مقالة منهجية

في المختبر تمايز الخلايا المتغصنة البشرية وعلاماتها في عدوى الليشمانيا

845 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62794

⸱

أبريل 6, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا المتغصنة (DCs) هي مكونات أساسية للمناعة الفطرية ضد عدوى الليشمانيا. ولا تزال الآليات الكامنة وراء التفاعل المعقد بين البلدان النامية والليشمانيا غير مفهومة جيدا. هنا ، نصف طرق تقييم كيفية تأثير عدوى الليشمانيا على الوظيفة البيولوجية المناعية للتمركز المستمر البشري ، مثل التعبير عن الجزيئات المرتبطة بالهجرة والتكليفة.

الملخص

يتكون داء الليشمانيات من مجموعة من المظاهر السريرية المرتبطة بعدوى الأوليات الإلزامية داخل الخلايا ، الليشمانيا. تتكون دورة حياة طفيليات الليشمانيا من مرحلتين متناوبتين من الحياة (amastigotes و promastigotes) ، حيث توجد الطفيليات داخل نواقل المفصليات أو العوائل الفقارية ، على التوالي. والجدير بالذكر أن التفاعلات المعقدة بين طفيليات الليشمانيا والعديد من خلايا الجهاز المناعي تؤثر إلى حد كبير على نتيجة العدوى. الأهم من ذلك ، على الرغم من أنه من المعروف أن الضامة هي المكان الرئيسي للمضيف لتكاثر الليشمانيا ، إلا أن الطفيليات يتم أيضا البلعمة بواسطة الخلايا المناعية الفطرية الأخرى ، مثل العدلات والخلايا المتغصنة (DCs).

تلعب البلدان النامية دورا رئيسيا في سد الفروع الفطرية والتكيفية للمناعة ، وبالتالي تنسيق الاستجابات المناعية ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض. لا تزال الآليات التي تتفاعل بها الليشمانيا و DCs غير واضحة وتتضمن جوانب التقاط مسببات الأمراض ، وديناميكيات نضج التيار المستمر وتنشيطه ، وهجرة التيار المستمر إلى العقدة الليمفاوية المستنزفة (dLNs) ، وعرض المستضد إلى الخلايا التائية. على الرغم من أن مجموعة كبيرة من الدراسات تدعم فكرة أن البلدان النامية تلعب دورا مزدوجا في تعديل الاستجابات المناعية ضد الليشمانيا ، إلا أن مشاركة هذه الخلايا في القابلية أو المقاومة لليشمانيا لا تزال غير مفهومة جيدا. بعد الإصابة ، تخضع DCs لعملية نضج مرتبطة بتنظيم مركب التوافق النسيجي الرئيسي السطحي (MHC) II ، بالإضافة إلى جزيئات التكلفة (وهي CD40 و CD80 و CD86).

يعد فهم دور DCs في نتائج العدوى أمرا بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات علاجية وقائية لتعديل الاستجابة المناعية ضد الليشمانيا. تصف هذه الورقة طريقة لتوصيف تفاعل الليشمانيا والتيار المستمر. يوفر هذا البروتوكول التفصيلي إرشادات خلال خطوات تمايز التيار المستمر ، وتوصيف جزيئات سطح الخلية ، وبروتوكولات العدوى ، مما يسمح للعلماء بالتحقيق في استجابة التيار المستمر لعدوى الليشمانيا واكتساب نظرة ثاقبة للأدوار التي تلعبها هذه الخلايا في سياق العدوى.

المقدمة

يشكل داء الليشمانيات مجموعة من الأمراض المهملة التي تسببها أنواع مختلفة من جنس الليشمانيا 1. الليشمانيا هو بروتوزوان داخل الخلايا من عائلة Trypanosomatidae يصيب البشر والثدييات الأخرى ، مما يتسبب في مجموعة من الأمراض التي تتراوح من الآفات الجلدية إلى الأشكال الحشوية2. المظاهر السريرية الرئيسية لهذا المرض هي داء الليشمانيات الغشائي (TL) وداء الليشمانيات الحشوي (VL). تقدر منظمة الصحة العالمية (WHO) أن 700,000 إلى 1 مليون حالة جديدة تحدث سنويا ، مما يتسبب في 70,000 حالة وفاة كل عام2. يصيب داء الليشمانيات في جميع أنحاء العالم ما يقرب من 12 إلى 15 مليون شخص، و350 مليون شخص معرضون لخطر الإصابة بالمرض3.

يقدم جنس Leishmania شكلين تطوريين: promastigote و amastigote4. تتميز ليشمانيا promastigotes بوجود سوط وحركة عالية. تم العثور على هذه الأشكال في الجهاز الهضمي للذبابة الرملية ، حيث تخضع للتمايز إلى الشكل المعدي (promastigotes metacircleic)5. على النقيض من ذلك ، تم العثور على amastigotes في البيئة داخل الخلايا لخلايا الثدييات المصابة. هذا الشكل التطوري ، بدوره ، يتكرر في الجسيمات البلعمية للخلايا البلعمية6.

تبدأ دورة انتقال الليشمانيا أثناء التغذية بالدم ، عندما تقوم ذبابة الرمل بتلقيح البروماستيجوت metacyclic في جلدالمضيف 1. بعد فترة وجيزة من تلقيح الليشمانيا ، تقوم الخلايا المناعية الفطرية ، بما في ذلك العدلات والضامة المقيمة في الأنسجة ، بعمل البلعمة على الطفيليات. داخل الفجوات الطفيلية ، تتمايز الليشمانيا إلى amastigotes وتتكاثر ، وتبلغ ذروتها في تمزق غشاء الخلية المضيفة ، مما يسمح بإصابة الخلايا المجاورة وانتشارالطفيليات 4. تكتمل الدورة عندما تبتلع الفصدات الخلايا البلعمية المحتوية على amastigote ، والتي تتمايز إلى promastigotes procyclic ولاحقا إلى promastigotes metacyclic في الأمعاء7.

تعمل الخلايا المتغصنة ، وهي خلايا احترافية تقدم مستضد موجودة في الأنسجة والغدد الليمفاوية ، كحارس لجهاز المناعة8. تم العثور على هذه الخلايا في الأنسجة المحيطية في مراحل غير ناضجة ، وتشارك بشكل أساسي في التقاط المستضد ومعالجته. بعد ملامسة مسببات الأمراض ، تخضع DCs لعملية نضج تبلغ ذروتها في هجرتها إلى الغدد الليمفاوية ، وبالتالي تقديم مستضدات لخلايا CD4 + T الساذجة. هذه الخلايا ضرورية أيضا في تنظيم الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية التي تولد التسامح أو الالتهاب9. تتضمن عملية نضج التيار المستمر عدة جوانب ، بما في ذلك زيادة التعبير عن معقد التوافق النسيجي الكبير والجزيئات التكلفة ، مثل CD40 و CD86 ، بالإضافة إلى إفراز السيتوكين المعزز. تعبر DCs عن علامات مختلفة ، بما في ذلك CD11b و CD11c ، وفي البشر ، تعبر DCs التي تنشأ من الخلايا الوحيدة CD14 + (moDCs) عن CD1a10. يتم التعبير عن CCR7 بشكل كبير على DCs ويشير إلى عملية الهجرة المعقدة لهذهالخلايا 12. يلعب CD209 و CD80 أيضا دورا مهما في الاتصال الأولي مع الخلايا النامية والخلايا الليمفاوية13.

في داء الليشمانيات ، تشير الدراسات إلى أن طفيليات البلعمة moDCs وتوصيلها إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة (dLNs) ، حيث تقدم مستضدات للخلايا التائية13. ترتبط آلية التقاط الطفيليات بإعادة تنظيم الهيكل الخلوي بواسطة خيوط الأكتين أثناء البلعمة ، مما يعزز استيعاب الطفيلي14. ركزت معظم الدراسات المتعلقة بالأدوار التي تمارسها البلدان النامية في داء الليشمانيات على L. major و L. amazonensis و L. braziliensis15. ومن المثير للاهتمام ، أن الدراسات في الجسم الحي لعدوى الليشمانيا أظهرت أن ضعف وظيفة التيار المستمر يحدث بطريقة خاصة بسلالة الطفيليات.

لقد ثبت أنه خلال المراحل المبكرة من عدوى L. amazonensis ، تظهر DCs قدرة منخفضة على تقييد عدوى الطفيليات. على العكس من ذلك ، في نموذج تجريبي لعدوى L. braziliensis ، تبين أن DCs تقوم بتكوين استجابات مناعية مناسبة تقيد بقاء الليشمانيا16. الجوانب الرئيسية المعروفة بأنها مرتبطة بالاستجابات التفاضلية لعدوى الليشمانيا هي درجة نضج التيار المستمر وتنشيطه. تصف هذه الورقة طريقة للتحقيق في الدور الذي تلعبه الخلايا النامية البشرية في عدوى الليشمانيا لفهم كيفية تأثير هذه الخلايا على نتائج المرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم الحصول على الخلايا من متطوعين من متبرعين أصحاء. تمت الموافقة على الإجراء الموصوف هنا من قبل اللجنة الوطنية للأخلاقيات (رقم 2.751.345) - فيوكروز ، باهيا ، البرازيل).

1. تمايز الخلايا التغصنية البشرية

  1. ماصة 10 مل من خليط التريازوات السكروز والصوديوم في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
  2. قم بتسمية الأنابيب المخروطية سعة 50 مل على التوالي لكل متبرع.
  3. اجمع 30 مل من الدم من متبرعين أصحاء وقم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في غطاء التدفق الرقائقي.
  4. انقل الدم بعناية إلى الأنابيب المخروطية وخفف الدم في محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) بنسبة 1: 1 في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتراكب الدم المخفف ببطء على خليط عديد السكروز والصوديوم ثلاثيات في الأنابيب (الخطوة 1.1). الطرد المركزي الأنابيب مرة واحدة عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: قم بإيقاف تشغيل الفرامل قبل الطرد المركزي لمنع اختلاط طبقات التدرج. بعد الطرد المركزي الأول ، قم بخفض درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية في جهاز الطرد المركزي.
  6. أخرج الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.
  7. ابحث عن الحلقة التي تتكون من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) في العينة (معطف بافي). شفط البلازما المتبقية بعناية باستخدام ماصة.
    ملاحظة: يؤدي الطرد المركزي إلى تكوين طبقات التدرج التالية: كريات الدم الحمراء ، ووسط تدرج الكثافة ، وحلقة PBMC ، والبلازما. تقع حلقة PBMC بين وسط تدرج الكثافة وطبقات البلازما.
  8. انقل طبقة PBMC العكرة إلى أنبوب آخر وأضف المحلول الملحي إلى الحجم النهائي البالغ 30 مل.
  9. الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على معلقات الخلية عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من المحلول الملحي لإعادة تعليق الحبيبات.
  10. اجمع حصة لعد الخلايا وقم بتخفيفها 1: 1,000. استخدم 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة لحساب الخلايا بطريقة استبعاد التريبان الأزرق باستخدام غرفة نيوباور لتحديد صلاحية الخلية.
  11. قم بتدوير التعليق مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  12. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). استخدم 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل 1 × 107 خلايا.
    ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على تكوين المخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs. حافظ على البرودة وقم بتخزينه عند 2-8 درجة مئوية.
  13. أضف حبيبات CD14 الدقيقة إلى تعليق الخلية المعد في الخطوة 1.9. استخدم 20 ميكرولتر من حبيبات CD14 لكل 1 × 107 خلايا.
    ملاحظة: تستخدم الميكروبيدات CD14 لاختيار الخلايا الوحيدة البشرية بشكل إيجابي من PBMCs ، حيث ترتبط الخرزات التي تحتوي على مضادات CD14 البشرية بخلايا CD14 + المعبر عنها على أسطح معظم الخلايا الوحيدة.
  14. الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الكريات والميكروبيدات بشكل موحد. يحفظ على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  15. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  16. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS. استخدم 1-2 مل لكل 1 × 107 خلايا في خليط الخلية والميكروبيد.
  17. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  18. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأجهزة MACC.
    ملاحظة: هذا هو الحد الأقصى لحجم تعليق الخلية المراد معالجته في عمود واحد.
  19. قم بتجميع العمود المغناطيسي.
  20. اغسل العمود مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS واترك المخزن المؤقت يتدفق تحت الجاذبية عبر العمود.
    ملاحظة: احرص على عدم السماح للعمود بالجفاف ، لأن الهواء يمكن أن يعيق العمود.
  21. أضف 500 ميكرولتر من معلق حبة الخلية (الخطوة 1.19) لكل عمود. اسمح لتعليق الخلية بالتدفق تحت الجاذبية عبر العمود.
  22. اغسل العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS (2x). أضف مخزن مؤقت جديدا فقط عندما يكون خزان العمود فارغا. لا تدع العمود يجف.
  23. ضع أنبوبا جديدا أسفل العمود ، وقم بوضع ماصة 1 مل من المخزن المؤقت MACS على العمود ، وقم على الفور بإخراج الخلايا المصنفة مغناطيسيا من العمود عن طريق دفع المكبس بقوة.
  24. جهاز الطرد المركزي الخلايا المخصبة CD14 عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  25. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور.
  26. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI الكامل مع 100 ميكرولتر / مل من الإنترلوكين -4 (IL-4) ((50 نانوغرام / مل) + عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) (50 نانوغرام / مل).
  27. خلايا البذور على صفيحة 24 بئرا بتركيز 2 × 105 خلايا لكل بئر في 500 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل الذي يحتوي على السيتوكينات المذكورة أعلاه وتحتضن لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية.

2. ثقافة الليشمانيا

ملاحظة: L. amazonensis (MHOM / BR88 / Ba-125) تم استخدام الطفيليات في هذا الفحص.

  1. حافظ على البروماتيجوت على وسط أجار الدم Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) باستخدام 5 مل من وسط شنايدر الكامل أو الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) في زجاجة مزرعة مقاس 25 سم2 في حاضنة الطلب على الأكسجين الحيوي (BOD) عند 24 درجة مئوية.
    ملاحظة: لزراعة شكل promastigote من L. amazonensis الأنواع ، تم استخدام 5 مل من وسط شنايدر الكامل (وسط حشرات شنايدر الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل (FBS) وجنتاميسين بتركيز 50 ميكروغرام / مل).
  2. احتضان لمدة 7 أيام عند 24 درجة مئوية في حاضنة BOD.
  3. ماصة 100 ميكرولتر من مزرعة البروماستيجوت في قارورة جديدة لزراعة الخلايا مقاس 25 سم2 .
  4. أضف 5 مل من MEM المكملات.
  5. احتضن عند 24 درجة مئوية في حاضنة BOD وعد البروماستيجوت بشكل دوري عن طريق نقل كمية من تعليق الخلايا الطفيلية المخففة بالمحلول الملحي إلى غرفة Neubauer (أي مقياس كثافة الدم) حتى يتم الوصول إلى المرحلة الثابتة.
    ملاحظة: لا تستخدم المقطع الأول بعد NNN Medium للتجارب.
  6. انقل 1 × 105 من مرحلة النمو الثابتة ليشمانيا إلى قارورة جديدة لزراعة الخلايا مقاس 25 سم2 وأضف 5 مل من MEM المكملات.
  7. راقب بشكل دوري نمو الثقافات باستخدام غرفة Neubauer حتى يتم تحقيق المرحلة الثابتة.
    ملاحظة: استخدم مزارع promastigote لما يصل إلى 7 مقاطع في المختبر لتجنب فقدان الفوعة.

3. عدوى الليشمانيا

  1. بعد التحقق من نمو الطفيليات المستزرعة في المرحلة الثابتة ، قم بإزالة جميع المحتويات من زجاجات الاستزراع وضعها في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. أضف محلول ملحي بارد لتحقيق حجم نهائي يبلغ 30 مل.
  2. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية عند 1,600 × جم ثلاث مرات. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في محلول ملحي بارد.
  3. اغسل الخلايا لإزالة أي طفيليات غير قابلة للحياة ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المحلول الملحي البارد. مرر التعليق 5 مرات ببطء من خلال حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 16 جم لفصل مجموعات الطفيليات.
  4. قم بإزالة حصة من العينة لحساب تركيز الطفيلي في مقياس كثافة الدم باستخدام المعادل (1).
    تركيز الطفيليات = متوسط الطفيليات في 4 أرباع × عامل التخفيف × 104 (1)
  5. احسب كمية الليشمانيا sp. مطلوب لعدد الخلايا المضيفة المراد طلاؤها للحفاظ على نسبة الطفيلي 10: 1: الخلية المضيفة (الخطوة 1.27).
  6. اغسل التيار المستمر بإضافة 1 مل من المحلول الملحي والطرد المركزي للخلايا ثلاث مرات عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. ضع الحجم المطلوب من الليشمانيا في كل بئر من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا (انظر الخطوة 3.5).
  8. احتضان البلدان النامية بالطفيليات لمدة 4 ساعات في حاضنة عند 37 درجة مئويةفي جو 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون.

4. تلطيخ مناعي لتحليل قياس التدفق الخلوي

  1. بعد الإصابة ، اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من المحلول الملحي لإزالة أي طفيليات غير داخلية.
    ملاحظة: اللوحة التي تحتوي على استنساخ الأجسام المضادة والفلوروكرومات مدرجة في جدول المواد.
  2. الأجسام المضادة المخففة (1:50) في المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) (1x PBS مع 1٪ BSA) بحجم نهائي قدره 50 ميكرولتر لكل حالة تجريبية.
    ملاحظة: من المهم معايرة الأجسام المضادة قبل التجربة لضمان تركيزات التلوين المثلى. في هذا البروتوكول، تم استخدام 1:50 بعد تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي.
  3. قم بإعداد مزيج رئيسي (1x PBS مع 1٪ BSA + مزيج الأجسام المضادة). دوامة وماصة 50 ميكرولتر من المزيج في الآبار التي تحتوي على خلايا.
  4. احتضن DCs لفترة وجيزة بمزيج الأجسام المضادة (CD1a المضاد للإنسان ، CCR7 المضاد للإنسان ، CD83 المضاد للإنسان ، مضاد ل CD11c ، مضاد للإنسان CD209 ، HLA-DR المضاد للإنسان) على الجليد لمدة 30 دقيقة ، محمي من الضوء.
  5. اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من محلول التلوين البارد (1٪ FBS في 1x PBS) وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول التلوين البارد.
  7. تابع الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: لضمان الظروف المثلى لتحليل FACS ، يجب إجراء الحصول على البيانات في غضون 48 ساعة بعد تلطيخ العينة. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo.
    1. افتح برنامج FlowJo وأنشئ مساحة عمل جديدة. أضف ملفات قياس التدفق الخلوي المراد تحليلها عن طريق سحبها إلى نافذة مساحة العمل.
    2. انقر فوق اسم الأنبوب لتحديد معلمات التشتت الجانبي (SSC) والمبعثر الأمامي (FSC).
      ملاحظة: استند تحليل قياس التدفق الخلوي لنضج التيار المستمر إلى التعبير عن CD1a و CD11c و CD80 و CCR7 و CD209 و HLA-DR.
    3. باستخدام أداة بوابات المضلع ، ارسم بوابة حول DCs. انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا المسورة المحددة لعرض نافذة جديدة. قم بإجراء تنظيف مزدوج عن طريق تحديد معلمات FSC-A وFSC-H. باستخدام أداة المضلع ، ارسم مخططا جديدا حول الخلايا الفردية.
    4. انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا المسورة وحدد معلمات SSC و CD11c لإنشاء بوابة تحتوي على خلايا CD11c + .
    5. قم بتصدير بوابة الخلية CD11c + التي تم تنظيفها عن طريق تحديدها. انقر بزر الماوس الأيمن على البوابة وحدد خيار تحديد العقد المكافئة . انقر بزر الماوس الأيمن فوق البوابة وقم بتصديرها مع جميع المعلمات المعوضة عن طريق حفظها في مجلد تم إنشاؤه مؤخرا.
    6. قم بإنشاء مساحة عمل جديدة عن طريق فتح الملفات المحفوظة مؤخرا. انقر فوق مساحة العمل وحدد المكونات الإضافية | سامبلة | 30,000 إلى 50,000 حدث. اضغط على موافق.
      ملاحظة: نظرا لأن TSNE هي عملية تستغرق وقتا طويلا وتتطلب متطلبات حسابية ، يوصى بهذه الخطوة لتقليل العدد الإجمالي للأحداث التي تم تحليلها.
    7. انقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف تم أخذ عينات مخفضة وحدد العقد المكافئة.
    8. انقر بزر الماوس الأيمن فوق ملف تم أخذ عينات مخفضة وحدد تصدير/سلسلة.
    9. انقر فوق نافذة التسلسل وحدد جميع المعلمات المعوضة. حدد الملفات المتسلسلة وانقر فوق مساحة العمل | البرنامج المساعد | tSNE.
    10. حدد المعلمات المطلوبة (CD1a وHLA-DR وCCR7 وCD80 وCD209 وCD11c) لإنشاء مجموعات. اضغط على موافق.
    11. انقر فوق الملف المتسلسل لتصور معلمات tSNE1 و tSNE2.

5. تلطيخ مناعي الأكتين

  1. لوحة DCs مصابة على أغطية موضوعة في ألواح 24 بئرا. الطرد المركزي للألواح عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا 3 مرات بمحلول ملحي معقم بعد الإصابة في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي طفيليات خارج الخلية.
  2. احتضان التيار المستمر ب 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة بارافورمالدهيد وأضف 1 مل من المحلول الملحي (انظر الجدول 1).

6. الملصقات المناعية

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية تحت التحريض.

  1. اغسل الغطاء ب 1x PBS لمدة 5 دقائق ؛ كرر 3 مرات. أضف 500 ميكرولتر من محلول كلوريد الأمونيوم لكل بئر ؛ احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. اغسل الغطاء ب 1x PBS لمدة 5 دقائق ؛ كرر 3 مرات.
  3. تخلل الغشاء مع 0.15٪ سابونين لمدة 15 دقيقة.
  4. كتلة لمدة 1 ساعة مع 1x PBS 1x / 3٪ BSA / 0.15٪ سابونين. اغسل الغطاء باستخدام 1x PBS / 0.15٪ سابونين لمدة 5 دقائق ؛ كرر 3 مرات.
  5. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة باستخدام الفالودين (1: 1،200] مخفف في 1x PBS / 1٪ BSA / 0.15٪ سابونين. اغسل الغطاء باستخدام 1x PBS / 0.15٪ سابونين لمدة 5 دقائق ؛ كرر 3 مرات.
  6. ضع الغطاء بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل على وسط التركيب باستخدام 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). قم بتغطية الشرائح بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء.
  7. احصل على الصور باستخدام مجهر مضان متحد البؤر بهدف 63x / 1.4.

7. الحصول على الفحص المجهري متحد البؤر والقياس الكمي في فيجي

  1. التقط صورا للتألق المناعي باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: للحصول على أفضل دقة، استخدم عدسة غمر بالزيت موضوعية بمعدل 63 ضعفا.
  2. احم الأغطية من الضوء واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستحواذ.
  3. استخدم أنسجة ماصة لتنظيف الأغطية. أضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف وضع الشريحة على مرحلة المجهر. حدد هدف 63x بالزيت ، وارفع المنصة حتى يلمس الزيت الشريحة ، واضبط التركيز على المجهر.
  4. افتح البرنامج وقم بتنشيط الأطوال الموجية لليزر 488 و 552 و 405 نانومتر.
  5. اضبط دقة الصورة على 1024 × 1024 بكسل.
  6. انقر فوق الجزء السفلي المباشر ، واضبط مكدس Z ، واضغط على ابدأ. كرر هذه العملية ثم اضغط على زر إنهاء .
  7. انتظر حتى يكتمل الحصول على الصورة ، ثم حدد الخيار الحد الأقصى للإسقاط في الأدوات.
  8. احفظ التجربة، وقم بتصدير الصور بتنسيق .lif إلى جهاز كمبيوتر.
  9. افتح برنامج FIJI، وافتح التجربة في FIJI، وقم بتعيين مكدس العرض إلى Hyperstack.
  10. حدد فتح ملفات الصور بشكل فردي | دمج البلاطات.
  11. حدد أداة اليد الحرة في شريط أدوات فيجي وتتبع كل خلية بعناية يدويا. اضغط على تحليل | قياس لتصور شدة التألق. كرر هذه العملية لكل نوع خلية لكل مجموعة.
  12. احفظ القياسات وقم بتصديرها إلى جدول بيانات. افتح الملف الذي يحتوي على البيانات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي (انظر جدول المواد) لإجراء التحليل الإحصائي.

8. التحليل الإحصائي

  1. افتح مشروعا جديدا في البرنامج.
  2. بالنسبة للبيانات ذات التوزيع الطبيعي ، استخدم اختبار t للطالب. بالنسبة للبيانات غير المعلمية ، استخدم اختبار Mann-Whitney U .
  3. الصق القيم التي تم الحصول عليها من النتائج التجريبية في الجدول.
  4. حدد الإحصائيات الوصفية واختر إحصائيات عمود الخيار [جميع الاختبارات] لتحليل توزيع البيانات.
    ملاحظة: إذا كانت البيانات تتبع التوزيع الغوسي ، فاختر t-test لفحص العينات عن طريق مقارنة زوجين. إذا كان التوزيع غير غاوسي ، فقم بتحليل البيانات باستخدام اختبار Mann-Whitney U مع مقاييس الميل المركزي (الوسائل أو المتوسطات) ومقاييس التباين.
  5. اختر أفضل خيار رسم بياني للتمثيل الأمثل للبيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يبحث هذا التقرير في دور الخلايا النامية في عدوى الليشمانيا باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر. في البداية ، تم إنشاء المظهر الظاهري للتيار المستمر المشتق من الخلايا الأحادية البشرية. والجدير بالذكر أن مجموعات الخلايا المتغصنة CD11c + التي تم الحصول عليها كانت إيجابية ل CCR7 و CD209 و CD80 و CD1a و HLA-DR. تشير النتائج إلى أن التعبير عن هذه العلامات في مجموعات DC يتأثر بشدة بعدوى الليشمانيا. أظهرت DCs المصابة تعبيرا معززا CD80 و CD209 و CCR7 و HLA-DR. ومع ذلك ، لوحظ أيضا تقل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

داء الليشمانيات هو مشكلة صحية عمومية خطيرة في جميع أنحاء العالم. التسبب في هذا المرض معقد للغاية ، ولا تزال الآليات التي تفضل بقاء الطفيليات في مضيفي الفقاريات بعيدة المنال17. DCs هي خلايا احترافية تقدم مستضد توجد في جميع أنحاء الجسم ، بما في ذلك الأعضاء المرشحة والليمفاوية. بعد التقاط المستضد ومعالجته ، تخضع DCs غير الناضجة لعملية نضج معقدة تبلغ ذروتها في هجرتها إلى الغدد الليمفاوية ، حيث تكون هذه الخلايا مسؤولة عن تقديم المستضدات للخلايا الليمفاوية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

نشكر معهد غونسالو مونيز (IGM-Fiocruz) (باهيا ، البرازيل) وقسم الفحص المجهري على المساعدة. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لأندريس ك. والتر على التحليل النقدي ومراجعة اللغة الإنجليزية والمساعدة في تحرير المخطوطات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مضاد CCR7Thermo
anti CD209Isofarma
anti CD83Leica SP8
مضاد HLA-DRGibco
مصل الأبقار الألبومينThermoA2153-100GSigma
CiprofloxacinGibco
مجهر متحد البؤرThermo Fisher مصل الأبقار العلمي
الجنينجيبكو
فلو جوثيرمو فيشر العلمي
الجنتاميسينثيرمو فيشر العلمي
الجلوتامينجيبكو
هيبسثيرمو فيشر العلمي
فالودينالثيرمو فيشر العلمي
محلول عازلة الفوسفاتPeprotech
لإطالة الذهب المضاد للبهتانBD PD pharmigen
RPMIBD pharmigen
SaponinBD pharmigen47036 &ndash ؛ 50 جم &ndash ؛ Fسيجما
شنايدر الحشراتوسيط البرمجيات BD Biosciences
طقم

المراجع

  1. Torres-Guerrero, E., Qunitanilla-Cedillo, M. R., Ruiz-Esmenhjaud, J., Arenas, R. Leishmaniasis: a review. F1000 Research. 6, 750(2017).
  2. Pace, D. Leishmaniasis. Journal of Infection. 69, Suppl 1 10-18 (2014).
  3. Reithinger, R., et al. Cutaneous leishmaniasis. Lancet. Infectious Diseases. 7 (9), 581-596 (2007).
  4. Kaye, P., Scott, P. Leishmaniasis: complexity at the host-pathogen interface. Nature Reviews. Microbiology. 9 (8), 604-615 (2011).
  5. Handman, E., Bullen, D. V. Interaction of Leishmania with the host macrophage. Trends in Parasitology. 18 (8), 332-334 (2002).
  6. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  7. Kamhawi, S. Phlebotomine sand flies and Leishmania parasites: friends or foes. Trends in Parasitology. 22 (9), 439-445 (2006).
  8. Guilliams, M., et al. Unsupervised high-dimensional analysis aligns dendritic cells across tissues and species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  9. Moll, H. Dendritic cells and host resistance to infection. Cellular Microbiology. 5 (8), 493-500 (2003).
  10. Sundquist, M., Rydstrom, A., Wick, M. J. Immunity to Salmonella from a dendritic point of view. Cellular Microbiology. 6 (1), 1-11 (2004).
  11. Saban, D. The chemokine receptor CCR7 expressed by dendritic cells: A key player in corneal and ocular surface inflammation. Ocular Surface Journal. 12, 87-99 (2014).
  12. Relloso, M., et al. DC-SIGN (CD209) Expression is IL-4 dependent and it is negatively regulated by IFN, TGF and inflammatory agents. Journal of Immunology. 168 (6), 2634-2643 (2002).
  13. Leon, B., Lopez-Bravo, M., Ardavin, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  14. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  15. Ashok, D., Acha-Orbea, H. Timing is everything: dendritic cell subsets in murine Leishmania infection. Trends in Parasitology. 30 (10), 499-507 (2014).
  16. Carvalho, A. K., et al. Leishmania (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis promote differential expression of dendritic cells and cellular immune response in murine model. Parasite Immunology. 34 (8-9), 395-403 (2012).
  17. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  18. Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (8), 3012-3017 (2012).
  19. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1263-1272 (1994).
  20. Suzuki, H., et al. Activities of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 on monocytes. American Journal of Hematology. 75 (4), 179-189 (2004).
  21. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews. Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  22. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 1795(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MHC II
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة