Method Article

الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي. يمكن ل MMC زراعة الكائنات الحية الدقيقة وزراعتها بشكل تلقائي ومستمر ومراقبة نموها عبر الإنترنت بإنتاجية عالية نسبيا وتوازي جيد ، مما يقلل من استهلاك العمالة والكواشف.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما يكون لطرق زراعة الميكروبات التقليدية عمليات مرهقة ، وإنتاجية منخفضة ، وكفاءة منخفضة ، واستهلاك كبير للعمالة والكواشف. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الزراعة عالية الإنتاجية القائمة على الصفائح الدقيقة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة لها حالة نمو ميكروبية ضعيفة وتوازي تجريبي بسبب انخفاض الأكسجين المذاب، وضعف الخليط، والتبخر الشديد والتأثير الحراري. نظرا للعديد من مزايا القطرات الدقيقة ، مثل الحجم الصغير ، والإنتاجية العالية ، والقدرة القوية على التحكم ، يمكن لتقنية الموائع الدقيقة القائمة على القطرات التغلب على هذه المشكلات ، والتي تم استخدامها في العديد من أنواع الأبحاث حول زراعة الميكروبات عالية الإنتاجية وفحصها وتطورها. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات السابقة في مرحلة بناء المختبرات وتطبيقها. بعض القضايا الرئيسية ، مثل المتطلبات التشغيلية العالية ، وصعوبة البناء العالية ، ونقص تكنولوجيا التكامل الآلي ، تحد من التطبيق الواسع لتكنولوجيا الموائع الدقيقة بالقطرات في البحوث الميكروبية. هنا ، تم تطوير نظام آلي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقة للقطرات ، مما يحقق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والمراقبة عبر الإنترنت والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. في هذا البروتوكول ، تم أخذ الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 وسلالة E. coli الأساسية للميثانول (MeSV2.2) كأمثلة لتقديم كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية وعالية الإنتاجية نسبيا والتطور التكيفي بالتفصيل. هذه الطريقة سهلة التشغيل ، وتستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولها إنتاجية تجريبية عالية وتوازي جيد للبيانات ، والتي تتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وصديقة للعمليات وموثوقة النتائج للباحثين العلميين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الزراعة الميكروبية أساسا مهما للبحث العلمي الميكروبيولوجي والتطبيقات الصناعية ، والتي تستخدم على نطاق واسع في عزل وتحديد وإعادة بناء وفحص وتطور الكائنات الحية الدقيقة1،2،3. تستخدم طرق الزراعة الميكروبية التقليدية بشكل أساسي أنابيب الاختبار ، وقوارير الاهتزاز ، والألواح الصلبة كحاويات زراعة ، إلى جانب حاضنات الاهتزاز ، وأجهزة قياس الطيف الضوئي ، وقارئات الصفائح الدقيقة ، وغيرها من المعدات للزراعة الميكروبية والكشف عنها وفحصها. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لديها العديد من المشاكل ، مثل العمليات المرهقة ، والإنتاجية المنخفضة ، والكفاءة المنخفضة ، والاستهلاك الكبير للعمالة والكواشف. تعتمد طرق الزراعة عالية الإنتاجية التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة بشكل أساسي على الصفائح الدقيقة. لكن الصفيحة الدقيقة لديها مستوى منخفض من الأكسجين المذاب ، وخاصية خلط ضعيفة ، وتبخر شديد وتأثير حراري ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى ضعف حالة النمو وتجربة توازي الكائنات الحية الدقيقة4،5،6،7 ؛ من ناحية أخرى ، يجب أن تكون مجهزة بمعدات باهظة الثمن ، مثل محطات العمل التي تتعامل مع السوائل وأجهزة قراءة الصفائح الدقيقة ، لتحقيق الزراعة الآلية والكشف عن العملية 8,9.

كفرع مهم من تكنولوجيا الموائع الدقيقة ، تم تطوير الموائع الدقيقة بالقطيرات في السنوات الأخيرة بناء على أنظمة الموائع الدقيقة التقليدية ذات التدفق المستمر. إنها تقنية ميكروفلويديك منفصلة التدفق تستخدم مرحلتين سائلتين غير قابلتين للامتزاج (عادة ما يكون الزيت والماء) لتوليد قطرات صغيرة مشتتة والعمل عليها10. نظرا لأن القطرات الدقيقة لها خصائص الحجم الصغير ، ومساحة السطح المحددة الكبيرة ، وارتفاع معدل نقل الكتلة الداخلية ، وعدم وجود تلوث متقاطع ناتج عن التقسيم ، ومزايا التحكم القوي والإنتاجية العالية للقطرات ، فقد كانت هناك أنواع كثيرة من الأبحاث التي تطبق تقنية الموائع الدقيقة للقطرات في زراعة الكائنات الحية الدقيقة وفحصها وتطورهاعالية الإنتاجية 11 . ومع ذلك ، لا تزال هناك سلسلة من القضايا الرئيسية لجعل تكنولوجيا الموائع الدقيقة القطيرات شائعة وتطبق على نطاق واسع. أولا ، يعد تشغيل الموائع الدقيقة بالرذاذ مرهقا ومعقدا ، مما يؤدي إلى متطلبات تقنية عالية للمشغلين. ثانيا ، تجمع تقنية الموائع الدقيقة بالقطرات بين المكونات البصرية والميكانيكية والكهربائية ويجب أن ترتبط بسيناريوهات تطبيق التكنولوجيا الحيوية. من الصعب على مختبر واحد أو فريق واحد بناء أنظمة فعالة للتحكم في الموائع الدقيقة بالقطرات إذا لم يكن هناك تعاون متعدد التخصصات. ثالثا ، نظرا لصغر حجم القطرات الدقيقة (من بيكوليتر (pL) إلى ميكرولتر (μL)) ، يتطلب الأمر صعوبة كبيرة لتحقيق التحكم الآلي الدقيق والكشف الفوري عبر الإنترنت عن القطرات لبعض العمليات الميكروبية الأساسية مثل الزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات ، ومن الصعب أيضا بناء نظام معدات متكامل12.

من أجل معالجة المشاكل المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام تلقائي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقةللقطرات 13. يتكون MMC من أربع وحدات وظيفية: وحدة التعرف على القطرات ، ووحدة الكشف عن طيف القطرات ، ووحدة رقاقة الموائع الدقيقة ، ووحدة أخذ العينات. من خلال تكامل النظام والتحكم في جميع الوحدات ، يتم إنشاء نظام التشغيل الآلي بما في ذلك التوليد والزراعة والقياس (الكثافة البصرية (OD) والتألق) ، والانقسام ، والانصهار ، وفرز القطرات بدقة ، وتحقيق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والرصد والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. يمكن أن تستوعب MMC ما يصل إلى 200 وحدة زراعة قطرات مكررة بحجم 2-3 ميكرولتر ، وهو ما يعادل 200 وحدة زراعة قارورة اهتزاز. يمكن لنظام زراعة القطرات الدقيقة تلبية متطلبات عدم التلوث والأكسجين المذاب والخلط وتبادل الطاقة الكتلية أثناء نمو الكائنات الحية الدقيقة ، وتلبية الاحتياجات المختلفة للبحوث الميكروبية من خلال وظائف متكاملة متعددة ، على سبيل المثال ، قياس منحنى النمو ، والتطور التكيفي ، والتحليل متعدد المستويات أحادي العامل ، وأبحاث وتحليل الأيض (استنادا إلى الكشف عن التألق)13،14.

هنا ، يقدم البروتوكول كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الآلية والميكروبية والتطور التكيفي بالتفصيل (الشكل 1). أخذنا الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 كمثال لإثبات قياس منحنى النمو وسلالة E. coli الأساسية للميثانول MeSV2.215 لإثبات التطور التكيفي في MMC. تم تطوير برنامج تشغيل ل MMC ، مما يجعل العملية بسيطة وواضحة للغاية. في العملية برمتها ، يحتاج المستخدم إلى إعداد محلول البكتيريا الأولي ، وتعيين شروط MMC ، ثم حقن محلول البكتيريا والكواشف ذات الصلة في MMC. في وقت لاحق ، ستقوم MMC تلقائيا بتنفيذ عمليات مثل توليد القطرات ، والتعرف عليها وترقيمها ، والزراعة ، والتطور التكيفي. كما سيقوم بإجراء الكشف عبر الإنترنت (OD والتألق) للقطرات بدقة زمنية عالية وعرض البيانات ذات الصلة (التي يمكن تصديرها) في البرنامج. يمكن للمشغل إيقاف عملية الزراعة في أي وقت وفقا للنتائج واستخراج القطرات المستهدفة للتجارب اللاحقة. إن MMC سهل التشغيل ، ويستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولديه إنتاجية تجريبية عالية نسبيا وتوازي جيد للبيانات ، مما يتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل وقوية للباحثين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تركيب الأدوات والبرامج

  1. اختر بيئة نظيفة ومعقمة (مثل مقعد نظيف) كمساحة دائمة مخصصة ل MMC. تثبيت MMC بثبات في الفضاء.
    ملاحظة: حافظ على MMC بعيدا عن تداخل المجالات الكهربائية القوية والمجالات المغناطيسية ومصادر الإشعاع الحراري القوية. تجنب الاهتزاز الشديد من التأثير على مكونات الكشف البصري. توفير مصدر الطاقة AC220 فولت ، 50 هرتز إلى MMC. للحصول على تفاصيل حول MMC ، راجع جدول المواد والموقع الإلكتروني الخاص ب MMC16.
  2. تثبيت برنامج التشغيل من ملف MMC.zip
    ملاحظة: اتصل بالمؤلفين للحصول على ملف MMC.zip.
    1. قم بإنشاء مجلد مخصص واحفظ الملف المضغوط فيه.
    2. قم بإنشاء مجلد مخصص آخر باسم "دليل التثبيت". قم بفك ضغط MMC .zip واحفظ الملفات في المجلد الجديد.
      ملاحظة: تكوين الكمبيوتر هو الأفضل لتلبية ما يلي: (1) نظام التشغيل Windows 7 64 بت أو أعلى; (2) وحدة المعالجة المركزية: i5 أو أعلى؛ (3) الذاكرة: 4 غيغابايت أو أعلى؛ (4) القرص الثابت: 300 غيغابايت أو أعلى (سرعة دوران أكبر من 7200 دورة في الدقيقة أو قرص الحالة الصلبة).

2. التحضيرات

  1. قم بتوصيل إبرة المحقنة (القطر الداخلي 0.41 مم والقطر الخارجي 0.71 مم) ، الموصل السريع A ، وزجاجة الكاشف (الشكل 2C) ، وأوتوكلافها عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: قم بفك غطاء زجاجة الكاشف قليلا أثناء التعقيم. يمكن تحضير عدد قليل من زجاجات الكاشف في كل مرة للاستخدام.
  2. استخدم مرشح فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) 0.22 ميكرومتر لتصفية زيت MMC. ضع رقاقة الموائع الدقيقة (الشكل 2B) وزيت MMC في المقعد النظيف مقدما وقم بتعقيمهما عن طريق التشعيع فوق البنفسجي لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل الموصل السريع A وزجاجة الكاشف وزيت MMC وشريحة الموائع الدقيقة ، راجع جدول المواد.
  3. تثبيت رقاقة الموائع الدقيقة
    1. افتح باب غرفة العمليات (الشكل 2A) وارفع مسبار الألياف البصرية.
    2. قم بمحاذاة ثقوب المجال الكهربائي مع إبر المجال الكهربائي ووضع الشريحة برفق على قاعدة الرقاقة. ثم أدخل عمودي تحديد المواقع في فتحات تحديد المواقع ووضع مسبار الألياف البصرية (الشكل 2D).
    3. قم بتوصيل الموصل السريع A الموجود على الشريحة بالمنفذ المقابل ل MMC وفقا لرقم الموضع (C5-O5 و C4-O4 و C6-O6 و C2-O2 و CF-OF و C1-O1 و C3-O3). ثم أغلق باب غرفة العمليات.
  4. قم بتجديد زيت MMC (إلى حوالي 80 مل) في زجاجة الزيت وقم بإفراغ سائل النفايات في زجاجة النفايات قبل الاستخدام.
    ملاحظة: عادة ما يكون سائل النفايات نفايات عضوية. يرجى الرجوع إلى القانون واللوائح الإقليمية عند التخلص منها ، رهنا بالتغيير بناء على الإعداد التجريبي.

3. قياس منحنى النمو في MMC

  1. التحضير للمحلول البكتيري الأولي
    1. اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لإعداد لوريا بيرتاني (LB) المتوسطة والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: مكونات وسط LB: كلوريد الصوديوم (10 جم / لتر) ، مستخلص الخميرة (5 جم / لتر) والتريبتون (10 جم / لتر).
    2. أخرج سلالة E. coli MG1655 من مخزون الجلسرين وقم بزراعتها في قارورة اهتزاز سعة 50 مل مع 10 مل من وسط LB في حاضنة تهتز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 5-8 ساعات.
      ملاحظة: يعتمد وقت الزراعة على السلالات المحددة. من الأفضل زراعة السلالة إلى الفترة / المرحلة اللوغاريتمية.
    3. قم بتخفيف محلول E. coli MG1655 المستزرع بوسط طازج إلى OD600 من 0.05-0.1 للحصول على محلول بكتيريا أولي (تحضير حوالي 10 مل).
  2. انقر فوق تهيئة لتهيئة MMC. بعد ظهور واجهة التهيئة ، اضبط درجة حرارة الزراعة على 37 درجة مئوية وقيمة الإشارة الكهروضوئية على 0.6 (الشكل 3A). ستستغرق التهيئة حوالي 20 دقيقة.
  3. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 254 نانومتر) أثناء التهيئة.
  4. حقن محلول البكتيريا الأولي وزيت MMC في زجاجة الكاشف.
    1. أخرج زجاجة كاشف معقمة على المقعد النظيف وشد الغطاء.
    2. استخدم حقنة معقمة سعة 10 مل لحقن 3-5 مل من زيت MMC من إبرة المحقنة في الأنبوب الجانبي. قم بإمالة وتدوير زجاجة الكاشف ببطء لجعل الزيت يتسلل بالكامل إلى الجدار الداخلي.
    3. حقن حوالي 5 مل من محلول البكتيريا الأولي ، ثم املأ زجاجة الكاشف عن طريق حقن 5-7 مل من الزيت مرة أخرى.
    4. اسحب الموصل السريع المستقل A للخارج، وأدخل الموصل السريع A من زجاجة الكاشف في الموصل السريع B لإكمال عملية حقن العينة (الشكل 4A).
  5. انتظر حتى تنتهي التهيئة ثم قم بإيقاف تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 254 نانومتر).
  6. افتح باب غرفة العمليات ، وضع زجاجة الكاشف في الحمام المعدني.
  7. اسحب موصل C2 الخاص بالشريحة والموصل السريع A لزجاجة الكاشف. قم بتوصيل موصل الأنبوب الجانبي لزجاجة الكاشف بموصل C2 وموصل الأنبوب العلوي بموصل O2. ثم أغلق باب غرفة العمليات.
  8. انقر على منحنى النمو لاختيار وظيفة قياس منحنى النمو (الشكل 3A). في واجهة إعداد المعلمة ، أدخل الرقم على أنه 15 ، وقم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD واضبط الطول الموجي على 600 نانومتر. انقر فوق ابدأ لبدء توليد القطيرات. سوف يستغرق حوالي 10 دقائق.
    ملاحظة: هنا ، يشير الرقم إلى عدد القطرات التي سيتم إنشاؤها. يشير الطول الموجي إلى الطول الموجي ل OD المراد اكتشافه. اضبط الرقم (الحد الأقصى 200) والطول الموجي (350-800 نانومتر) وفقا لمتطلبات التجربة.
  9. عندما تظهر نافذة منبثقة على الواجهة الرئيسية تطالب "بإزالة زجاجة الكاشف بين C2 و O2 ، فيرجى النقر فوق الزر موافق ( OK) بعد الانتهاء" ، افتح باب غرفة التشغيل لإخراج زجاجة الكاشف وتوصيل موصلات C2 و O2.
  10. أغلق الباب، وانقر فوق الزر موافق ( OK ) في النافذة المنبثقة لزراعة القطرات تلقائيا واكتشاف قيم OD.
    ملاحظة: يكتشف MMC قيمة OD عندما تمر القطرة بمسبار الألياف البصرية. لذلك ، تعتمد فترة الكشف على عدد القطرات التي تم إنشاؤها.
  11. عندما يصل منحنى النمو إلى المرحلة الثابتة، انقر فوق الزر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD. حدد مسار حفظ البيانات وقم بتصدير قيمة OD المسجلة خلال فترة الزراعة بتنسيق .csv ، والتي يمكن فتحها بواسطة برنامج مناسب (على سبيل المثال ، Microsoft Excel). ثم استخدم برنامج تعيين (على سبيل المثال ، EXCEL و Origin 9.0) لرسم منحنى النمو.
    ملاحظة: أثناء عملية الزراعة ، من الممكن النقر فوق تصدير البيانات في أي وقت لتصدير بيانات OD لجميع القطرات الحالية.

4. التطور التكيفي في MMC

  1. التحضير للمحلول البكتيري الأولي
    1. اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لإعداد الألواح المتوسطة والصلبة السائلة الخاصة ل MeSV2.2 والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: للاطلاع على مكونات الوسيط الخاص، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 وجدول المواد.
    2. قم بزراعة MeSV2.2 باستخدام اللوحة الصلبة (قطرها = 90 مم) في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. ثم اختر مستعمرة مستقلة وقم بزراعتها في قارورة اهتزاز سعة 50 مل مع 10 مل من الوسط السائل الخاص في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
    3. قم بتخفيف محلول MeSV2.2 المستزرع بمتوسط OD600 من 0.1-0.2 (تأكد من أن الحجم الإجمالي لا يقل عن 10 مل) واستمر في زراعته في قارورة الاهتزاز لمدة 5 ساعات للحصول على محلول البكتيريا الأولي.
      ملاحظة: MeSV2.2 هي سلالة E. coli أساسية من الميثانول. يحتوي الوسط السائل الخاص على 500 مليمول / لتر من الميثانول ، وهو إجهاد قوي ل MeSV2.2 ، مما يؤدي إلى نمو بطيء للغاية. لاحظ أن الحصول على محلول البكتيريا الأولي هنا يختلف عن ذلك الموضح في الخطوة 3.1.
  2. تهيئة MMC كما هو موضح في الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.5.
  3. أخرج زجاجتين من الكاشف المعقم ، أحدهما لمحلول البكتيريا الأولي والآخر للوسط الطازج. حقن محلول البكتيريا الأولي (5 مل) ، والوسط الطازج (12-15 مل) ، وزيت MMC في زجاجات الكاشف كما هو موضح في الخطوة 3.4.
    ملاحظة: بما أن التطور التكيفي هو عملية طويلة الأجل تنطوي على زراعة فرعية متعددة ، قم بتخزين أكبر قدر ممكن من الوسائط الطازجة في MMC. لا يمكن تجديد الوسيط أثناء تشغيل التجربة.
  4. قم بتثبيت زجاجتي الكاشف في MMC كما هو موضح في الخطوة 3.6. قم بتثبيت واحد لمحلول البكتيريا الأولي بين موصل C2 و O2 والآخر للوسط الطازج بين موصل C4 و O4.
  5. انقر على ALE لاختيار وظيفة التطور التكيفي (الشكل 3B). في واجهة إعداد المعلمة، قم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD .
  6. اضبط الرقم على أنه 50، والطول الموجي على أنه 600 نانومتر، والتركيز على أنه 0٪، واكتب كوقت، والمعلمة على أنها 30 ساعة، والتكرار على أنه 99. انقر فوق ابدأ لبدء توليد القطيرات. سوف يستغرق حوالي 25 دقيقة.
    ملاحظة: هنا ، يشير "التركيز" إلى الحد الأقصى لتركيز العوامل الكيميائية للتطور التكيفي. بالنسبة للقطرات المختلفة ، يمكن تحقيقها في MMC لإدخال تركيزات مختلفة من العوامل الكيميائية لتوفير ظروف نمو مختلفة. احسب التركيزات المقدمة باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-1
    هنا يشير "C" إلى تركيز العوامل الكيميائية التي يتم إدخالها في القطرات. تشير "أ" إلى تركيز العوامل الكيميائية في زجاجات الكواشف بين الموصل C4 و O4 ؛ يشير الحرف "ب" إلى تركيز العوامل الكيميائية في زجاجات الكواشف بين الموصل C6 و O6 ؛ ويشير "i" إلى التركيز المتاح. هناك ثمانية تركيزات متاحة في MMC. نظرا لأن العامل الكيميائي هنا يحتوي على تركيز واحد (500 مليمول / لتر ميثانول) وهو أحد مكونات الوسط ، يتم تثبيت زجاجة كاشف واحدة فقط تحتوي على العامل الكيميائي هنا ، ويتم تعيين التركيز على 0٪. يشير النوع إلى وضع الزراعة الفرعية ، والذي ينقسم إلى ثلاثة أنواع: الوضع الزمني ، ووضع قيمة OD ، ووضع التألق. الأول يعني زراعة القطرات لفترة محددة ثم زراعتها دون المستوى ، في حين أن الأخيرين يعنيان زراعة القطرات لقيمة OD المحددة مسبقا / كثافة التألق ثم زراعتها الفرعية. تشير المعلمة إلى المعلمة ذات الصلة المطلوبة عند اختيار وضع الزراعة الفرعية. يشير التكرار إلى عدد الزراعات الفرعية.
  7. قم بإزالة زجاجة الكاشف الموضوعة بين موصل C2 و O2 كما هو موضح في الخطوة 3.8.
  8. لاحظ ما إذا كانت القيم القصوى ل OD للقطرات خلال كل فترة زراعة فرعية قد زادت بشكل كبير. في حالة حدوث الزيادة وتلبية متطلبات التجربة ، انقر فوق الزر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD كما هو موضح في الخطوة 3.9.
    ملاحظة: هنا ، تعتمد فترة الزراعة الفرعية على المعلمة. على سبيل المثال ، عند تعيين النوع كوقت والمعلمة على أنها 30 ساعة ، تكون فترة الزراعة الفرعية 30 ساعة. خلال كل فترة زراعة فرعية ، هناك الحد الأقصى لقيم OD للقطرات. تقدير ما إذا كان التطور التكيفي يفي بمتطلبات التجربة من خلال زيادة الحد الأقصى لقيم OD (تعتمد الزيادة على عملية الزراعة الفعلية للسلالة ، على سبيل المثال ، زادت بأكثر من 20٪).
    تنبيه: انتبه إلى ما إذا كان الوسط الطازج المخزن قد استنفد. إذا لم تحدث الزيادة الكبيرة حتى بعد استنفاد الوسط ، فاستخرج القطرات الأفضل نموا وقم بإجراء جولة جديدة من التطور التكيفي.
  9. استخراج قطرات الهدف من MMC.
    1. انقر على زر الفحص لاختيار وظيفة استخراج القطيرات (الشكل 3C). اختر خيار التجميع ، وانقر فوق عدد القطرات المستهدفة ، ثم انقر فوق موافق.
      ملاحظة: يشمل فحص القطرات "جمع" و "تجاهل" و "استخراج محلول البذور". "استخراج محلول البذور" يعني جمع القطرات المتبقية13 بعد عملية الزراعة الفرعية.
    2. انتظر حتى تطالب النافذة المنبثقة ، "يرجى سحب الموصل السريع CF ووضعه في أنبوب EP". ضع الموصل السريع CF في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للجمع وفقا لموجه البرنامج ثم انقر فوق OK (الشكل 4D).
    3. بعد 1-2 دقيقة ، ستظهر واجهة البرنامج نافذة جديدة تطالب ، "يرجى إدخال الموصل مرة أخرى والنقر فوق موافق إذا انتهى". ثم أدخل موصل CF السريع مرة أخرى وانقر فوق موافق لجعل MMC يستمر في التشغيل (الشكل 4D). عندما تصل القطرة المستهدفة التالية إلى موقع التعرف على القطرات ، كرر 4.9.2-4.9.3 لجمعها.
      ملاحظة: بعد جمع جميع القطرات المستهدفة ، ستواصل MMC زراعة القطرات المتبقية. إذا لم تكن الزراعة ضرورية ، فانقر فوق إيقاف لإنهاء العملية مباشرة.
    4. استخرج القطيرة باستخدام ماصة 2.5 ميكرولتر ، وأسقطها على لوحة الأغاروز مقاس 90 مم ، وانشرها بالتساوي باستخدام قضيب نشر زجاجي مثلث بطول ضلع يبلغ 3 سم. ثم قم بزراعته في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
    5. اختر 3-5 مستعمرات مستقلة وقم بزراعتها بشكل منفصل في قوارير الاهتزاز سعة 50 مل مع 10 مل من الوسط الطازج في حاضنة تهتز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة. اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لتخزين محلول البكتيريا المستزرعة في أنبوب الجلسرين للتجارب اللاحقة.

5. نظيفة من MMC

  1. بعد الانتهاء من التجربة ، انقر فوق إيقاف لإيقاف جميع العمليات. ثم انقر فوق تنظيف لتنظيف الشريحة والأنابيب. سوف يستغرق حوالي 15 دقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول E. coli MG1655 وسلالة MeSV2.2 كأمثلة لإثبات الزراعة الميكروبية والتطور التكيفي الأساسي للميثانول مع استراتيجية آلية وعالية الإنتاجية نسبيا في MMC. تم استخدام قياس منحنى النمو بشكل رئيسي لتوصيف الزراعة الميكروبية. تم إجراء التطور التكيفي عن طريق الزراعة الفرعية المستمرة الآلية وإضافة تركيز عال من الميثانول كضغط انتقائي خلال كل زراعة فرعية. وقدر ما إذا كان التطور التكيفي قد تحقق من خلال اتجاه التباين في القيمة القصوى للاستنفاد النمطي للقطرات خلال كل فترة زراعة فرعية. ويبين الجدول

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي طويل الأجل. MMC هو نظام زراعة ميكروبية مصغر وآلي وعالي الإنتاجية. بالمقارنة مع طرق وأدوات الزراعة الميكروبية التقليدية عالية الإنتاجية ، تتمتع MMC بالعديد من المزايا مثل انخفاض استهلاك العمالة والكواشف ، والتشغيل البسيط ، والكشف عبر الإنترنت (OD والتألق) ، وجمع البيانات عالية الدقة في الوقت المناسب ، والتوازي الفائق. تتمتع MMC أيضا ببعض المزايا الخاصة المختلفة عن تقنية الموائع الدقيقة التقليدية ،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFA0901500) ، والمشروع الوطني الرئيسي للأدوات والمعدات العلمية التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21627812) ، وبرنامج البحث العلمي لمبادرة جامعة تسينغهوا (20161080108). كما نشكر البروفيسورة جوليا أ. فورهولت (معهد علم الأحياء الدقيقة، قسم علم الأحياء، ETH زيورخ، زيوريخ 8093، سويسرا) على توفير النسخة 2.2 من سلالة الإشريكية القولونية الأساسية من الميثانول (MeSV2.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 & م غشاء مرشح PVDFMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBتعقيم زيت MMC
4 درجة ؛ ثلاجة CHaierBCD-289BSWلتخزين الكاشف
AgarBecton و Dickinson and Company214010لإعداد اللوحة الصلبة
CaCl2< / sub> & middot ؛ 2H2OSinopharm الكاشف الكيميائي بكين المحدودة20011160مكون الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
مقعد نظيفبكين دونجليان هار تصنيع الصك المحدودةDL-CJ-INDIIللتشغيل المعقم والتعقيم بالأشعة فوق البنفسجية
CoCl2< / sub> & middot ؛ 6H2< / sub>OSinopharm الكاشف الكيميائي بكين المحدودة10007216مكون من الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
الكمبيوترLenovoE450تركيب البرمجيات والتحكم في MMC
حاضنة درجة حرارة ثابتةشنغهاي qixin أداة علمية ، LTDLRH 250للزراعة الميكروبية باستخدام المتوسط
الصلب CuSO4< / sub>& middot ؛ 5H2< / sub>Oكاشف سينوفارم الكيميائي بكين المحدودة10008218مكون من الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
الميزان الإلكترونيOHAUSAR 3130لوزن الكاشف
أنبوب EPThermo Fisher1.5 مللجمع القطرات
FeCl 3 < / sub > middot ؛ 6H2< / sub>OSinopharm الكاشف الكيميائي بكين المحدودة10011928مكون من الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
أنبوب التجميدثيرمو فيشر2.0 ملللحفاظ على السلالة
GluconateSigma-AldrichS2054مكون من الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
الجلسرينالعامG66258Aللحفاظ على الإجهاد
وعاء التعقيم بالبخار عالي الضغطSANYO MLS3020للتعقيم المعقم
بالأيزوبروبيل - & beta ؛ -d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotop420322مكون من الوسط الخاص ل MeSV2.2.
كبريتات كاناميسينSolarbioK8020مكون من الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINمكون P815661للوسيط الخاص ل MeSV2.2.
الميثانولMACKLINM813895مكون من الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
MgSO4& middot; 7H2OBIOBYING1305715مكون من الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC)Luoyang TMAXTREE التكنولوجيا الحيوية المحدودة  MMC-Iأداء تحديد منحنى النمو والتطور التكيفي. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
رقاقة MicrofluidicLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co.، Ltd.MMC-ALE-ODلعمليات القطرات المختلفة. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co.، Ltd.MMC-M / S-ODمرحلة الزيت للموائع الدقيقة بالقطرات. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.20026118مكون الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
كلوريد الصوديومالعام G81793Jمكون من LB المتوسط
Na2HPO4· 12H2Oالكاشف العامللوسيط الخاص ل MeSV2.2.
NH4< / sub>ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co.، Ltd.10001518مكون الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
طبق بتريكورنينج إنكوربوريتد90 مملتحضير ماصة صلبة متوسطة
eppendorf2.5 & L ، 10 مو ؛ لتر ، 100 مو ؛ لتر ، 1000 مو ؛ Lلمناولة السوائل
موصل سريع ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co.، Ltd.و [مدش]لتوصيل كل مفصل. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
زجاجة الكاشفLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co.، Ltd.أخذ عينات MMC-PCBوتخزين محلول البكتيريا والكواشف. يرجى الرجوع إلى http://www.tmaxtree.com/en/
هز قارورةUnion-Biotech50 ملللزراعة الميكروبية
حاضنة اهتزازShanghai Sukun Industrial Co.، Ltd.SKY-210 2Bللزراعة الميكروبية في قارورة الاهتزاز
كبريتات الستربتومايسينSolarbioS8290مكون الوسط الخاص ل MeSV2.2.
حقنةJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO.، LTD10 ملاسحب السائل وحقنه في زجاجة الكاشف
إبرة حقنةOUBEL Hardware Store22Gالقطر الداخلي 0.41 مم والقطر الخارجي 0.71 مم.
التريبتونأوكسويد المحدودةLP0042مكون من الثلاجة ذات
درجة الحرارة المنخفضةLB SANYO MDF-U4086S منخفض للغايةللحفاظ على الإجهاد (-80 درجة ؛ ج)
الأشعة فوق البنفسجية &ndash ؛ مقياس الطيف الضوئي Visشركة جنرال إلكتريكUltrospec 3100 proلقياس قيم OD
فيتامين B1SolarbioSV8080مكون الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
مستخلص الخميرةOxoid المحدودةLP0021مكون LB المتوسط
ZnSO4· 7H2OSinopharm الكاشف الكيميائي بكين المحدودة10024018مكون الوسيط الخاص ل MeSV2.2.
كاشف مكون G10267B للغاية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles