تعد المقايسات الآلية باستخدام الصفائح الدقيقة متعددة الآبار طرقا مفيدة لتحديد منظمي المسارات من خلال السماح بتقييم العديد من الظروف في تجربة واحدة. هنا ، قمنا بتكييف بروتوكول التصوير والقياس الكمي الراسخ في macropinosome إلى تنسيق microplate 96-well وتوفير مخطط شامل للأتمتة باستخدام قارئ لوحات متعدد الأوضاع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير والتحليل الآليان لتحديد كمية الماكروبينوسومات الموسومة بالفلورسنت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Macropinocytosis هو مسار امتصاص غير محدد في مرحلة السوائل يسمح للخلايا باستيعاب شحنات كبيرة خارج الخلية ، مثل البروتينات ومسببات الأمراض وحطام الخلايا ، من خلال داء الخلايا الداخلية بالجملة. يلعب هذا المسار دورا أساسيا في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، بما في ذلك تنظيم الاستجابات المناعية واستقلاب الخلايا السرطانية. وبالنظر إلى هذه الأهمية في الوظيفة البيولوجية، فإن فحص ظروف زراعة الخلايا يمكن أن يوفر معلومات قيمة من خلال تحديد المنظمين لهذا المسار وتحسين الظروف لاستخدامها في اكتشاف أساليب علاجية جديدة. تصف الدراسة تقنية تصوير وتحليل آلي باستخدام معدات مختبرية قياسية وقارئ لوحات متعدد الأوضاع لتصوير الخلايا من أجل القياس الكمي السريع لمؤشر الخلايا الكبيرة في الخلايا الملتصقة. تعتمد الطريقة الآلية على امتصاص ديكستران الفلورسنت عالي الوزن الجزيئي ويمكن تطبيقها على 96 لوحة دقيقة لتسهيل تقييمات الظروف المتعددة في تجربة واحدة أو عينات ثابتة مثبتة على أغطية زجاجية. ويهدف هذا النهج إلى زيادة قابلية التكرار إلى أقصى حد والحد من التباين التجريبي مع توفير الوقت والفعالية من حيث التكلفة.
المقدمة
يسمح المسار الداخلي غير المحدد لندرة الخلايا الكبيرة للخلايا باستيعاب مجموعة متنوعة من المكونات خارج الخلية، بما في ذلك العناصر الغذائية والبروتينات والمستضدات ومسببات الأمراض، من خلال الامتصاص الأكبر للسوائل خارج الخلية ومكوناتها1. على الرغم من أهميته لبيولوجيا العديد من أنواع الخلايا، إلا أنه يوصف بشكل متزايد مسار زيادة عدد الخلايا الكبيرة بأنه يلعب دورا أساسيا في بيولوجيا الورم، حيث، من خلال امتصاص الخلايا السرطانية الكبيرة، تكون قادرة على البقاء والتكاثر في وجود بيئة دقيقة مستنفدة للمغذيات2،3. يوفر امتصاص الجزيئات الكبيرة خارج الخلية ، بما في ذلك الألبومين والمصفوفة خارج الخلية ، وح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد المواد
- قم بإذابة 70 كيلو دالتون ديكستران الموسوم ب FITC أو رباعي ميثيل الرودامين (TMR) في PBS للحصول على محلول 20 ملغم / مل. تخزين aliquots في -20 درجة مئوية.
- قم بإذابة DAPI في ddH2O للحصول على محلول 1 ملغم / مل. تخزين aliquots في -20 درجة مئوية.
تحذير: DAPI هو مادة مسرطنة محتملة ويجب التعامل معه بعناية. - في يوم التثبيت ، قم بإعداد الفورمالديهايد الطازج بنسبة 3.7٪ من درجة ACS في PBS.
تحذير: الفورمالديهايد هو مادة مسرطنة مثبتة ومعروفة وسامة إذا تم استنشاقها. اصنع المحلول في غطاء دخان كيميائي لتجنب الاستنشاق والتعامل معه بعناية. - تحضير الأغطية المغسولة بالحمض.
- استخدم دورقا بسعة 500 مل وحمام مائي لتس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عندما يتم اتباع خطوات وتعديل البروتوكول الموصوف أعلاه وفقا لذلك ، يجب أن توفر النتائج التجريبية النهائية معلومات حول ما إذا كانت ظروف زراعة الخلايا المدروسة أو مثبطات تحفز أو تقلل من ندرة الخلايا الكبيرة في خط اهتمام الخلية. ولتعزيز صحة هذه النتائج، سيسمح إدراج شروط التحكم بالتدقيق في النتائج لتحديد ما إذا كانت التجربة قد اكتملت بنجاح. ستوفر ضوابط تحريض كثرة الخلايا الماكروبينية معلومات حول المستوى النسبي لندرة الخلايا الكبيرة. لهذا الغرض ، يتم استخدام ligand EGF بشكل شائع 13. في خلايا AsPC-1 PDAC.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعتمد جودة التجارب والحصول على البيانات بشكل كبير على جودة الكواشف ، وتحسين الإعدادات ، ونظافة الأغطية والألواح الدقيقة. وينبغي أن تعطي النتائج النهائية الحد الأدنى من التباين بين النسخ المتماثلة؛ ومع ذلك ، فإن الاختلافات البيولوجية تحدث بشكل طبيعي أو قد تكون ناجمة عن عدد من العوامل. قد تتسبب كثافة الخلايا في استجابة الخلايا بشكل أو بآخر لمحفزات أو مثبطات كثرة الخلايا الكبيرة. لذلك ، من الأهمية بمكان الالتزام بالالتقاء بنسبة 80٪ كما هو مقترح هنا في البروتوكول. بدلا من ذلك ، يتم توثيقه جيدا من قبل الشركات المصنعة للصفائح .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
C.C. هو مخترع على براءة اختراع صادرة بعنوان "تشخيص السرطان والعلاجات واكتشاف الأدوية المرتبطة ب macropinocytosis" ، براءة الاختراع رقم: 9,983,194.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح NIH / NCI (R01CA207189 ، R21CA243701) إلى C.C. KMO.G. حاصل على جائزة زمالة ما بعد الدكتوراه TRDRP (T30FT0952). BioTek Cytation 5 هو جزء من Sanford Burnham Prebys Cell Imaging Core ، الذي يتلقى دعما ماليا من منحة دعم مركز NCI للسرطان (P30 CA030199). تم إنشاء الأشكال 1-3 باستخدام BioRender.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ تريبسين | كورنينج | 25053CI | 0.1٪ EDTA في HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديوم |
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق | فيشربراند | 05-408-129 | |
| طبق زراعة الأنسجة 10 سم | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي | فيشربراند | 07-200-886 | |
| 2 لتر دورق | فيشربراند | 02-591-33 | |
| 24 بئر لوحة زراعة الأنسجة | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 مل خزان الكاشف | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 مل Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| طبق زراعة الأنسجة 6 سم | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| محول الشفط ذو 8 قنوات | Integra Biosciences | 155503 | |
| محول شفط 8 قنوات للحصول على نصائح قياسية | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95٪ من الإيثانول | Decon Laboratories | Inc 4355226 | |
| منظف الزجاج الخالي من الأمونيا | Sparkle | FUN20500CT | |
| أسود 96 بئر صفيحة دقيقة عالية المحتوى | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| قضيب قطني ذو رؤوس | فيشربراند | 23-400-101 | |
| أغطية | فيشربراند | 12-545-80 | قطر 12 مم |
| قارئ تصوير 5 خلايا متعدد الأوضاع | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine قابل |
| للإصلاحديكستران 70 كيلو دالتون - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | الكالسيوم والمغنيسيوم |
| أدوات العلوم الدقيقة | 11251-20 | دومون # 5 | |
| الفورمالديهايد ، 37٪ | ريكا كيميكال | RSOF0010-250A | ACS كاشف الصف |
| جلسرين | فيشر الكواشف الحيوية | BP229-1 | |
| تصلب وسائط تركيب التألق | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| حمض الهيدروكلوريك (HCl) فيشر | كيميكال | A144-212 | معتمد ACS Plus ، 36.5٪ & ndash ؛ 38.0٪ |
| مناديل خالية من الوبر | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope شرائح | Fisherbrand | 12-544-1 | زجاج عادي ممتاز |
| ماصة متعددة القنوات | جيلسون | FA10013 | 8 قنوات ، 0.5 & 10 وميكرو ؛ L |
| ماصة متعددة القنوات | Gilson | FA10012 | 12 قناة ، 20 & 200 وميكرو ؛ L |
| ماصة متعددة القنوات | جيلسون | FA10011 | 8 قنوات ، 20 & 200 وميكرو ؛ L |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| غلاف بلاستيكي | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Grace Bio Labs Inc | 664107 | قطر 13 مم × 0.8 مم معرف العمق ، 25 مم × 25 مم | |
| محول الشريحة | زجاجة غسيل Biotek | 1220548 | |
| Fisherbrand | FB0340922C |
المراجع
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontier....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
