تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي

وقد أتاحت التطورات التقنية في أجهزة وبرامج مقاييس التدفق الخلوي تحديد العديد من مجموعات الخلايا المتميزة في وقت ^{واحد1,2,3,4}. على سبيل المثال، أدى استخدام مقياس التدفق الخلوي في أبحاث الخلايا الدموية إلى فهم أفضل بكثير للجهاز ^{المناعي2} والتسلسل الهرمي الخلوي للنظام الدموي⁽⁵)، فضلا عن التمييز التشخيصي للعديد من أنواع سرطان الدم ^{المختلفة6,7,8}. على الرغم من أن معظم خلايا البلغم هي من أصل دموي9,10,11, لم يتم تطبيق قياس التدفق الخلوي على نطاق واسع لتحليل البلغم لأغراض التشخيص. ومع ذلك، تشير العديد من الدراسات إلى أن تقييم مجموعات الخلايا المناعية في البلغم (أهم مجموعة فرعية من الخلايا) قد يكون عونا كبيرا في تشخيص و/أو مراقبة أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)12,13,14,15. وعلاوة على ذلك، فإن وجود علامات خاصة بالظهارية التي يمكن استخدامها في قياس التدفق الخلوي يسمح باستجواب المجموعة الفرعية التالية الأكثر أهمية من الخلايا في البلغم، خلايا ظهارية الرئة.

بالإضافة إلى القدرة على تحليل العديد من مجموعات الخلايا المتميزة من أصول أنسجة مختلفة ، يمكن لقياس التدفق أن يقيم أعدادا كبيرة من الخلايا في فترة قصيرة نسبيا. وبالمقارنة، فإن أنواع التحليلات المستندة إلى الشرائح والسيكلوتية كثيرا ما تتطلب موظفين و/أو معدات عالية التخصص. يمكن أن تكون هذه التحليلات كثيفة العمالة ، مما يؤدي إلى تحليل نسبة فقط من عينة ^{البلغم16}.

تحد ثلاث قضايا حرجة من الاستخدام الواسع النطاق للسبيتوم في قياس التدفق الخلوي. تتعلق المشكلة الأولى بمجموعة البلغم. يتم جمع البلغم من خلال سعال النفخ الذي يطرد المخاط من الرئتين إلى تجويف الفم ، ويبصق لاحقا في كوب جمع. منذ المخاط يسافر من خلال تجويف الفم، وهناك فرصة كبيرة للتلوث SEC. هذا التلوث يعقد تحليل العينة ، ولكن يتم تصحيح المشكلة بسهولة على منصة قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في هذه الدراسة.

ليس كل شخص يمكن أن تنتج البلغم تلقائيا; لذلك ، تم تطوير العديد من الأجهزة للمساعدة في جمع البلغم بطريقة غير ^{الغازية17}. البخاخات هو واحد من هذه الأجهزة، وقد ثبت لإنتاج عينات البلغم موثوق بها18,19,20. على الرغم من أن البخاخات هي وسيلة فعالة جدا لجمع البلغم غير الغازية ، إلا أن استخدامه لا يزال يتطلب إعدادا في منشأة طبية مع موظفين ^{متخصصين21}. في المقابل، يمكن استخدام الأجهزة المحمولة مثل الناي الرئة22,23,24 و acapella16,25 في المنزل لأنها سهلة الاستخدام للغاية. هذه الأجهزة مساعدة على حد سواء آمنة وفعالة من حيث التكلفة.

بالنسبة لنا، أعطى أكابيلا نتائج أفضل باستمرار من الناي ^الرئة16، وبالتالي، تم اختيار جهاز أكابيلا لمجموعات البلغم. تم تحديد عينة جمع لمدة 3 أيام لأن الغرض الأساسي لاستخدام البلغم هو تطوير اختبار الكشف عن سرطان ^الرئة16. وقد تبين أن عينة لمدة 3 أيام يزيد من احتمال الكشف عن سرطان الرئة مقارنة مع عينة 1-أو 2-يوم26,27,28. ومع ذلك، قد تكون أساليب أخرى لجمع البلغم الأفضل لأغراض مختلفة. إذا تم استخدام طريقة مختلفة لجمع البلغم من تلك الموصوفة هنا ، فمن المستحسن أن تثن بعناية كل الأجسام المضادة أو الصبغة المستخدمة لتحليل تدفق القياسات الخلوية ؛ تتوفر بيانات قليلة جدا حول كيفية تأثير طرق جمع البلغم المختلفة على البروتينات المستهدفة لقياس التدفق الخلوي.

القضية الثانية التي تقلل من الحماس لاستخدام البلغم للتشخيص ، تتعلق في المقام الأول بتدفق قياس الخلايا ، هو رقم الخلية. المشكلة هي جمع خلايا كافية قابلة للحياة لتحليل موثوق بها. أظهرت دراستان أن عينات البلغم التي تم جمعها بطرق غير جراحية ، بمساعدة جهاز مساعدة ، تحتوي على ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة التي يمكن استخدامها في التشخيص السريري أو الدراسات ^{البحثية16،24}. ومع ذلك، لم تتناول أي من هاتين الدراستين مسألة أرقام الخلايا المتعلقة ب قياس التدفق الخلوي.

بالنسبة للدراسات التي تشكل الأساس لهذا البروتوكول، تم جمع عينات البلغم من المشاركين المعرضين لخطر كبير للإصابة بسرطان الرئة باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة لكل موقع دراسة. تم تعريف المشاركين المعرضين لخطر كبير على أنه بين 55-75 سنة ، بعد أن دخنوا 30 عاما ولم يقلعوا عن التدخين خلال السنوات ال 15 الماضية. وقد تبين للمرضى كيفية استخدام جهاز أكابيلا وفقا لتعليمات الشركة ^{المصنعة29} وجمع البلغم لمدة ثلاثة أيام متتالية في المنزل. تم الاحتفاظ بالعينة في الثلاجة حتى المجموعة الأخيرة. وفي يوم الجمع الأخير، شحنت العينة إلى المختبر طوال الليل مع حزمة باردة مجمدة. وقد عولجت العينات لتصبح تعليقا لزنزانة واحدة في اليوم الذي وردت فيه. مع هذه الطريقة لجمع البلغم، يتم الحصول على أكثر من ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة لتحليل التدفق الخلوي موثوق بها.

وأخيرا، والمتعلقة المشكلة رقم الخلية السابقة، هو السؤال عن كيفية تحرير خلايا البلغم من بيئتها mucinous. كيف يمكن الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة وخلق تعليق خلية واحدة لا تسد مقياس التدفق الخلوي؟ استنادا إلى العمل الأولي من قبل Pizzichini et ^al.30 و Miller et ^al.31 ، يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوقة لمعالجة البلغم في تعليق خلية واحدة مناسبة لتحليل التدفق الخلوي. وقد استخدمت هذه الطريقة مبادئ توجيهية راسخة في تدفق الخلايا32,33,34 لوضع استراتيجية فعالة لوضع العلامات على الأجسام المضادة لتحديد الخلايا الدموية والظهارية في البلغم وتوفير إعدادات الأداة، وتدابير مراقبة الجودة، والمبادئ التوجيهية للتحليل توحيد تحليل البلغم على منصة تدفق الخلايا.

يتم تنفيذ جميع خطوات معالجة البلغم في خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. إعداد الكاشف قبل البدء في تفكك البلغم

1. إذابة 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)، 25 مل لكل عينة على الجليد، والحفاظ على البرد حتى الاستخدام.
   تنبيه: PFA سام عن طريق الاستنشاق والاتصال بالبشرة. إعداد المثبت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتجميد في -20 درجة مئوية في 25 مل aliquots حتى الاستخدام.
2. تقريب وزن العينة وذوبان ما يكفي من 0.1٪ Dithiothreitol (DTT) للخطوة 2.2 وبذلك إلى 37 درجة مئوية. (يجب تخزين الاقتباسات من DTT عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.)
3. جلب ما يكفي 0.5٪ N-أسيتيل- L-السيستين (NAC) تصل إلى 37 درجة مئوية للخطوة 2.2. (يجب أن يتم إجراء NAC جديدة أسبوعيا وتخزينها في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.)

2. فصافر البلغم

1. وزن عينة البلغم لتحديد أحجام الكواشف التفكك.
   ملاحظة: تعتبر العينة صغيرة إذا كان الوزن الأولي ≤3 غرام، ومتوسطة إذا كانت >3 غرام ولكن ≤8 غرام، وكبيرة إذا كانت >8 ولكن ≤16 غرام، وكبيرة جدا إذا كانت العينة تزن >16 غرام. سيتم استخدام المؤشرات الصغيرة والمتوسطة والكبيرة والكبيرة للغاية في جميع أنحاء البروتوكول. تختلف كمية الكواشف المطلوبة للتفكك ووضع العلامات وفقا لحجم عينة البلغم.
2. نقل عينة صغيرة إلى أنبوب نظيف مخروطي 50 مل، عينة متوسطة إلى زجاجة نظيفة 250 مل البلاستيك المتاح، أو عينة كبيرة وكبيرة جدا إلى زجاجة نظيفة 500 مل البلاستيك المتاح. أضف وزن عينة 1 مل/غرام من 0.5٪ NAC و4 مل/غرام وزن عينة 0.1٪ DTT.
3. دوامة بأقصى سرعة (لمدة 15 s)، ثم الصخور في درجة حرارة الغرفة (بأقصى سرعة) لمدة 15 دقيقة.
4. تمييع العينة بأربعة مجلدات من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) (استنادا إلى الحجم الإجمالي للعينة + الكواشف) لتحييد NAC و DTT؛ دوامة بسرعة بأقصى سرعة والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في أقصى سرعة.
5. تصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرومتر من النايلون شبكة الخلية مصفاة (ق) في واحد أو أكثر من 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي (ق) لإنشاء تعليق خلية واحدة.
6. طرد الخلايا في 800 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. يستنشق supernatant، والجمع بين جميع الكريات في أنبوب واحد مخروطي 15 مل، ومن ثم غسل الكريات مع HBSS باستخدام نفس الشروط.
7. Resuspend بيليه الخلية في حجم العازلة التي يحددها الوزن الأولي للعينة البلغم.
   ملاحظة: يتم إعادة إنفاق عينة صغيرة في 250 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينة متوسطة في 760 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينات كبيرة وكبيرة جدا في 1460 ميكرولتر من HBSS.
8. اتخاذ aliquot تعليق الخلية لعدد الخلايا الحية / الميتة باستخدام تريبان الأزرق.
   ملاحظة: لعينة صغيرة، استخدم 5 ميكرولتر. لعينة متوسطة أو كبيرة أو كبيرة جدا، استخدم 10 ميكرولتر. تمييع 1:10 مع HBSS.
   1. مزيج 10 ميكرولتر من تخفيف البلغم مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق لتحقيق تخفيف عينة النهائي من 1:40. تحميل في غرف العد من مقياس الدم لعد الخلايا.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري ضبط التخفيف النهائي إذا كانت أرقام الخلايا منخفضة جدا أو عالية جدا لتحقيق عدد دقيق. ينصح بشدة هنا باستشارات Guiot et ^al.20 للتمييز بشكل صحيح بين خلايا البلغم والحطام. وهذا أمر ضروري لعدد الخلايا دقيقة.
9. من عينة كبيرة جدا، وإزالة 50 × ¹⁰⁶ خلايا من المجموع وإضافة إلى أنبوب جديد مع ما يكفي من HBSS المضافة لخلق حجم إجمالي قدره 1700 ميكرولتر.
   ملاحظة: خذ بعين الاعتبار هذا نموذج كبير لبقية البروتوكول. يمكن التخلص من العينات المتبقية أو استخدامها لأغراض أخرى.

3. الأجسام المضادة وصبغة حيوية تلطيخ

1. اختيار الأجسام المضادة وصبغ تلطيخ
   ملاحظة: يعرض الجدول 1 الأجسام المضادة وصبغة البقاء المستخدمة في هذا البروتوكول وخلايا الخلايا التي تحددها.
   1. تسمية الأنابيب التي تحتوي على خلايا البلغم (انظر الجدول 2 للتسميات).
   2. استخدام أنابيب قياس الخلايا تدفق 5 مل (متوافقة مع تدفق السيتومتر المستخدمة) للأنبوب عينة مع الخلايا غير الملطخة وأنبوب مع التحكم isotype. استخدام أنابيب مخروطية 15 مل لعينات الدم والأنابيب الظهارية.
      ملاحظة: سيتم نقل هذه العينات لتدفق أنابيب قياس الخلايا بعد تلطيخ الأجسام المضادة والتثبيت.
2. تسمية أنابيب التعويض (الجدول 3).
   ملاحظة: استخدم أنابيب قياس الخلايا التدفق 5 مل متوافقة مع تدفق الخلايا المستخدمة.
3. إضافة كمية HBSS والأجسام المضادة و / أو صبغ إلى كل من أنابيب الخلية البلغم وأنابيب التعويض على النحو المبين في الجدول 2 والجدول 3، على التوالي.
   ملاحظة: أضف العازلة (HBBS) والأجسام المضادة، وصبغ لجميع الأنابيب قبل إضافة خلايا أو حبات التعويض لضمان أن جميع أنابيب 'تلطيخ الوقت متسقة.
4. إضافة كميات حجم الخلية البلغم المسرودة في الجدول 2 إلى أنابيب المقايسة.
5. إضافة حبات التعويض إلى أنابيب التعويض كما هو مذكور في الجدول 3.
6. احتضان جميع الأنابيب (أنابيب الفحص والتعويض) على الجليد، محمية من الضوء، لمدة 35 دقيقة. ثم، ملء الأنابيب مع HBSS الباردة الجليد والطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 800 × ز.
7. لأنابيب التعويض، يستنشق supernatant أقرب إلى الكريات ممكن ونفض الغبار الكريات لتخفيف.
8. أضف 0.5 مل من HBSS الباردة إلى أنابيب التعويض، وخزنها على الجليد عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحاجة لتحليل قياس التدفق الخلوي.
9. يستنشق الناطق الفائق من الأنابيب غير الملطخة ، والدم ، والأنابيب الظهارية بعد الطرد المركزي (الخطوة 3.6 من قسم تلطيخ الأجسام المضادة) وتخفيف الكريات عن طريق النقر على الأنابيب.

4. التثبيت مع 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)

1. إضافة الباردة 1٪ PFA (التي ينبغي إذابة الآن) إلى غير ملطخة، isotype، الدم، والأنابيب الظهارية. 2 مل إلى أنابيب غير ملطخة وisotype، و 10 مل إلى الدم والأنابيب الظهارية.
2. احتضان الأنابيب على الجليد، محمية من الضوء لمدة ساعة واحدة. دوامة بسرعة بأقصى سرعة بعد 30 دقيقة.
3. ملء الأنابيب مع HBSS الجليد الباردة. ثم أنابيب الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 1600 س غ.
4. يستنشق أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج بيليه الخلية ونفض الغبار أنبوب مع الأصابع لتخفيف الخلايا.
5. إضافة 200 ميكرولتر من HBSS الباردة إلى أنابيب غير ملطخة وisotype.
6. حساب حجم HBSS لإعادة إنفاق الدم وأنبوب الظهارية وفقا لإجمالي عدد الخلايا.
   ملاحظة: حجم إعادة الإنفاق = 0.15 x [إجمالي عدد الخلايا (الخطوة 8 من فصخ البلغم) / ¹⁰⁶]. استخدم 50 × ¹⁰⁶ كعدد الخلايا لعينة كبيرة جدا.
7. تخزين جميع أنابيب العينة والتعويض، محمية من الضوء على الجليد في 4 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.
   ملاحظة: لم يتم اختبار هذا البروتوكول للتخزين لأكثر من 24 ساعة.

5. الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي

1. تطبيق إجراءات بدء التشغيل المناسبة لقياس التدفق الخلوي المستخدم.
   ملاحظة: يفترض هذا القسم من البروتوكول أن الشخص الذي يشغل مقياس التدفق الخلوي مدرب على استخدام الأداة المتاحة له، ولا سيما فيما يتعلق بالإجراءات اليومية بما في ذلك التحقق من استقرار البصريات وأنظمة السوائل، وتقنيات توحيد تشتت الضوء وكثافة الفلورسينس، فضلا عن حساب وتطبيق مصفوفة التعويض الصحيحة.
2. استخدام مزيج من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) الخرز لضمان أن يتم تعيين مبعثر إلى الأمام والجهدية مبعثر الجانب لوضع الخرز NIST لتمتد قطعة الأرض بأكملها دون وضع الخرز قريبة جدا من المحاور.
   ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان إزالة الحطام الذي تقل كميةه عن 5 ميكرومترات عن طريق تحليل ما بعد الاقتناء. اعتمادا على مقياس التدفق الخلوي المستخدم، يجب أن تضع في اعتبارك أن أصغر الخرز لا يتم استبعادها مع العتبة (عند استخدام LSR II أو Lyric) أو مع التمييز العالي (باستخدام مقياس تدفق Navios EX). لS NAVIOS EX، تم استخدام مكسب من 2 للتشتت إلى الأمام والجانب، والجهد من 236 للتشتت إلى الأمام، و 250 للتشتت الجانب. بالنسبة إلى LSR II ، تم استخدام جهد مبعثر أمامي من 165 وجهد جانبي مبعثر من 190.
3. تعيين معدل التدفق إلى متوسط (LSR II) أو مرتفع (Navios EX).
   ملاحظة: يمكن استخدام معدل التدفق المتوسط أو المرتفع لمعظم الأدوات للحصول على أنابيب البلغم. من المهم ملاحظة أن استخدام بطيء جدا لمعدل التدفق أو تخفيف العينة قد يؤدي إلى استقرار الخلايا ، مما يؤدي إلى زيادة الدوامة التي ليست مرغوبة. ولذلك، فإن الالتزام بحجم إعادة الإنفاق المحسوب في الخطوة 4.6 يجب أن يؤدي إلى كثافة خلوية يمكن الحصول عليها بسرعة ولكن ليس تسد الجهاز.
4. ضبط الفولتية لكل معلمة تستخدم لمعلمات مبعثر والفلورسنت لوضع السكان الخلية على مقياس. استخدام الأرقام مع استراتيجية gating وارشادات حول كيفية ضبط الفولتية وفقا لذلك.
   ملاحظة: تأكد من تحديد كافة المعلمات المطلوبة في إطار تحديد المعلمة قبل اكتساب أو أن البيانات لن يتم الحصول عليها.
5. الحصول على بيانات لعينة البلغم غير الملطخة أولا، تليها عينة isotype الملطخة، ومن ثم أنبوب الدم وأنبوب الظهارية.
   ملاحظة: إذا كان تعليق الخلية مركزا جدا بحيث لا يسمح لقياس التدفق الخلوي بتشغيل العينات دون انسداد، فقد يتم تخفيف العينات بشكل أكبر باستخدام HBSS.

تم تطوير هذا البروتوكول مع وضع مختبر سريري في الاعتبار. وكان التركيز أثناء وضع البروتوكول على البساطة والكفاءة والقابلية للاستنساخ. ووجد أن الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في معالجة البلغم كانت عد الخلايا. لذلك، يتم إعداد البروتوكول بطريقة يمكن بها معالجة البلغم ووضع العلامات على الخلايا بشكل مستقل عن عد الخلايا دون فقدان الوقت. ويمكن بعد ذلك الحصول على عدد دقيق للخلايا، وهو أمر لا يزال ضروريا لتمييع العينة بشكل مناسب لتشغيل دون عائق، خلال فترة حضانة وضع العلامات على الأجسام المضادة.

يستخدم هذا البروتوكول مقياس وزن البلغم بدلا من تعداد الخلايا كمؤشر على مقدار الأجسام المضادة/الصبغة التي يجب استخدامها لوضع العلامات المثالية للخلايا. ومع ذلك ، هناك درجة كبيرة من الاختلاف في وزن عينات البلغم ؛ من العينات 126 التي تم تحليلها، تراوح الوزن من 0.57 غرام إلى 38.30 غرام الشكل 1A يظهر أن العلاقة بين وزن البلغم والخلية العائد ليست قوية. ولذلك، قسمت العينات إلى أربع فئات؛ وكان متوسط وزن العينات 2.1 غرام للعينات الصغيرة، و 5.0 غرام للعينات المتوسطة، و 11.2 غرام للعينات الكبيرة، و 22.0 غرام للعينات الكبيرة جدا (الشكل 1ب). ومع ذلك، لا تزال هناك عينات أسفرت عن خلايا أكثر بكثير مما كان متوقعا على أساس وزنها (الشكل 1C)، فإن غالبية العينات تتجمع بشكل جيد. وبالنسبة للعينات الصغيرة، كان متوسط إنتاج الخلية 8.0 × 106 خلايا، للعينات المتوسطة 13.0 × 106، للعينات الكبيرة 35.4 × 106، والعينات الكبيرة جدا 93.0 × 106.

كل الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول تم ثديها. وقد اختير تركيز على مرحلة الهضبة (الشكل 2A) الذي له أعلى مؤشر تلطيخ (الشكل 2B) لمنحنى المعايرة كمركز عامل. الاختلافات في أعداد الخلايا لن تغير بشكل كبير من كثافة تلطيخ. هذا المعايرة والفحص المضاد ضروري ويجب إعداده بعناية لكل الأجسام المضادة الجديدة أو الصبغة المستخدمة في هذا البروتوكول34,35. عندما يتم ثدي الجسم المضاد بعناية ، يجب أن يلطخ خلايا أكثر من 10 إلى 50 ضعفا من عدد الخلايا التي تم تثقيت الجسم المضاد عليها34،35. 10- وترد في الجدول 4 مثال على هذا المبدأ. تم ثدي الأجسام المضادة للانسان CD45-PE على 1 × 106 خلايا في حجم إجمالي قدره 400 ميكرولتر. إذا استقراء هذا الجسم المضاد لحجم التلطيخ على البروتوكول (انظر الجدول 2، الذي يظهر كمية CD45-PE وأحجام التلطيخ لكل حجم عينة)، لعينة صغيرة، سيتم تلوين 0.625 × 106 خلايا، وسيتم تلوين 1.25 × 106 خلايا لعينة متوسطة، و 2.5 × 106 خلايا لعينة كبيرة (العمود A في الجدول 4). يتم حساب زيادة 50 ضعفا في عدد الخلايا لكل فئة لتكون 31.25 × 106 و 62.5 × 106 و 125 × 106 خلايا على التوالي (العمود B). وكما هو مبين في العمودين جيم و د، فإن متوسط عدد الخلايا لكل فئة من فئات الحجم وأكبر عينة في كل فئة يقعان ضمن نطاق 50 ضعفا.

على الرغم من الاختلافات الواضحة في الحجم وغلة الخلية بين الأحجام المختلفة لعينات البلغم ، فإن متوسط تلوث SEC في كل فئة متشابه جدا. ويبين الشكل 3 ألف النسبة المئوية لمراكز النامية المستدامة الموجودة في عينات فردية، مصنفة حسب فئات وزنها البلغم. وكان الشاغل الرئيسي مع SECs لأن هذه الخلايا لا تمثل أنسجة الرئة ولكن من تجويف الفم. ومع ذلك، فإن متوسط التلوث SEC هو أقل من 20٪ لجميع الفئات. ويبين الشكل 3 باء النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة الموجودة في هذه العينات. وباستثناء الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم، كان متوسط الجدوى حوالي 72٪ لفئات حجم العينة الصغيرة والمتوسطة والكبيرة. وكان أعلى قليلا (79٪) بالنسبة للفئة خارج كبيرة.

ويبين الشكل 4 استراتيجية نموذجية لفصل خلايا البلغم ذات الأهمية عن الحطام والخلايا الميتة (التي تشمل أيضا مركبات الكربون الهيدروفلورية الملوثة36) وكتل الخلايا. ويبين الشكل 4 ألف استخدام حبات NIST لتعيين بوابات لإزالة الحطام الذي تقل مساحته عن 5 ميكرومتر أو أكبر من 30 ميكرومتر، في حين يطبق الشكل 4B هذه البوابة على خلايا البلغم. يظهر الشكل 4C ملف تعريف البلغم نموذجي عند عرضها كعرض مبعثر جانبي (SSC-W) مقابل عرض مبعثر أمامي (FSC-W)، بوابة العرض. يستخدم هذا الملف الشخصي لإزالة الحطام الصغير الذي يقدم نفسه على طول محاور SSC-W و FSC-W. ويظهر القضاء على الخلايا الميتة في الشكلين 4D والشكل 4E. يتم استخدام عنصر التحكم غير الملون (الشكل 4D) لتحديد قطع الإيجابية FVS510; تعتبر الخلايا التي تلطخ إيجابية لFVS510 فوق عنصر التحكم السلبي ميتة ولن تستخدم في تحليل خلايا البلغم (الشكل 4E). وأخيرا، يتم تطبيق بوابة مفردة لإزالة مزدوجات الخلية من التحليل، والتي تظهر في الشكل 4F. وهكذا، تمثل الخلايا التي تم إجراؤها من خلال بوابات الاختيار الموضحة في الشكل 4B والشكل 4C والشكل 4E والشكل 4F خلايا البلغم المفردة الحية الجاهزة للتحليل اللاحق مع الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول.

يسمح استخدام الأجسام المضادة للCD45 في بروتوكول وضع العلامات هذا بفصل خلايا البلغم الحية والفردية في مقصورة خلايا الدم (CD45+) ومقصورة الخلية غير الدموية (CD45-). وتشمل الفئة الأخيرة الخلايا الظهارية وغيرها من الخلايا غير الدموية. يظهر الملف الشخصي العلوي في الشكل 5A استخدام عينة البلغم غير الملون لتعيين القطع لإيجابية CD45 ، مما يجعل البوابات لالتقاط خلايا CD45 + وخلايا CD45. يظهر الملف السفلي للشخصية 5A تطبيق هاتين البوابتين على عينة البلغم الملطخة بالأجسام المضادة للCD45. ثم يتم استخدام تلطيخ مع أجسام مضادة إضافية لتحديد مجموعات خلايا الدم الخاصة داخل بوابة CD45 + (الشكل 5B) وغيرها من السكان غير خلايا الدم، بما في ذلك السكان الظهارية في CD45- بوابة (الشكل 5C). في كلا الشكلين، تظهر الملفات الشخصية العليا كيفية استخدام البلغم الملطخ بالنمط المتساوي لتعيين المجموعات السكانية السلبية المزدوجة، في حين تظهر الملفات الشخصية السفلية خلايا البلغم الملطخة بالأجسام المضادة. الشكل 5B (أسفل) يظهر ست مجموعات مختلفة من خلايا CD45 + التي تم إنشاؤها مع مزيج من الأجسام المضادة التي يمكن اكتشافها في قناة 1 مضان (FL) (مكافحة CD66b، CD3، CD19 الأجسام المضادة) ومكافحة CD206 يمكن الكشف عنها في قناة FL3. وقد كشفت تجارب الفرز أن الضامة الرئة محددة يقيمون في البوابات التي تم تحديدها مع M. وبالتالي فإن وجود خلايا في هذه البوابات يشير إلى أن عينة البلغم كانت مشتقة من الرئة ولم تكن لعابا (بيدركا وآخرون، مخطوطة قيد الإعداد). الشكل 5C (أسفل) يظهر رباعيات gating التي تم إنشاؤها باستخدام المضادة لعموم cytokeratin (بانك) يمكن الكشف عنها في قناة FL1 ومكافحة الالتصاق الخلايا الظهارية جزيء (EpCAM) الأجسام المضادة للكشف في قناة FL3 بين خلايا CD45- البلغم.

تم اختبار بروتوكول وضع العلامات هذا على نطاق واسع على Navios EX وLSR II. أجريت بعض التجارب الأولية على ليريك، ولكن من دون التحسين أداة واسعة النطاق التي تم القيام به للآلتين الأخريين. لذلك، يتم توفير إعدادات أداة مفصلة ل NAVIOS EX وLSR II في ورقة المواد، ولكن ليس لليريك. لفهم أوجه التشابه والاختلافات بين هذه المنصات الخلوية التدفق الثلاثة التي يمكن استخدامها لتحليل خلايا البلغم، يمكن مقارنة ملامح التي تم الحصول عليها من مختلف الآلات في الشكل 6 والشكل 7. تمت معالجة عينتين من البلغم الكبيرين وتجميعهما ووضع العلامات عليهما وفصلهما إلى ثلاثة أجزاء متساوية، وتم الحصول عليهما لاحقا على كل مقياس للخلايا المتدفقة المذكور أعلاه. يقارن الشكل 6، الذي يشبه الشكل 4، استراتيجية التخلص من الحطام والخلايا الميتة وكتل الخلايا. يقارن الشكل 7، الذي يتطابق مع الشكل 5، ملامح الدم وغير الدم من البيانات المكتسبة على مقاييس التدفق الخلوي المختلفة.

مقارنة مختلف ملامح التي تم الحصول عليها من ثلاثة مقاييس تدفق مختلفة تبين أن نفس ملامح الأساسية يمكن ملاحظتها مع كل صك. الاختلافات التي يجب الانتباه إليها هي مؤامرات SSC-W/FSC-W (بوابة العرض) (الشكل 6، الصف الثاني) والمقاييس الخطية للمؤامرات المتناثرة (الشكلان 6 و 7). تظهر مؤامرة عرض التشتت التي تم إنشاؤها على Navios EX بوابة تضمين (مربع أحمر) ، مما يعني أن جميع الخلايا المضمنة في البوابة يتم تحليلها بشكل أكبر؛ يتم استبعاد الأحداث على طول المحاور في الزاوية اليسرى السفلية. عرض المؤامرات مبعثر على LSR II، و Lyric لا تظهر إيداع مماثل للأحداث على طول هذه المحاور نفسها. ومن المرجح أن يكون هذا التباين راجعا إلى العتبة الحساسة جدا المستخدمة في نظام Navios EX، مما يؤدي إلى وجود بعض الحطام الصغير في بوابة استبعاد الحجم السابقة (الصف العلوي من الشكل 6). في بعض الأحيان ، وينظر إلى الحطام على طول المحاور في ملف تعريف عرض مبعثر ولدت على LSRII ، لكنه في الزاوية اليمنى السفلى. وفي هذه الحالات، تستخدم بوابة استبعاد (كما هو مبين في المربع الأحمر المتقطع في الملف الوسطي في الصف 2 من الشكل 6) للقضاء على هذه الأحداث من مزيد من التحليل.

في حين أن جداول السجل تبدو مختلفة قليلا على المؤامرات بين NAVIOS EX والمقاييس الخلوية ليريك وLSR الثاني، فإن Navios EX لديها خيار الحصول على البيانات باستخدام عقود أخرى. ويعتمد تنفيذ عقود أخرى على سياق التجربة والحساسية المطلوبة لتصور السكان الذين يهمهم الأمر.

وثمة فرق ملحوظ إضافي بين Navios EX وLSR II وcytometers ليريك هو ظهور الملف الشخصي للبوابة singlet. تم تجهيز مقياس الخلايا Navios EX مع خلية تدفق مستطيلة مع زاوية جمع مختلفة عن LSR II. يحتوي Navios EX على ثلاث زوايا تجميع يتم التحكم فيها بواسطة البرامج لتحسين تشتت ضوء الزاوية الأمامية لتحقيق الحساسية المناسبة لحجم الجسيمات لتحليلها. يجب تعديل بوابة المضلع لمقياس الخلايا Navios EX إلى زاوية أقل قليلا من بوابة المفرد ل LSRII. يمكن تحسين بوابة singlet ل Lyric للحصول على ملف تعريف مشابه لتلك التي شوهدت مع LSR II. باستخدام عينة البلغم، فإن عامل قياس المنطقة تحتاج إلى تحسين لكل ليزر على Lyric لتحقيق بوابة مفردة مماثلة ل LSR II.

تم تحليل جميع الملفات الشخصية المعروضة في الشكل 4 إلى الشكل 7 باستخدام برنامج FlowJo ، الإصدار 10.6. يمكن العثور على ملفات .fcs في FlowRepository (https://flowrepository.org) ، تحت معرفات FR-FCM-Z3LX، FR-FCM-Z3MJ، و FR-FCM-Z3MM ويمكن استخدامها لممارسة تحليل البلغم كما هو موضح في هذه الأرقام.

الشكل 1: أوزان البلغم وعائد الخلية. (أ) المصور هو العلاقة بين وزن البلغم، الذي يتم تحديده قبل المعالجة، وإجمالي إنتاج الخلية، الذي يتم تحديده بعد المعالجة باستخدام مقياس الدم. يمثل كل رمز رصاصة عينة فردية، 126 في المجموع. (ب) تم تقسيم عينات البلغم إلى أربع فئات على أساس وزنها: صغيرة للعينات التي يصل وزنها إلى 3 غرام، ومتوسطة للعينات التي يزيد وزنها عن 3 غرام حتى 8 غرام، وكبيرة للعينات التي يزيد وزنها عن 8 غرامات تصل إلى 16 غرام، وعينات كبيرة جدا لأولئك الذين يزيد وزنهم عن 16 غرام (C) مبين توزيع غلة الخلايا للعينات في كل فئة. تمثل الأشرطة الحمراء في (B) و (C) القيم الوسيطة في كل فئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المعايرة المضادة للCD45-PE المضادة للإنسان. (أ) منحنى المعايرة CD45-PE (IgG1) مع متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) للسكان الإيجابيين المرسومين مقابل تركيز هضاب الأجسام المضادة CD45-PE عند 1 ميكروغرام/مل. (ب) يظهر منحنى المعايرة الذي يصور مؤشر التلطيخ مقابل تركيز الأجسام المضادة أن أعلى مؤشر تلطيخ هو 1 ميكروغرام/مل. تم حساب مؤشر تلطيخ على النحو: [CD45 MFI السكان إيجابية - CD45 MFI السكان السلبية] / [2 * الانحراف المعياري]. واستنادا إلى الشكل 2 ألف والشكل 2B، اختير تركيز واحد ميكروغرام/مل كمركز أمثل للأجسام المضادة CD45-PE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نسبة مراكز إعادة الخلايا الجذعية والخلايا الميتة في عينات البلغم متسقة بين فئات الوزن الأربع. (أ) تصنف نسبة الشركات الصغيرة والمتوسطة في عينات البلغم وفقا لفئة وزنها. تم تحديد النسبة المئوية لتلوث لجنة الأوراق المالية والبورصة عن طريق مقياس الدم كجزء من إجمالي عدد الخلايا. (ب) صلاحية الخلية لعينات البلغم باستثناء SECS، التي يحددها مقياس الدم وطريقة استبعاد التريبان الأزرق. تمثل الخطوط الحمراء القيم الوسيطة لكل رسم بياني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: استراتيجية غاتينغ لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة والمزدوجات في عينة البلغم. (أ) استخدمت حبات NIST ذات أحجام 5 ميكرومتر و20 ميكرومتر و30 ميكرومتر لتعيين البوابة التي يشير إليها الصندوق الأحمر لاستبعاد الحطام الأصغر من 5 ميكرومتر والحطام الأكبر فوق 30 ميكرومتر وبالقرب من المحور. (ب) تم الحصول على عينة البلغم باستخدام نفس الفولتية للتشتت الأمامي والجانبي مثل حبات NIST. تم تطبيق البوابة التي تم إنشاؤها في (A) لاستبعاد الحطام. (ج) استبعدت حطام صغير قريب من المحور في هذه القطعة عرض مبعثر. (د) استخدمت عينة من البلغم غير الملطخ لتعيين قطع (الخط الأحمر) للسكان السلبية غير الملطخة لصبغة الجدوى. (ه) تم تطبيق القطع الذي تم إنشاؤه في D على عينة البلغم الملون لتشكيل بوابة (الصندوق الأحمر) لتشمل الخلايا الحية القابلة للحياة. (F) تستثني البوابة المفردة التي يشير إليها المضلع الأحمر الخلايا التي لا تقع على القطر، مما يزيل المزدوجات و/أو الكتل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تستخدم استراتيجية غاتينغ لخلايا البلغم في مقصورات الدم والخلايا غير الدموية. (أ) تستخدم خلايا البلغم غير الملطخة المشتقة من بوابة المفرد لتعيين القطع (الخط الأحمر) على السكان السلبيين لCD45 (أعلى). يتم تطبيق قطع من التشكيل الجانبي العلوي على عينة البلغم الملون (أسفل) للتمييز بين CD45 إيجابية (CD45 +) والسكان السلبية (CD45-). (ب) تستخدم خلايا البلغم CD45+ الملطخة بالأجسام المضادة متساوية النوع ل FITC/AF488 لتعيين البوابات على السكان السلبيين (الأعلى). يتم تطبيق نفس البوابات على خلايا البلغم CD45 + ملطخة بعلامات خلايا الدم CD3 و CD19 و CD66b و CD206 (أسفل). (ج) توضع بوابات رباعية على خلايا البلغم CD45- ملطخة بعناصر تحكم متساوية النمط (أعلى) وتطبيقها على الخلايا CD45- من عينة البلغم الملطخة بعلامات الظهارية عموم cytokeratin (بانك) وEpCAM (أسفل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: استراتيجية غاتينغ لاستبعاد الحطام، وكتل، والخلايا الميتة من خلايا البلغم الملون على ثلاث منصات تدفق القياسات الخلوية. تمت معالجة عينتين من البلغم الكبيرين وتجميعهما ووضع العلامات عليهما وتقسيمهما إلى ثلاثة أجزاء متساوية للاستحواذ عليها على Navios EX (A) وLSR II (B) ومقاييس تدفق التدفق Lyric (C). الصف العلوي: تم بوابات عينات البلغم (الصندوق الأحمر) لاستبعاد الحطام الصغير والكبير جدا. الصف الثاني: يمثل المربع الأحمر الكبير في مؤامرة Navios EX بوابة تضمين تتضمن الخلايا ولكنها تستبعد الحطام. ويمثل الصندوق الأحمر الصغير المتقطع الذي شوهد في قطعة الأرض LSR II بوابة استبعاد لإزالة الحطام من مزيد من التحليل. هناك حاجة إلى مزيد من التحسين مع Lyric لتحديد المكان الذي يلزم فيه استبعاد الحطام. لذلك، لا توجد بوابة في تلك المؤامرة. الصف الثالث: بوابات مستطيلة حمراء تشمل الخلايا الحية لمزيد من التحليل. الصف السفلي: بوابة المضلع يحتوي على خلايا مفردة عن طريق استبعاد doublets التي تقع خارج قطري من البوابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: استراتيجية غاتينج للبلغم الملون بالدم وعلامات الظهارية على ثلاث منصات تدفق القياسات الخلوية. 11 - يستمر التحليل المبين في الشكل 6 في الشكل 7؛ تم تقسيم جميع الخلايا القابلة للحياة والفردية (الصف السفلي ، الشكل 6) إلى مجموعات CD45 + و CD45 (الصف الأول ، الشكل 7) ، بحيث يمكن للعلامات الخاصة بخلايا الدم والعلامات الظهارية الخاصة بالخلايا أن تحدد هذه المجموعات السكانية. الصف الثاني: لمحة عن علامات خلايا الدم CD3/CD19/CD66b وCD206 من خلايا CD45+. الصف الثالث: علامات الخلايا الظهارية panCK وEpCAM من CD45-الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الأجسام المضادة وبقع البقاء المستخدمة. قائمة الأجسام المضادة وصبغة البقاء المستخدمة في هذا البروتوكول. يشار إلى المجموعات الفرعية الخلوية التي يحددها كل منها.

الجدول 2: محتوى الأنابيب ذات خلايا البلغم. استخدم هذا الجدول كما هو مذكور في البروتوكول لإضافة وحدات التخزين المحددة من الأجسام المضادة ووصمة البقاء لحجم العينة المناسب.

الجدول 3: محتوى أنابيب التعويض. استخدم هذا الجدول كما هو مذكور في البروتوكول لإضافة وحدات التخزين المحددة من الأجسام المضادة إلى حبات التعويض.

الجدول 4: تركيز CD45-PE المضاد للإنسان لجميع العينات في كل فئة من فئات حجم العينة.

جميع المؤلفين هم من الموظفين السابقين أو الحاليين من تقنيات bioAffinity.