يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بناء نموذج الأغشية الدهنية دمج G-البروتين إلى جانب المستقبلات (GPCRs)

3.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62830

⸱

فبراير 5, 2022

 ,  , 
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يستخدم هذا البروتوكول تورم الآجاروز كتقنية قوية وقابلة للتعميم لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) في الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة (GUVs) ، كما هو موضح هنا لإعادة تشكيل بروتين مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) ، وهي واحدة من فئات مستقبلات G ذات الأهمية الدوائية المقترنة بالبروتين.

الملخص

كانت التحقيقات القوية في المختبر لهيكل ووظيفة بروتينات الغشاء المتكاملة تحديا بسبب تعقيدات غشاء البلازما والعوامل العديدة التي تؤثر على سلوك البروتين في الخلايا الحية. الحويصلات العملاقة unilamellar (GUVs) هي نظام نموذج محاكاة حيوية وغير قادر للغاية في المختبر للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والغشاء والتحقيق في سلوك البروتين بطريقة دقيقة تعتمد على التحفيز. في هذا البروتوكول, نقدم طريقة غير مكلفة وفعالة لتصنيع GUVs مع مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) متكاملة بشكل ثابت في الغشاء. نحن تصنيع GUVs باستخدام طريقة تورم الهيدروجيل المعدلة; عن طريق إيداع فيلم الدهون على رأس خليط من الآغاروز و 5-HT1AR ومن ثم ترطيب النظام بأكمله، يمكن تشكيل الحويصلات مع موجهة بشكل صحيح والوظيفية 5-HT1AR دمجها في الغشاء. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه GUVs لفحص التفاعلات بين البروتين والأغشية وسلوك التعريب عن طريق المجهر. في نهاية المطاف ، يمكن لهذا البروتوكول تعزيز فهمنا لوظيفة بروتينات الأغشية المتكاملة ، مما يوفر رؤية فسيولوجية عميقة.

المقدمة

الأغشية الاصطناعية النموذجية هي أدوات قوية في التحقيق في الخصائص والوظائف الأساسية للأغشية الحيوية. الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) هي واحدة من أبرز المنصات لدراسة مجموعة متنوعة من خصائص غشاء البلازما ويمكن هندستها لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة1،2،3،4،5،6،7،8. ومن الثابت أن غشاء البلازما وتنظيمه يلعبان دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية، مثل نقل الإشارات، والالتصاق، وداء الغدد الصماء، والنقل9،10،11،12،13،14،15.

وقد تم تصنيع GUVs باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الترطيب لطيف16، تورم الهيدروجيل17، التشكيل الكهربائي18، تقنيات microfluidic19،20،21،22، jetting23، وتبادل المذيبات24،25،26. بسبب التحديات في التعامل مع بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) ، كانت منصات المختبر لمدرستها محدودة. تقدم GUVs منصة مبسطة لدراسة IMPs في بيئة تحاكي بيئتها الأصلية. على الرغم من وجود العديد من النهج لإعادة تشكيل البروتين في GUVs ، تنشأ تحديات من دمج البروتينات مع التوجه الصحيح والحفاظ على وظائف البروتين27.

تتطلب إعادة تشكيل البروتين الأكثر نجاحا في GUVs طريقة تبادل المنظفات؛ الذي ينطوي على solubilizing البروتينات من بيئتها الأصلية من المنظفات، تليها تنقية البروتين، ومن ثم استبدال جزيئات المنظفات مع الدهون من خلال أساليب مختلفة28. في حين أن المنظفات تعمل على تثبيت الهيكل الثالث ل IMPs أثناء التطهير ، فإن ميقات المنظفات هي بيئة غير طبيعية نسبيا لهذه البروتينات ، والتي يتم تثبيتها بشكل أفضل ، خاصة للدراسات الوظيفية ، في ثنائيات الطبقات الدهنية28،29،30. وعلاوة على ذلك، كان من الصعب دمج بروتينات ترانسممبران الوظيفية في طبقة الدهون باستخدام تقنيات تصنيع GUV التقليدية بسبب الحجم، وحساسية هذه البروتينات، وخطوات تبادل المنظفات الإضافية التي ستكون مطلوبة27،31،32،33. استخدام المذيبات العضوية لإزالة المنظفات يسبب تجميع البروتين وإزالة التورينج34. وقد تم تحسين طريقة بوساطة المنظفات واعدة، ومع ذلك، هناك حاجة إلى الحذر لخطوة إزالة المنظفات والتحسين قد تكون هناك حاجة لبروتينات محددة31،35. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحد الطرق التي تستخدم التشكيل الكهربائي من اختيار البروتين وقد لا تكون مناسبة لجميع التراكيب الدهنية وخاصة الدهون المشحونة31,36,37. تقنية أخرى تم استخدامها هي الانصهار الناجم عن الببتيد من الحويصلات الكبيرة unilamellar (LUVs) التي تحتوي على البروتين المطلوب مع GUVs ، على الرغم من أنه وجد أن تكون شاقة ويمكن أن تؤدي إلى إدراج جزيئات غريبة - الببتيدات fusogenic333،38،39. يمكن استخدام الحويصلات العملاقة لغشاء البلازما (GPMVs) ، المشتقة من الخلايا الحية ، للتغلب على بعض هذه القضايا ، ومع ذلك فهي تسمح بالحد الأدنى من التحكم في تكوين الدهون والبروتين الناتج14،40،41. لذلك ، فإن دمج IMPs في طبقة ثنائية الدهون من GUVs باستخدام طريقة تورم الآغروز المعدلة لدينا يقدم طريقة موثوقة لمواصلة فحص هذه البروتينات في بيئة الغشاء42،43،44،45.

الإشارات الخلوية والاتصالات ينطوي على عائلة من البروتينات المعروفة باسم مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs); GPCRs هي من بين أكبر عائلة من البروتينات وترتبط مع تعديل المزاج والشهية وضغط الدم ووظيفة القلب والأوعية الدموية والتنفس والنوم بين العديد من الوظائف الفسيولوجية الأخرى46. في هذه الدراسة, استخدمنا مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) وهو عضو نموذجي في الأسرة GPCR. 5-HT1AR يمكن العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والأوعية الدموية. فإنه يؤثر على العديد من الوظائف مثل القلب والأوعية الدموية، الجهاز الهضمي، وظائف الغدد الصماء، فضلا عن المشاركة في تنظيم mood47. ينشأ حاجز كبير أمام أبحاث GPCR من بنيتها البرمائية المعقدة ، وتوفر GUVs منصة واعدة للتحقيق في الخصائص المختلفة ذات الاهتمام ، بدءا من وظائف البروتين ، والتفاعلات بين البروتين الدهني والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين. وقد استخدمت نهج مختلفة لدراسة التفاعلات بين البروتين الدهني مثل الرنين السطحي البلازمون (SPR)48,49، التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)50,51، تراكب الدهون البروتينية (PLO) المقايسة51,52,53,54، قياس الطيف الكتلي الأصلي55، قياس حراري المعايرة الحرارية (ITC)56,57، والليبوسوم الترسيب المقايسة58,59. وقد استخدم مختبرنا نهج GUV المبسط للتحقيق في تأثير التفاعلات بين البروتين الدهني على وظائف البروتين عن طريق تحفيز BODIPY-GTPοS ، الذي يرتبط مع وحدة Giα الفرعية في الحالة النشطة للمستقبلات. ويفك ربطها الفلوروفور الذي ينتج إشارة مضانة يمكن اكتشافها بمرور الوقت45. وعلاوة على ذلك، حققت دراسات مختلفة في التفاعلات بين البروتين الدهني ودور البروتينات في استشعار أو تثبيت انحناء الأغشية60,61، ويمكن أن يكون استخدام نهج GUV الممكن ميزة رئيسية.

يوضح هذا البروتوكول طريقة مباشرة لدمج GPCRs في غشاء GUVs باستخدام نظام agarose هيدروجيل معدل17,42. وعلاوة على ذلك، واستنادا إلى عملنا السابق، يمكن أن تكون طريقتنا مناسبة لIMPs التي يمكن أن تحمل التعرض على المدى القصير إلى 30-40 درجة مئوية. باختصار، ونحن نشر فيلم رقيقة من الآغاروز جنبا إلى جنب مع شظايا الغشاء التي تحتوي على GPCR من الفائدة. بعد هلام هذه الطبقة، ونحن إيداع محلول الدهون فوق agarose والسماح للمذيب لتتبخر. ثم تم تنفيذ الإماهة للنظام مع عازل مائي، مما أدى إلى تشكيل GUVs مع البروتين المدرجة في طبقة ثنائية الدهون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. وضع العلامات البروتين

  1. السماح NHS-رودامين، 5-HT1A شظايا الغشاء، واحد 7 K MWCO تدور عمود تحلية إلى التوازن في درجة حرارة الغرفة.
  2. حل 1 ملغ من NHS-رودامين في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO).
  3. إضافة 5 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم 1 M لزيادة درجة الحموضة من محلول 5-HT1AR إلى درجة الحموضة 8.
  4. إضافة 3.66 ميكرولتر من محلول NHS-rhodamine إلى 50 ميكرولتر من محلول 5-HT1AR وماصة بلطف صعودا وهبوطا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    ملاحظة: تأكد من أن يكون على الأقل 10x الضرس الزائد من NHS-رودامين.
  5. الحفاظ على الخليط محمية من الضوء ووضعها على الدوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  6. اغسل عمود دوران 7 k MWCO مع 200 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات 1x (1x PBS) ثلاث مرات لمدة 1.5 دقيقة عند 1.5 RCF لكل غسل.
  7. أضف البروتين المسمى إلى عمود واحد وتوازن الكمية في أنبوب طرد مركزي آخر.
  8. تدور أسفل البروتين المسمى مرة واحدة لمدة 5 دقائق في 1.5 RCF.
  9. خذ طيف الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مطياف قطرة النانو عند 280 نانومتر و554 نانومتر وحساب كفاءة وضع العلامات وفقا لدليل الشركة المصنعة.
  10. تخزين البروتين المسمى تغطية في 5 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. الحل مستقر لمدة أسبوع تقريبا بعد وضع العلامات.

2. GUVs مع غشاء أدرجت 5-HT 1A

  1. إعداد المواد والكواشف
    1. السماح للبروتين والدهون وBSA (الألبومين مصل البقري) إلى التوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. خلال هذا الوقت، تنظيف coverlips عن طريق وضعها في الميثانول و sonicating لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية. تأكد من أن الميثانول يغطي تماما الأغطية ومستوى المياه في حمام الماء فوق مستوى الميثانول في الحاوية.
      ملاحظة: الميثانول سام ويجب التعامل معه في غطاء محرك السيارة الكيميائي المناسب.
    3. جفف الميثانول الزائد على الأغطية مع تيار لطيف من الهواء. ضع حامل الغطاء المغطى في فرن 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لضمان جفاف الأغطية الزائدة.
    4. ابدأ عملية تنظيف البلازما. أولا، ضع الأغطية في منظف البلازما وإغلاق صمام كمية الهواء لإخلاء كل الهواء داخل الغرفة.
    5. مرة واحدة في الغرفة تحت فراغ، وتنظيف coverlips لمدة 5 دقائق باستخدام إعداد قوة RF عالية وفراغ شبه كامل، مع كمية الهواء طفيف فقط في غرفة فراغ. لضمان المستوى المناسب للبلازما، ضبط فتح غرفة فراغ بحيث اللون الناتج من البلازما هو ثابت، وردي مشرق.
      ملاحظة: من المهم عند استخدام الهواء أن البلازما لا تزال لون وردي مشرق لمدة خطوة العلاج البلازما، كما لون أغمق الأرجواني يشير إلى أن هناك كمية غير لائقة من الهواء في الغرفة، وسوف يؤدي إلى علاج البلازما دون المستوى الأمثل.
    6. مرة واحدة وقد مرت 5 دقائق، إيقاف قوة RF والإفراج عن فراغ.
      ملاحظة: عند الإزالة من غرفة البلازما، يرجى التأكد من أن الأغطية تظل مغطاة.
  2. إعداد هيدروجيل
    1. الجمع بين 6 ملغ من agarose درجة حرارة ذوبان منخفضة جدا مع 300 ميكروغرام من المياه فائقة البور (أي 2٪ (ث / v) agarose).
      ملاحظة: سيتم استخدام 2٪ من الآجاروز لصنع GUVs خالية من البروتين. يمكن الاحتفاظ بحل Agarose عند 45 درجة مئوية لمدة يومين.
    2. الجمع بين 9 ملغ من agarose درجة حرارة منخفضة جدا مع 300 ميكرولتر من المياه فائقة البور ل3 ث / v٪ agarose حسبما أعدت في الخطوة 3.1. سيتم استخدام 3٪ agarose لجعل البروتين أدرجت GUVs.
    3. دوامة الحل لفترة وجيزة قبل وضعها على كتلة الحرارة 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم دوامة الأنبوب مرة أخرى قبل نقله إلى كتلة حرارة 45 درجة مئوية لإبقائه في شكل منصهر حتى مزيد من الاستخدام.
  3. الآغاروز وخلط البروتين
    1. مزيج 21 ميكرولتر من 3٪ agarose مع 7 ميكرولتر من شظايا غشاء 5-HT1AR. ماصة صعودا وهبوطا ببطء عدة مرات لضمان خلط كافية. ثم، احتضان في 45 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
  4. هيدروجيل وترسب الدهون
    1. ل GUVs الخالية من البروتين: قم بعمل فيلم رقيق على الأغطية الطازجة التي يتم تنظيفها بالبلازما باستخدام 20 ميكرولتر من 2٪ من الآجاروز. بسرعة إسقاط coverlip آخر على رأس قطرة agarose والانزلاق بلطف coverslips وبصرف النظر لجعل فيلم رقيقة على كل من coverslips.
      ملاحظة: هذه الخطوة صعبة في أن انزلاق القطيرات يجب أن يحدث بينما لا يزال الآغاروز في الشكل المنصهر.
    2. ل GUVs المدمجة في البروتين: ماصة خليط البروتين / الآغروز صعودا وهبوطا مرة أخرى، ومن ثم إيداع 20 ميكروغرام من 2٪ agarose على غطاء تنظيف البلازما. اتبع اتجاهات صب الانزلاق كما هو موضح أعلاه.
    3. السماح للأغروز إلى هلام محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إيداع الدهون dropwise على رأس طبقة الآغاروز. استخدام ما مجموعه 10 ميكرولتر من 2 ملغ / مل من 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوتشولين (POPC) مع 0.4 مول٪ 1,2-Dipalm سيتويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين (DPPE) المسمى مع ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (أو خليط الدهون من الفائدة) في الكلوروفورم على رأس فيلم الآغاروز. إيداع قطرات باستخدام إبرة الكروماتوغرافيا الغاز ونشر قطرة واحدة في وقت واحد عبر تيار الهواء لطيف.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى الحذر مع هذه الخطوة لجعل طبقة موحدة نسبيا من الدهون على رأس هيدروجيل. أيضا، الكلوروفورم سامة وينبغي التعامل معها في غطاء محرك السيارة الكيميائية المناسبة.
    5. تجميع غرف سايكس مور (S-M) عن طريق وضع O-حلقة على رأس غطاء، ومن ثم وضع المكون العلوي من الغرفة على رأس O-حلقة. استخدام المفتاح الذي تقدمه الشركة المصنعة لتجميع الغرفة عن طريق الشد مكونات الغرفة معا لختم الغرفة ومنع أي تسرب.
      ملاحظة: يجب تشديد الجزء العلوي من الغرفة على O-ring ولكن هناك حاجة إلى الحذر لضمان بقاء الغطاء سليما حيث يمكن أن ينكسر الغطاء إذا لم يجلس O-ring بشكل صحيح في الغرفة. أيضا، تأكد من أن الغرفة مغلقة بما فيه الكفاية بحيث الغرفة لا تسرب عند إضافة محلول تورم. الفشل في تشديد الغرفة بما فيه الكفاية سيؤدي إلى تسرب وفقدان العينة.
  5. تورم وحصاد الحويصلات
    1. هيدرات النظام بأكمله عن طريق الأنابيب بلطف 450 ميكرولتر من السكروز 200 mM في برنامج تلفزيوني 1x والتنصت بلطف الغرف لضمان تغطية عازلة كافية من طبقات هيدروجيل الدهون.
      ملاحظة: يمكن استبدال محلول السكروز بمخزن مؤقت للإماهة يحتوي على مسابير بيولوجية ذات أهمية.
    2. ضع الغرف عند درجة حرارة 45 درجة مئوية وقم بتغطية الجزء العلوي من الغرفة بغطاء لمنع التبخر. السماح للعينة لتضخم، محمية من الحطام والضوء لمدة 1 ساعة.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في المياه فائقة النبور في كل بئر من لوحة 96 بئرا المقصود لاستخدامها. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. يغسل ثلاث مرات مع المياه النقية للغاية ومرة واحدة مع السكروز 200 mM في برنامج تلفزيوني 1x.
    5. وأخيرا، إضافة 200 مليون متر من الجلوكوز في برنامج تلفزيوني 1x حتى إضافة حل عينة GUV.
      ملاحظة: تم استخدام BSA لمنع الامتزاز GUV.
    6. بعد السماح للهيدرجيل بالانتفاخ، هز الغرفة بلطف واضغط عليها لطرد أي مركبات GUVs قد تظل متصلة بسطح الهيدروجيل. ثم، ماصة بعناية حتى حل GUV-السكروز.
      ملاحظة: كخطوة اختيارية لضمان فصل جميع الحويصلات عن السطح، ماصة بلطف بعض تعليق السكروز مرة أخرى على سطح الهيدروجيل.
    7. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي التي أعدت سابقا تحتوي على 700 ميكرولتر من الجلوكوز 200 mM في برنامج تلفزيوني 1x.
      ملاحظة: سيؤدي تدرج الكثافة إلى تسوية الحويصلات إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي.
    8. السماح للحواس لتسوية لمدة ساعة أخرى لضمان أن الحويصلات يمكن أن تغرق إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق، مما يسمح لجمع الأمثل.
    9. بعد تسوية GUVs في الجلوكوز ، قم بنقل 300 ميكرولتر من أسفل أنبوب الطرد المركزي (الحويصلات المستقرة) إلى لوحة 96-well التي تم إعدادها مسبقا وBSA لفحص الحويصلات تحت المجهر الكونفوجال.
      ملاحظة: تأكد من تجنب الجزء السفلي جدا من أنبوب الطرد المركزي الدقيق لتقليل كمية الحطام التي تم جمعها في العينة النهائية.
  6. تحقق من العينات تحت المجهر.
    1. تألق ليزر 488 نانومتر على العينة (التي تسمح لنا لتصور الغشاء، كما تم تسمية ثنائي مع ATTO-488-DPPE).
    2. تألق ليزر 561 نانومتر على العينة (التي تسمح لنا لتصور البروتين، لأنه قد وصفت مع NHS-رودامين).
      ملاحظة: هناك حاجة الحذر أثناء تصوير العينة كما يمكن أن تزعزع السمية الضوئية الحويصلات. وقد لوحظ Vesicles في نفس اليوم.

figure-protocol-1
الشكل 1: توضيح لخطوات البروتوكول التفصيلية. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم قياس تركيز البروتين، وتم حساب درجة وضع العلامات كنسبة الضرس بين الصبغة والبروتين لتكون 1:1. من خلال فحص GUVs باستخدام المجهر الكونف البؤري ، تمكنا من تأكيد نجاح تكوين وتكامل البروتين من الحويصلات. وصفت الدهون مع 0.4 مول٪ ATTO 488-DPPE، ووصفت البروتين بشكل مشترك عن طريق تعديل رودامين NHS-ester من الأمينات الأولية. الشكل 2a والشكل 2b تظهر الحويكل البروتين المدمج في قنوات ATTO 488 ورودامين، على التوالي. وقد تم تصحيح جميع micrographs التيار المظلم وflatfield.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد حددنا خطوتين حاسمتين لنجاح البروتوكول العام: علاج البلازما وترسب الدهون. تنظيف البلازما ينجز شيئين: أولا، فإنه يزيل آثار المواد العضوية من سطح الزجاج. ثانيا، فإنه ينشط سطح الغطاء، مما يسمح لزيادة في wettability كما يزيد hydrophilicity سطح الزجاج62،63. لمس سطح coverlip تنظيف ما بعد البلازما سوف تعطيل وتلوث سطح ultraclean وينصح بشدة ضد. توصيتنا هي لمس حواف جدا وs undersides فقط من coverlip عند التعامل مع coverlips لخطوة صب زلة agarose. الخطوة الحاسمة الثانية هي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

شكر وتقدير

نشكر ماثيو بلوسر على النقاش والمشورة القيمة. وقد دعم هذا العمل مكتب البحوث البحرية (N00014-16-1-2382) والمؤسسة الوطنية للعلوم (PHY-1915017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)AvantiPolar Lipids, Albabster, AL850375C-25mg
  مجهر مقلوب TI-Eclipseنيكون ، ميلفيل ، نيويورككسوف Ti
1،2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)Avanti Polar Lipids ، المرمر ، AL850355C-25mg
13/16 & Prime; معرف ، 1 & Prime ؛ OD السيليكون يا الحلقاتالستيرليني ختم & توريد, نبتون, IN5-003-8770
16-بت Cascade II 512 الشحنة المضاعفة للإلكترون مقترنة بكاميراالقياسات الضوئية, هنتنغتون بيتش, كاليفورنيا& nbsp; Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) AvantiPolar Lipids ، Alabaster ، AL850457C-25mg
50 mW ليزر الحالة الصلبة عند 488 نانومتر ومرشح انبعاث متمركز عند 525 نانومتر ، و 561 نانومتر مع مرشح انبعاث متمركز عند 595 نانومترمتماسك ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا488 / 561-50-LS
5-HT1AR شظايا غشاء بيركينإلمر ، والثام ، ماساتشوستسRBHS1AM400UA
ATTO-488-1،2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)ATTO-TEC ، Siegen ، ألمانياAD 488-155
منظف البلازما العلوي HarrickPlasma ، Itha ، NYPDC-32G
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma Aldrich ، St. Louis ، MOA9418
chloroform (CHCl3< / sub>)Millipore Sigma ، Burlington ، MACX1055
الكوليسترول (كولسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريC8667-5G
كورنينج 96 بئر مسطحة شفافةالقاع كورنينج ، كورنينج ، نيويورك3904
Elmasonic E-Series E15H بالموجات فوق الصوتيةإلما ، سينجين ، ألمانيا[لم يعد يباع على الموقع الرئيسي]
الجلوكوزسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريG7528
الميثانول (MeOH)ميليبور سيجما ، برلنغتون ، ماساتشوستسMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA46406
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (10x PBS)Corning ، Corning ، NY21-040
الغزل رأس متحد البؤر CSUXيوكوجاوا ، طوكيو ، اليابانCSU-X1
أغطية زجاجية قياسية مقاس 25 مم رقم 1ChemGlass ، Vineland ، NJCLS-1760
سكروزSigma Aldrich ، سانت لويس ، MOS7903
Sykes-Moore chambersBellco ، Vineland ، NJ1943-11111
درجة حرارة انصهار منخفضة للغاية agaroseSigma Aldrich ، سانت لويس ، MOA5030
VWR Analog HeatblockVWR International ، Radnor ، PA[لم يعد يباع على الموقع الرئيسي]
VWR Tube RotatorVWR International ، Radnor ، PA10136-084
Zeba Spin Desalting Columns ، 7K MWCO ، 0.5 ملThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA89882
) قرص

المراجع

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622(2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804(2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101(2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33(2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270(2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

حويصلات أحادية الطبقة العملاقةبروتينات الغشاء المدمجةالتفاعلات بين البروتين والغشاءانتفاخ الهيدروجيلدمج بروتينات الغشاءمستقبل 5-HT1Aأغشية محاكية حيوياًتموضع البروتين
بناء نموذج الأغشية الدهنية دمج G-البروتين إلى جانب المستقبلات (GPCRs)
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.