصوير الفلوري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كان هدف التجربة الموصوف أدناه هو تحديد ما إذا كان Bmp4 و Bmp7 يشكلان heterodimers (dimers يتكون من Bmp4 ligand واحد و Bmp7 ligand) ، homodimers (يتكون من Bmp4 أو اثنين من Bmp7 ligands) ، أو مزيج من كل عندما يتم التعبير عنها في X. laevis. يتم استخراج البيانات المعروضة في الشكل 2 من دراسة نشرت سابقا10. الشكل 2A هو مخططي يبين منتجات الانقسام الناتجة عن النضج البروتيوليكي للسلائف Bmp4 أو Bmp7 المتجانسة أو السلائف ثنائية الديموريال ثن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المزايا الرئيسية للبروتوكول الموصوف هنا هي أنه يمكن إكماله بسرعة نسبية ، ولا يتطلب كاشفات باهظة الثمن ويوفر مصدرا لمنتجات شق Tgfß المركزة في ظل ظروف فسيولوجية. ميزة أخرى هي أنه يسمح للمرء بتحليل البروتينات الموسومة epitope وبالتالي التحايل على نقص الأجسام المضادة المتاحة تجاريا التي تعترف معظم prodomain الأسرة Tgfß. على الرغم من أنه من الممكن أيضا لتحليل انشقاق البروتينات السلائف Tgfß الموسومة epitope في خلايا الثدييات المستزرعة المصابة، وهناك العديد من المزايا لاستخدام X. laevis. في وقت مبكر X. laevis الأجن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

نشكر ماري سانشيز على العناية الممتازة بالحيوانات. ويدعم أبحاث المؤلفين المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH/NICHD) منح R01HD067473-08 وR21 HD102668-01 والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK/NIH) منحة R01DK128068-01.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ß-mercaptoethanolفيشرAC125470100
بروموفينول بلوفيشرB392-5
كلوريد الكالسيومفيشرC79-500
نترات الكالسيومفيشرC109-500
مدقة بيليه يمكن التخلص منها / طاحونة الأنسجةفيشر12-141-364
ملقطدومون # 5أدوات العلوم الدقيقة11251-10
مصل الأبقار الجنينيأتلانتا البيولوجيةS11150H
Ficoll 400Sigma AldrichF9378-500G
زجاج شعري ، 1 × 90 ممNarshigeG-1
GlycerolFisherG33-4
HEPESFisherBP310-500
المشيمية البشرية حقنة حقن موجهة الغدد التناسليةSigma AldrichCG10-10VL
، 1 ملفيشر8881501368
L-CysteineSigma AldrichC7352
كبريتات المغنيسيومفيشرM63-500
إبرة ، 26 جمفيشر305111
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140148
Picoliter MicroinjectorWarner InstrumentsPLI-100A
مجتذب الماصةNarashigePC-100
كلوريد البوتاسيومفيشرP217-500
PVDF غشاءسيجما ألدريتشIPVH00010
بيكربونات الصوديومفيشرS233-500
كلوريد الصوديومفيشرS271-10
كبريتات الصوديوم دوديسيلفيشرBP166-500
هيدروكسيد الصوديومفيشرS318-500
Tricaine-SPentairTRS5
TrisFisherBP152-5

المراجع

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052(2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332(2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L. Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

انقسام TGF-Betaسائل التجويف الأروميأجنة Xenopusثنائيات BMP المغايرةالحقن المجهري للبروتينSDS-PAGEلطخة ويسترنمستخلص الأجنةالانقسام البروتينيجزء النطاق الأولي
تحليل تحويل عامل النمو ß منتجات الانقسام الأسرة تفرز في Blastocoele من الأجنة Xenopus laevis
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.