Method Article

تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetics هو أداة قوية مع تطبيقات واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحقيق التعبير الجيني الخفيف في أجنة سمك الحمار الوحشي باستخدام نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظم التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة العمليات البيولوجية. يمكن لأنظمة التعبير البصري أن توفر تحكما دقيقا في توقيت التعبير الجيني وموقعه وسعته باستخدام الضوء كعامل محفز. في هذا البروتوكول، يتم استخدام نظام التعبير البصري لتحقيق التعبير الجيني الخفيف القابل للانزدحام في أجنة حمار وحشي. يعتمد هذا النظام على عامل نسخ هندسي يسمى TAEL استنادا إلى عامل نسخ نشط للضوء بشكل طبيعي من بكتيريا E. litoralis. عندما تضيء مع الضوء الأزرق، TAEL dimerizes، يربط إلى عنصرها التنظيمي cognate يسمى C120، وينشط النسخ. يستخدم هذا البروتوكول أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا تعبر عن عامل نسخ TAEL تحت سيطرة مروج ubb في كل مكان. وفي الوقت نفسه، فإن العنصر التنظيمي C120 يدفع التعبير عن جين المراسل الفلوري (GFP). باستخدام لوحة LED بسيطة لتقديم الضوء الأزرق المنشط ، يمكن أولا اكتشاف تحريض تعبير GFP بعد 30 دقيقة من الإضاءة ويصل إلى ذروة التعريفي أكثر من 130 ضعفا بعد 3 ساعة من العلاج الخفيف. يمكن تقييم تحريض التعبير عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ومجهر الفلورسينس. هذه الطريقة هي نهج متعدد الاستخدامات وسهل الاستخدام للتعبير الجيني البصري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تساعد أنظمة التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك في التحكم في كمية التعبير الجيني وتوقيته وموقعه. ومع ذلك، كان تحقيق السيطرة المكانية والزمنية الدقيقة في الكائنات متعددة الخلايا أمرا صعبا. ويتحقق التحكم الزمني الأكثر شيوعا عن طريق إضافة مركبات جزيء صغير1 أو تفعيل المروجين صدمة الحرارة2. ومع ذلك، فإن كلا النهجين عرضة لقضايا التوقيت، وقوة الحث، والاستجابات الإجهادية خارج الهدف. ويتحقق التحكم المكاني بشكل رئيسي باستخدام المروجين3الخاصين بالأنسجة ، ولكن هذا النهج يتطلب مروجا مناسبا أو عنصرا تنظيميا ، وهو غير متوفر دائما ، ولا يؤدي إلى تحريض مستوى الأنسجة الفرعية.

وعلى النقيض....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا ميرسيد.

1. عبور حمار وحشي وجمع الأجنة

  1. الحفاظ على خطوط حمار وحشي معدلة وراثيا منفصلة تحتوي إما على المنشط النسخ TAEL أو الجين مراسل C120 التي تسيطر عليها للحد من التنشيط زائفة.
  2. عبر 6-8 حمار وحشي الكبار من كل خط باستخدام أساليب قياسية9 لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة التي تحتوي على كل من TAEL و C120 المكونات (الشكل 1B).
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن التعبير عن كلا المكونين بشكل عابر من خلال الميكروينيكشن الحمض النووي مرنا أو البلازميد باستخدام الأساليب القياسية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لهذه المظاهرة ، C120 استجابة GFP خط مراسل (TG (C120F : GFP)ucm107))عبرت مع خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن TAEL - N في كل مكان من ubiquitin ب (ubb) المروج (Tg(ubb:TAEL -N)ucm113))لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحتوي على كلا العنصرين. 24 ساعة بعد الإخصاب، تعرضت الأجنة لتنشيط الضوء الأزرق، نبض على تردد 1 ساعة على / 1 ساعة قبالة. تم تحديد تعريف تعبير GFP كميا بواسطة qRT-PCR عند 30 دقيقة و1 ساعة و3 ح و6 ساعة بعد التنشيط(الشكل 2B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استخدام نظام TAEL/C120 البصري لتحقيق التعبير الجيني الأزرق غير القابل للانخزال. يتكون هذا النظام من منشط النسخ ، TAEL ، الذي يتناقص عند الإضاءة مع الضوء الأزرق وينشط نسخ جين الفائدة في المصب لعنصر تنظيمي C120. يمكن الكشف عن التعبير المستحث لمراسل GFP بعد أقل من 30 دقيقة من التعرض للضوء ، مما يشير إلى أن هذا النهج يمتلك حركية سريعة وسريعة الاستجابة نسبيا.

يمكن أن تؤثر عدة عوامل على مستويات الحث. الأكثر أهمية هي الطول الموجي وقوة تنشيط الضوء. في هذا البروتوكول، تم استخدام 465 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ستيفان ماترنا وأعضاء مختبري وو وماتيرانا على الاقتراحات والتعليقات المفيدة على هذا البروتوكول. نشكر آنا ريد وكيفن غاردنر ولورا موتا مينا على المناقشات القيمة والرؤى أثناء تطوير هذا البروتوكول. وقد دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة؛ R03 DK106358) ولجنة تنسيق أبحاث السرطان بجامعة كاليفورنيا (CRN-20-636896) إلى S.W.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender أداة التوضيح العلمي المستندة إلى الويبBioRenderhttps://biorender.com/
كاميرا رقمية ملونة CCDLumenara755-107
وحدة تحكم مقياس الطاقة والطاقة المدمجة ، مرشح الإثارة LCD الرقمي مقاس 4 بوصاتThorlabsPM100D
، 545 نانومترOlympusET545 / 25x
illustra RNAspin Mini KitGE الرعاية الصحية95017-491
ملح البحر الفوري للمحيطSS15-10
مارس أكوا عكس الضوء 165 واط ضوء حوض السمك LED (أزرق وأبيض)أمازونB017GWDF7E
ميثيل السليلوزسيجما-ألدريتشM7140
NEARPOW مفتاح مؤقت رقمي قابل للبرمجةأمازونB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR مزيج أخضر سريعQuantabio101414-286
فوتوشوب لمعالجة الصور
Adobe Prism الرسوم البيانية والإحصاءبرنامج GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 نظام PCR في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيويةالتطبيقية A28137
المجهر المجسمأوليمبوسSZX16
Tricaine (إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 مصدر ضوء LEDمضان Excelitas010-00326Rتوقف. تم استبداله ب X-Cite mini +
الفوري برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Gene ExpressionLight Induced ExpressionZebrafish EmbryosTAEL C120 SystemGFP ExpressionBlue Light ActivationFluorescence MicroscopyQuantitative PCRInducible Expression SystemTransgenic Zebrafish

Related Articles