Method Article

عمليات الاستئصال العميقة والتحكم المكانية في الحجم باستخدام مجهر فوتونين في زيبرافيش غاسترولا

DOI:

10.3791/62815

⸱

July 15th, 2021

 ,  , 
1Laboratory for Optics and Biosciences, CNRS UMR7645, INSERM U1182, Institut Polytechnique de Paris

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب التطور الجنيني تنسيقا واسع النطاق لحركة الخلية. يسمح الإثارة ثنائية الفوتونيز بالاجتثاث بالليزر بوساطة الاستئصال ثلاثي الأبعاد الذي يتم التحكم فيه مكانيا لمجموعات كبيرة من الخلايا العميقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية التحقيق في رد فعل الخلايا المهاجرة بشكل جماعي في الجسم الحي للاضطرابات في بيئتها الميكانيكية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مورفوجينيسيس ينطوي على العديد من حركات الخلايا لتنظيم الخلايا في الأنسجة والأعضاء. ومن أجل التنمية السليمة، يجب تنسيق جميع هذه الحركات بإحكام، وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن ذلك يتحقق، على الأقل جزئيا، من خلال التفاعلات الميكانيكية. اختبار هذا في الجنين يتطلب الاضطرابات الجسدية المباشرة. الاستئصال بالليزر هي خيار يستخدم بشكل متزايد الذي يسمح بتخفيف القيود الميكانيكية أو عزل جسديا اثنين من مجموعات الخلايا من بعضها البعض. ومع ذلك ، يتم إجراء العديد من عمليات الاستئصال باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية (UV) ، والذي يوفر دقة محورية محدودة واختراق الأنسجة. يتم وصف طريقة هنا ل ablate عميقة، كبيرة، وأحجام محددة بشكل جيد مكانيا باستخدام المجهر اثنين الفوتون. يتم عرض الاستئصالات في خط حمار وحشي معدل وراثيا يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في mesendoderm المحوري ويستخدم لقطع mesendoderm المحوري دون التأثير على ectoderm المفرط أو خلية الصفار الأساسية. يتم مراقبة سلوك الخلية عن طريق التصوير الحي قبل وبعد الاستئصال. يمكن استخدام بروتوكول الاستئصال في مراحل نمو مختلفة، على أي نوع من الخلايا أو الأنسجة، على نطاقات تتراوح بين بضعة ميكرونات إلى أكثر من مائة ميكرون.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب التفاعلات بين الخلية والخلية أدوارا حيوية في التنمية. توفر الخلايا إشارات يمكن لجيرانها المباشرين، أو الخلايا البعيدة، إدراكها، وبالتالي التأثير على مصيرهم و/أو سلوكهم. العديد من هذه الإشارات هي كيميائية في طبيعتها. على سبيل المثال، في أحداث التعريفية ذات الخصائص الجيدة، تنتج مجموعة خلايا واحدة جزيئات قابلة للنشر تؤثر على مصير مجموعة خلايا أخرى1. غير أن الإشارات الأخرى ميكانيكية؛ الخلايا تمارس القوات والقيود على جيرانهم، والتي يرى الجيران والرد على2.

إحدى الطرق لدراسة أهمية هذه التفاعلات بين الخلية والخلية في الجسم الحي هي القضاء على بعض الخلايا ومراقبة التطور اللاحق. لسوء الحظ، ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل اللجنة الأخلاقية N 59 وMinistère de l'Education Nationale، دي L'Enseignement Supérieur et la Recherche تحت رقم الملف APAFIS#15859-2018051710341011v3. بعض الخطوات المذكورة أدناه محددة لمعداتنا وبرامجنا ولكن يمكن تكييفها بسهولة مع المعدات المختلفة.

1. إعداد الحقن

  1. إعداد 75 مل من محلول الآغاروز 1٪ في الجنين المتوسط (EM).
  2. وضع قالب حقن في طبق بيتري 90 ملم وتصب ما يقرب من 50 مل من الآجروز، وهو ما يكفي لقالب لتعويم. دع الآغاروز يترسخ ويزيل قالب الحقن.
  3. إعداد طبق مغلفة agarose عن طريق صب 1 مل من الآغاروز في طبق بيتري 30 ملم.
  4. إعداد 4 ميكرولتر من 30 نانوغرام / μL His....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقطع بولستر في وسطه، تم تركيب جنين Tg (gsc:GFP)، الذي تم حقنه مع الهستون2B-mCherry mRNAs في مرحلة epiboly 70٪، كما هو موضح في الخطوة 4. تم التعرف على بولستر بواسطة التعبير GFP، وتم تركيب الجنين بحيث يكون مستوى بولستر عموديا على المحور البصري (الشكل 1B). إن إمالة الجنين بعيدا عن هذا الوضع سوف تعقد الإجراء. يجب أن يمر الضوء عبر المزيد من الأنسجة للوصول إلى طائرات الاستئصال ، وسيتم إمالة طائرات الاستئصال بالنسبة إلى الفؤوس الجنينية. بعد التحقق من أن جميع نواة الخلية وصفت بشكل صحيح، تم .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقوم بوصف بروتوكول يستخدم البصريات غير الخطية لإجراء عمليات استئصال حجم عميقة ومحددة مكانيا. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي العثور على ظروف العلاج التي توفر الطاقة الكافية للسماح بالاجتثاث ، ولكن ليس الكثير من الطاقة ، لتجنب الحطام المفرط أو التجويف. تعتمد كمية الطاقة المسلمة في الموقع المستهدف بشكل رئيسي على: (1) قوة مخرج الليزر ، (2) جودة محاذاة الليزر ، (3) طبيعة الأنسجة التي يمر من خلالها الضوء للوصول إلى مستوى الاستئصال ، (4) عمق مستوى الاستئصال. لذلك، قبل كل تجربة، من المهم قياس قوة الخروج بالليزر، وضبطه.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر إيميلي مينانت على رعاية الأسماك، ومرفق التصوير الحيوي للفنون التطبيقية، ولا سيما بيير ماهو، للمساعدة في التصوير الحي على معداتهم بدعم جزئي من ريجيون إيل دو فرانس (interDIM) ووكالة الأنباء الوطنية دي لا ريشرش (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2، ANR-10-INBS-04 France BioImaging). وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح ANR 15-CE13-0016-1، 18-CE13-0024، 20-CE13-0016، وبرنامج الاتحاد الأوروبي لأفق 2020 للبحث والابتكار بموجب اتفاق منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 840201، ومينيستير دي L'Enseignement Supérieur et de la Recherche والمركز الوطني للبحوث العلمية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
هدف الغمر في الماء 25xOlympusXLPLN25XWMP2
AgarosePanReac AppliChemA8963،0500
برنامج تحليل البيانات: MatlabMath Works
Electro-optic modulator (EOM)ConOptics350-80LA
Embryo Medium (EM)ويسترفيلد ، م. كتاب سمك الزرد. دليل للاستخدام المختبري لأسماك الزرد (Danio rerio) ، الطبعة الخامسة. مطبعة جامعة أوريغون ، يوجين (كتاب). (2000).
غرفة الغرفة البيئيةOkolabH201-T-UNIT-BL
EOM سائقConOptics302RM
مصدر مضانLumencorSOLA
أطباق قاع زجاجيةMatTekP35G-0-10-C
الشعيرات الدموية الزجاجيةهارفارد300085القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.58 & nbsp ؛ مم
الماصات الزجاجيةVolacD810يجب أن يكون طرف النار مصقول
بالنار ليزر أخضر / استئصالSpectra PhysicsMai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNAتم تصنيعه من pCS2-H2B-mCherry البلازميد (Dumortier & al. 2012)
برنامج تحليل الصور: IMARISBitplane
ImSpector softwareAbberior فريق
حقن العفنأدوات العلوم المساعدةI-34
نصائح MicroloaderEppendorf5242956003
MicromanipulatorNarishigeMN-151
مجتذب الماصات الدقيقةSutterP-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 طقم النسخInvitrogenAM1340
البنسلين ستربتومايسينثيرموفيشر15140-12210 000 وحدة البنسلين و 10 ملغ من الستربتومايسين لكل مل
أنبوب مضاعف ضوئي (PMT)HammamatsuH7422-40
PicoPump (حاقن الهواء)أداة الدقة العالميةPV820
الليزر الأحمرالفيزياءOPO / Insight DeepSee
RNAse مياه خالية للحقنجدول بيانات SigmaW3500
: ExcelMicrosoft
StereomicroscopeNikonSMZ18
Tg(gsc:GFP) خط أسماكDoitsidou، M. et al. توجيه هجرة الخلايا الجرثومية البدائية بواسطة chemokine SDF-1. خلية. 111 (5) ، 647 & - ndash ؛ 59 ، دوي: doi.org/10.1016/S0092-8674 (02) 01135-2 (2002).
مجهر TriM Scope IILa Vision Biotech
تطوير الأدواتأطياف برنامج الزرد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Slack, J. M. W. Embryonic induction. Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).
  2. Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon MicroscopeLaser AblationZebrafish GastrulaVolume AblationLive ImagingAxial MesendodermCell Migration3D Time LapseGFP ImagingMechanical Perturbation

Related Articles