يوفر هذا البروتوكول أدوات تجريبية لتقييم امتصاص الخلايا الكبيرة للعناصر الغذائية (الكربوهيدرات والبروتين) بواسطة الخلايا مفرطة النشاط mTORC1. يتم وصف خطوات مفصلة لتحديد امتصاص ديكستران وألبومين مصل الأبقار (BSA) المسمى بالفلورسنت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التقييم الكمي لكثرة الخلايا العصبية في الخلايا مفرطة النشاط mTORC1 باستخدام قياس التدفق الخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كثرة الخلايا العصبية هي عملية داخلية محفوظة للغاية تعتمد على الأكتين تسمح بامتصاص المواد خارج الخلية ، بما في ذلك البروتينات والدهون. في الخلايا المتكاثرة ، يمكن أن يوصل كثرة الخلايا الكبيرة العناصر الغذائية خارج الخلية إلى الجسيم الليزومي ، ومعالجتها في اللبنات الأساسية للجزيئات الكبيرة. سلطت الدراسات الحديثة الضوء على اعتماد العديد من أنواع السرطان على كثرة الخلايا الكبيرة ، بما في ذلك سرطان الثدي والقولون والمستقيم والبنكرياس. يعتقد أن طفرات Ras هي الأحداث الدافعة وراء بدء كثرة الخلايا الكبيرة ، مما يؤدي إلى تنشيط العمليات الابتنائية الخلوية عبر مسار إشارات mTORC1. ومن المثير للاهتمام ، أن mTORC1 يمكن أيضا تنشيطه عن طريق كثرة الخلايا الكبيرة بشكل مستقل عن Ras. لذلك ، يمثل كثرة الخلايا الكبيرة ضعفا أيضيا يمكن الاستفادة منه لاستهداف أورام الخلايا الكبيرة عن طريق الحد من وصولها إلى العناصر الغذائية علاجيا.
في مركب التصلب الحدبي (TSC) والورم العضلي اللمفي (LAM) ، يؤدي فرط نشاط mTORC1 إلى تعزيز كثرة الخلايا الكبيرة وإعادة برمجة التمثيل الغذائي. هنا ، نصف بروتوكولا قائما على قياس التدفق الخلوي لتقييم كثرة الخلايا الكبيرة في خلايا الثدييات كميا. يتم استخدام MEFs التي تعاني من نقص TSC2 ، والتي تظهر تنشيطا شاذا ل mTORC1 وقد ثبت أنها زادت من كثرة الخلايا الكبيرة مقارنة بالخلايا التي تعبر عن TSC2. يتم تحضين الخلايا المعالجة بالمثبطات الدوائية لكثرة الخلايا الكبيرة بألبومين مصل الأبقار المسمى بالفلورسنت ، والقابل للتثبيت بالليسين ، أو 70 كيلو دالتون ديكستران ، أو ألبومين مصل الأبقار المسمى بالفلورسنت (BSA) الذي يتم فحصه بواسطة قياس التدفق الخلوي. حتى الآن ، تم تطوير تقنيات قوية قائمة على الصور لتقييم كمي كثرة الخلايا السرطانية في الخلايا السرطانية في المختبر وفي الجسم الحي. يوفر هذا التحليل تقييما كميا لكثرة الخلايا الكبيرة في ظروف تجريبية متعددة ويكمل التقنيات القائمة على الصور الحالية.
المقدمة
كثرة الخلايا العصبية هي عملية داخلية مخصصة لامتصاص كميات كبيرة من المواد خارج الخلية متبوعا بتكوين الماكروبينوسومات ، إما المعاد تدويرها إلى غشاء البلازما أو الاندماج مع الجسيمات الحالة لتحلل الحمولة الداخلية1،2. على الرغم من أن امتصاص البضائع غير انتقائي ، إلا أن كثرة الخلايا الكبيرة هي عملية متعددة الخطوات ، يتم تنظيمها بإحكام بواسطة Rab GTPases و Membrane Phospholipids3،4. والجدير بالذكر أن الخلايا السرطانية تستخدم كثرة الخلايا الكبيرة لاستيعاب العناصر الغذائية خارج الخلية ، بما في ذلك البروتينات والسكريات والدهون. يتم تنشيط كثرة الخلايا السرطانية ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. علاج الخلايا
اليوم 1
- الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) التي تعاني من نقص TSC2 وTSC2 في ثلاث نسخ ، في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار باستخدام DMEM ، مع استكمال 10٪ FBS. يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 60-70٪ بحلول اليوم الثالث.
- بذور آبار تحكم إضافية لكل حالة دوائية لن يتم تلطيخها ب FITC-Dexterrn أو TMR-BSA.
اليوم 2
- اسحب الوسائط بعناية واشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة.
- عالج الخلايا بالمركبة (DMSO) ، 100 ميكرومتر من حمض الفوسفاتيديك (PA) ، 2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمنع الريتانسيرين كثرة الخلايا الكبيرة في الخلايا التي تعاني من نقص TSC2
لقد أظهرنا سابقا أن امتصاص الخلايا الكبيرة للمغذيات يزداد بمقدار ثلاثة أضعاف في الخلايا التي تعاني من نقص TSC2 مقارنة بالخلايا التي تعبر عن TSC2 16. في TSC و LAM ، يتم التوسط في كثرة الخلايا الكبيرة عن طريق ثنائي الجلسرين كيناز ألفا (DGKA). المنتج الأيضي ل DGKA هو حمض الفوسفاتيديك (PA) ، وهو مكون حاسم في الأغشية الخلوية. لذلك ، افترضنا أن تثبيط D.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، نصف نهجا كميا لتقييم كثرة الكثرة باستخدام قياس التدفق الخلوي. توفر هذه الطريقة قياسا دقيقا وسريعا لديكستران وألبومين البضائع الكبيرة المسمى بالفلورسنت. وصفت الدراسات السابقة بعناية مؤشر الخلايا الكبيرة للخلايا السرطانية باستخدام مناهج الفحص المجهري متحد البؤر15،20. على الرغم من أن هذه الطرق تحدد بدقة استيعاب الماكروبينوسومات وحجمها وتوزيعها المكاني ، إلا أنها تتطلب تحليل صور متعددة لكل حالة تجريبية. في المقابل ، تسمح التقني.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
جائزة مؤسسة لام للتطوير الوظيفي. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. أجرت القراءة النقدية هيلير سي لام.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11965-092 | وسائط النمو |
| EIPA (أميلوريد) | Sigma Aldrich | A3085 | مثبط كثرة |
| الخلايا العصبية FBS | R & D Systems | S11150 | مصل الأبقار الجنينية |
| FITC-Dextern | Invitrogen | D1822 | عديد السكاريد الفلوري (70 كيلو دالتون) |
| Parafolmadehyde | Pierce | 28906 | عامل التثبيت |
| PBS | Gibco | 10010-023 | عازلة الفوسفات الملحية |
| Penicilin / Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-100ML | المضادات الحيوية |
| لزراعة الخلاياحمض الفوسفاتيديك | أفانتي | 840101P | فوسفوليبيد مشتق من البيض |
| ريتانسيرين | توكرس | 1955 | مثبط DGKA |
| TMR-BSA | Invitrogen | A23016 | ألبومين |
| الفلورسنت التربسين | سيجما ألدريتش | 25300-054 | عامل التفكك |
المراجع
- Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-t....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
