مقالة منهجية

اثنين من الطبقات طريقة ساندويتش الغشاء لمجموعة اللعاب Laodelphax striatellus

DOI:

10.3791/62831

⸱

أغسطس 27, 2021

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي طريقة لجمع ما يكفي من اللعاب من الحشرات المصة للثقب باستخدام وسيلة اصطناعية. هذه طريقة مريحة لجمع لعاب الحشرات ودراسة وظيفة اللعاب على سلوك تغذية الحشرات وانتقال الفيروس المنقول بالنواقل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتمد فيروس الأرز الشريطي، الذي يسبب خسارة اقتصادية كبيرة للزراعة في شرق آسيا، اعتمادا كليا على ناقلات الحشرات لانتقاله الفعال بين الأرز المضيف. Laodelphax striatellus (زارع البني الصغير ، SBPH) هو ناقل الحشرات الرئيسي الذي ينقل أفقيا RSV أثناء امتصاص النسغ من phloem. يلعب اللعاب دورا مهما في سلوك تغذية الحشرات. يتم وصف طريقة مريحة من شأنها أن تكون مفيدة للبحث في لعاب الحشرات مع سلوك التغذية الثاقبة المص هنا. في هذه الطريقة ، سمح للحشرات بالتغذية على نظام غذائي اصطناعي يقع بين طبقتين من طبقات أفلام البارافين الممتدة. تم جمع النظام الغذائي الذي يحتوي على اللعاب كل يوم ، وتصفيته ، وتركيزه لمزيد من التحليل. وأخيرا، تم فحص نوعية اللعاب التي تم جمعها عن طريق تلطيخ البروتين والمناعة. وقد تجسدت هذه الطريقة من خلال الكشف عن وجود RSV وبروتين يشبه الموسين في لعاب SBPH. وستضع طريقة التغذية الاصطناعية وجمع اللعاب هذه أساسا لإجراء مزيد من البحوث حول العوامل في لعاب الحشرات المتعلقة بسلوك التغذية وانتقال الفيروس.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس شريط الأرز (RSV), فيروس الحمض النووي الريبي السلبية الذين تقطعت بهم السبل في جنس تينويvirus, يسبب أمراضا خطيرة في إنتاج الأرز في شرق آسيا1,2,3. ويعتمد انتقال فيروس RSV من نباتات الأرز المصابة إلى النباتات السليمة على ناقلات الحشرات، ولا سيما لاودلفاكس سترياتيلوس، التي تنقل RSV بطريقة مستمرة الانتشار. SBPH يكتسب الفيروس بعد التغذية على النباتات المصابة RSV. بمجرد دخول الحشرة ، تصيب RSV الخلية الظهارية الوسطى بعد يوم واحد من التغذية ثم تمر عبر حاجز منتصف الطريق لاختراق الهيموليم. في وقت لاحق، ينتشر RSV إلى أنسجة مختلفة عن طريق الهيموليم ثم ينتشر. بعد فترة كامنة من حوالي 10-14 يوما بعد الاستحواذ ، يمكن أن ينتقل الفيروس داخل الغدة اللعابية إلى النباتات المضيفة الصحية عن طريق اللعاب المفرز بينما تمتص SBPH النسغ من phloem4و5و6و7و8و9و10 . عملية التغذية الفعالة والعوامل المختلفة في اللعاب ضرورية لانتشار RSV من الحشرة إلى النبات المضيف.

ويعتقد أن لعاب الحشرات التي تفرزها الغدد اللعابية يتوسط الحشرات والفيروسات والنباتات المضيفة. عادة ما تنتج الحشرات الهميبتران نوعين من اللعاب: اللعاب الهلامي واللعاب المائي11،12،13. يفرز اللعاب Gelling أساسا في أبولازم للحفاظ على حركة الأناقة بين الخلايا المضيفة ويرتبط أيضا بالتغلب على مقاومة النبات والاستجابات المناعية14و15و16و17. في مرحلة التحقيق في التغذية ، تفرز الحشرات بشكل متقطع اللعاب الهلامي الذي يتأكسد على الفور لتشكيل شفة سطحية. ثم، أغماد واحدة أو متفرعة تغلف stylet لحجز قناة أنبوبي18،19،20. ويفترض أن شفة السطح على البشرة لتسهيل اختراق stylet من خلال العمل كنقطة مرساة، في حين أن الأغماد حول stylet قد توفر الاستقرار الميكانيكي والتشحيم16،21،22،23. تم تحديد Nlshp كبروتين أساسي لتشكيل غمد اللعاب والتغذية الناجحة للزارع البني(Nilaparvata lugens، BPH). تثبيط التعبير عن بروتين الغمد الهيكلي (SHP) الذي يفرزه pisum Acyrthosiphon المن قلل من تكاثره عن طريق تعطيل التغذية من أنابيب الغربالالمضيفة 24. وعلاوة على ذلك ، في بعض أنواع الحشرات ، من المفترض أن تؤدي عوامل اللعاب الهلامية إلى استجابات مناعية نباتية من خلال تشكيل ما يسمى بالأنماط الجزيئية المرتبطة بالحيوانات العاشبة (HAMPs). في N. lugens, NlMLP, بروتين يشبه الموسين المتعلقة بتشكيل غمد, يحفز الدفاعات النباتية ضد التغذية, بما في ذلك موت الخلية, التعبير عن الجينات المتعلقة بالدفاع, وترسب الشنق 25,26. أيضا ، وقد ثبت أن بعض عوامل اللعاب هلام في المن لتحريك استجابات الدفاع النباتية عن طريق التفاعلات بين الجينات إلى الجينات مماثلة للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض12،15،27.

لدراسة عوامل اللعاب الأساسية لتغذية الحشرات و / أو انتقال مسببات الأمراض ، من الضروري تحليل اللعاب المفرز. هنا، يتم وصف طرق التغذية الاصطناعية وجمع للحصول على كميات كافية من اللعاب لمزيد من التحليل. باستخدام وسيط يحتوي على عنصر غذائي واحد فقط ، تم جمع العديد من بروتينات اللعاب وتحليلها عن طريق تلطيخ الفضة والنشاف الغربي. هذه الطريقة سوف تكون مفيدة في إجراء مزيد من البحوث على العوامل في اللعاب التي تعتبر ضرورية لانتقال RSV بواسطة SBPH.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. صيانة SBPH

  1. الخلفية viruliferous وRSV خالية من الأفراد SBPH في حاضنة الزجاج (65 × 200 ملم) مع الأرز 5-6(Oryza sativa cv. Nipponbare) الشتلات لكل غرفة زجاجية في المختبر. زراعة نباتات الأرز في 25 درجة مئوية تحت ضوء 16 ساعة / 8 ساعة photoperiod الظلام.
    ملاحظة: تم القبض في البداية على أفراد SBPH viruliferous وخالية من RSV في مقاطعة جيانغسو، الصين.
  2. الكشف عن RSV في SBPH عن طريق اختبار مناعة مرتبطة بالانزيم نقطة (نقطة ELISA) مع أرنب RSV محددة الأجسام المضادة متعددة النسيلة (انظر جدول المواد)التي أثيرت ضد ريبونوكليوبروتين RSV (RNPs).
    ملاحظة: لضمان كفاءة عالية للعدوى النسل، تم الحفاظ على الإناث viruliferous بشكل منفصل، و 15٪ من ذريتهم تم اختبارها عشوائيا لعدوى RSV. يتم وصف تفاصيل نقطة ELISA في الخطوات 1.3-1.7.
  3. تجانس SBPH واحد في 20 ميكرولتر من العازلة طلاء (0.05 M نا2CO3-NaHCO3، درجة الحموضة 9.5). بقعة 3 ميكرولتر من كل على غشاء النايلون (انظر جدول المواد)،ومن ثم تجفيف الغشاء في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. احتضان الغشاء مع 15 مل من العازلة حجب (PBS + 3٪ الحليب الخالي من الدسم) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة للأرنب الأولية المخففة ضد RSV (1:10000) في 15 مل من PBS لمدة 1 ساعة في RT وغسل الغشاء ثلاث مرات مع PBS لمدة 5 دقائق حضانة في كل مرة.
  6. احتضان الغشاء مع 1.5 ميكرولتر من الفجل peroxidase-المقترنة الأجسام المضادة للأرنب الماعز (انظر جدول المواد) في 15 مل من برنامج تلفزيوني وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق حضانة في كل مرة.
  7. تطوير اللوت المناعي مع تعزيز HRP-DAB Chromogenic كيت (انظر جدول المواد)وفقا للبروتوكولات التي تقدمها الشركة المصنعة.

2. إعداد غرفة التغذية والنظام الغذائي الاصطناعي

  1. تزن 2 غرام من مسحوق السكروز وحله في 40 مل من ddH2O لإعداد محلول مائي السكروز 5٪ كحمية اصطناعية.
  2. تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لإزالةالتلوث البكتيري والشوائب.
  3. تجويع 200 3rd-5 يرقات SBPH لمدة 3-5 ساعة قبل إدخالها إلى الغرفة.
    ملاحظة: 200 SBPH معدة لغرفة واحدة; وينبغي إعداد المزيد من SBPH لعدة غرف.
  4. إعداد اسطوانات الزجاج وغرف التغذية (الشكل 1A). قم بتغطية طرف مفتوح واحد من الغرفة بغشاء البارافين (انظر جدول المواد)قبل إدخال الحشرات التجريبية.
    ملاحظة: طول كل أسطوانة 15.0 سم وقطرها 2.5 سم. هذه الاسطوانات الزجاجية مصنوعة خصيصا وفقا لمتطلبات التجريبية.
  5. نقل الحشرات إلى اسطوانة زجاجية.
  6. تغطية الطرف الآخر من الغرفة مع غشاء البارافين امتدت (على وجه التحديد، بارا فيلم M). ثم، إضافة 200 ميكرولتر من النظام الغذائي الاصطناعي لذلك. وأخيرا، قم بتغطية السائل بطبقة أخرى من غشاء البارافين الممتد.
    ملاحظة: يمتد غشاء البارافين إلى حوالي ضعف مساحته الأصلية.
  7. تغطية الغرفة مع رقائق الألومنيوم، ولكن ترك نهاية مع جهاز النظام الغذائي الاصطناعي يتعرض للضوء.

3. مجموعة من اللعاب SBPH

  1. جمع النظام الغذائي الاصطناعي من RSV خالية وsBPH viruliferous بشكل منفصل في نهاية فترة 24 ساعة.
  2. تبريد الاسطوانة في 4 درجة مئوية لشل حركة الحشرات.
  3. كشف الفيلم الخارجي وجمع السائل النظام الغذائي الاصطناعي باستخدام ماصة معقمة في أنابيب معقمة 1.5 مل. احتفظ باللعاب الذي تم جمعه عند -80 درجة مئوية حتى التحليل.
    ملاحظة: يمكن تخزين اللعاب المجمع عند -80 درجة مئوية لمدة عام واحد.
  4. شطف الغشاء الداخلي مع 50 ميكرولتر من النظام الغذائي الاصطناعي الطازج ثلاث مرات عن طريق pipetting بهدوء، وجمع النظام الغذائي الغسيل الاصطناعي على النحو المبين في الخطوة 3.3. وضع النظام الغذائي الاصطناعي الجديد على الغشاء الداخلي والحفاظ على غشاء البارافين امتدت حديثا على القمة.
  5. كرر الخطوتين 3.2 و3.3 لمدة 5 أيام إلى أسبوعين.
    ملاحظة: عد معدل البقاء على قيد الحياة من SBPH التغذية الاصطناعية وضمان تكملة كافية من SBPH الطازجة وفقا لمعدل البقاء على قيد الحياة.
  6. تصفية العينات التي تم جمعها من خلال وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر لإزالة الميكروبات والملوثات الأخرى.

4. تركيز اللعاب التي تم جمعها

  1. نقل عينات اللعاب التي تم جمعها في مرشح الطرد المركزي 0.5 مل 10 كد (انظر جدول المواد) وتدور في 5500 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جمع supernatant وجعل حجم النهائي إلى 100 ميكرولتر.
  2. قياس تركيز اللعاب التي تم جمعها باستخدام الطيف المناسب للأشعة فوق البنفسجية فيس باتباع الخطوات 4.3-4.6.
  3. قم بتشغيل مقياس الطيف واغسل الطيات ثلاث مرات باستخدام ddH2O.
  4. حدد الخيارات التالية على الشاشة بالترتيب الصحيح: البروتينات | بروتين A280 | تحديد نوع | 1 عبس = 1 ملغم/ مل. ثم حدد خانة الاختيار تصحيح خط الأساس 340 نانومتر.
  5. تحميل 2 ميكرولتر من محلول مائي السكروز 5٪ كما فارغة، لمس فارغة في الجزء السفلي من الشاشة.
  6. بعد وضع المعايير، تحميل 2 ميكرولتر من اللعاب التي تم جمعها للقياس. قراءة وتسجيل تركيز البروتين.
    ملاحظة: تم جمع 1 ملغ من بروتينات اللعاب في النهاية في المجموع على الأقل.

5. تلطيخ الفضة من بروتينات اللعاب

  1. استخراج البروتين من عينات لعاب الحشرات باستخدام عينة تحميل العازلة (50 mM تريس-HCl الرقم الحموضة 6.8، 10٪ الجلسرين، 2٪ SDS، 0.1٪ بروموفينول الأزرق، و 1٪ β ميركابتوفانول). ثم، تجزئة بنسبة 10٪ SDS-PAGE (انظر جدول المواد). تحميل محلول sucroseaqueous 5٪ تعامل بنفس الطريقة التي تحكم سلبي.
  2. تحميل aliquot 20 μL من العينة على هلام SDS-PAGE جنبا إلى جنب مع علامة ملطخة مسبقا. تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة في 90 فولت، ومن ثم 50 دقيقة في 140 فولت.
  3. إصلاح هلام في 30٪ (فول / فول) الإيثانول، 10٪ (فول / فول) حمض الخليك لمدة 30 دقيقة على الأقل بعد الكهربائي.
  4. شطف الجل مرتين مع 20٪ (فول / فول) الإيثانول والماء بشكل منفصل لمدة 10 دقيقة في كل مرة.
  5. توعية هلام في 0.8 مليون ثيوسلفات الصوديوم لمدة 1 دقيقة، ثم شطف مرتين في الماء لمدة 1 دقيقة في كل مرة.
  6. تزج الجل في نترات الفضة 12 mM لمدة ساعة واحدة على الأقل، ومن ثم تراجع في الماء deionized لمدة 10 ق قبل نقله إلى حل المطور.
  7. عندما الخلفية من هلام هو الحصول على الظلام، تزج هلام في حل وقف (5٪ حمض الخليك) لمدة 30 دقيقة على الأقل لوقف رد الفعل.
  8. يغسل الجل مرتين بالماء لمدة 30 دقيقة في كل مرة. تطوير الصورة باستخدام نظام الكشف (انظر جدول المواد).

6. الكشف عن البروتين عن طريق النشاف الغربية

  1. الكشف عن البروتين مثل اللعاب الموسين من SBPH (LssgMP) و RSV عن طريق البقع الغربية باستخدام أجسام مضادة محددة، على التوالي.
  2. علاج عينات لعاب الحشرات بعد الخطوة 5.1.
  3. تحميل 20 μL aliquot من العينة على هلام SDS-PAGE 10٪ جنبا إلى جنب مع علامة ملطخة مسبقا و20 ميكرولتر RSV عينة اللعاب غير المصابة كسيطرة سلبية. تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة في 90 فولت، ومن ثم لمدة 50 دقيقة في 140 فولت.
  4. مزيج 100 مل من 10x نقل البروتين العازلة (الرطب) (انظر جدول المواد)مع 900 مل من DDH2O إلى حل العمل (1x)، ومن ثم نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد polyvinylidene باستخدام العازلة نقل البروتين (1x).
  5. كتلة الغشاء في الحليب الخالي من الدسم 5٪ مع 0.01 M تريس العازلة المالحة مع 0.05٪ توين 20 (TBST) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، امزج 100 مل من TBST 10x (راجع جدول المواد)مع 900 مل من ddH2O في حل العمل.
  6. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة أرنب الأولية ضد RSV أو LssgMP (كلاهما 1:10000) المخفف في TBST في RT لمدة 2 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: ذكر أعلاه إنتاج الأجسام المضادة الأولية ضد RSV. أنتجت شركة التكنولوجيا الحيوية الأرانب المضادة للLssgMP الأجسام المضادة للنسيلة ضد الببتيد LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST لمدة 10 دقيقة من الحضانة في كل مرة.
  8. احتضان الغشاء مع الفجل peroxidase المقترنة الماعز المضادة للأرانب الأجسام المضادة المخففة في TBST 1:10000.
  9. تطوير اللوتات المناعية مع نظام الكشف عن البقع الغربية المحسنة.

7. الكشف عن نمط التعبير LssgMP في SBPH

  1. شل حركة الحشرات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. غسل الحشرات مع 75٪ الإيثانول وDDH2O واحدا تلو الآخر، ومن ثم تشريح الحشرات في TBS المبردة مسبقا (0.01 M تريس العازلة المالحة).
  3. تشريح الحشرات من البطن أثناء قطع الساقين من SBPH في المفصل كوكسا-trochanter بواسطة ملقط; غسل midgut والغدد اللعابية مرتين في TBS لإزالة أي تلوث من hemolymph.
  4. وضع خمسة أنسجة في أنبوب 1.5 مل RNase خالية لاستخراج الحمض النووي الريبي. النظر في كل أنبوب كعينة واحدة.
  5. تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة وعكس النسخ PCR (RT-PCR) (انظر جدول المواد).
  6. أداء الكم في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) للتحقيق في مستويات التعبير عن نسخة نسبية من LssgMP في مقتطفات من الجسم كله أو أنسجة مختلفة من L. striatellus.
    ملاحظة: كانت أزواج التمهيدي المستخدمة في تضخيم الجينات LssgMP-q-F/LssgMP-q-R،تم إجراء QPCR المستندة إلى SYBR Green وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد مستوى النص ل. striatellus الترجمة معامل استطالة 2 (ef2) مع زوج التمهيدي ef2-q-F/ef2-q-R لتطبيع قوالب cDNA. وترد أدناه تسلسل التمهيدي:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCGGGTACTGATTCC; EF2-q-F: GTCTCCACGGGGGCTTT; EF2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخطيطات تركيب التغذية الاصطناعية وجمع اللعاب
يصور الشكل 1A الأسطوانة الزجاجية (15 سم × 2.5 سم) المستخدمة كغرفة تغذية لجمع اللعاب. أولا ، تم تجويع يرقات SBPH لعدة ساعات لتحسين كفاءة جمع ثم شلت عن طريق تقشعر لها الأبدان لمدة 5 دقائق. بعد نقل الحشرات إلى الأسطوانة الزجاجية ، تم تغطية طرفي الغرفة المفتوحين بغشاء البارافين الممتد. في نهاية واحدة، 200 ميكرولتر من 5٪ السكروز تقع بين طبقتين من غشاء البارافين امتدت إلى حوالي ضعف مساحتها الأصلية(الشكل 1B

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الإبلاغ عن نجاح تربية الحشرات على الوجبات الغذائية الاصطناعية لأول مرة في عام 1962 عندما وصف ميتلر وداد تقنية غشاء البارافين لعقد نظام غذائي اصطناعي29،30. وقد تم استكشاف هذه الطريقة في العديد من جوانب بيولوجيا الحشرات وسلوكها ، على سبيل المثال ، الملحق الغذائي ، تغذية dsRNA ، واكتساب الفيروس. بناء على متطلبات تحليل اللعاب ، يستخدم 5٪ سكروز كغذاء اصطناعي عام لجمع لعاب SBPH في هذه الدراسة. لجمع اللعاب الناجح ، تجدر الإشارة إلى العديد من الخطوات الهامة هنا. أولا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني الصيني للبحوث والتطوير (رقم 2019YFC1200503)، والمؤسسة الوطنية الصينية للعلوم (رقم 32072385)، وجمعية تشجيع الابتكار الشبابي CAS (2021084).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرشح الطرد المركزي 10-KDMerck MilliporeR5PA83496للتركيز
10x عازلة نقل البروتين (رطب)macGENEMP008نقل المخزن المؤقت للنشاف الغربي
10x TBSTCoolaberSL1328-500mL & times ؛ 10المخزن المؤقت للغسيل
Azure c600 الأنظمة الحيويةAzure BiosystemsAzure c600نظام التصوير للنشاف الغربي وتلوين الفضة
سلم البروتين الملونGenStarM221-01علامة البروتين للنشاف الغربي
ECL   ؛ كواشف الكشف عن النشاف الغربيGE HealthcareRPN2209الكشف عن النشاف الغربي
Enchanced HRP-DAB مجموعة الكروموجينيكTIANGENتفاعل كروموجينيك
الفجل الحار الأجسام المضادة للماعز المترافق بيروكسيداز المضادة للأرانبSigma401393-2MLالجسم المضاد الثانوي متعدد النسيلة للنشاف الغربي
Immobilon (R) -P غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدينميرك MilliporeIPVH00010غشاء نقل للنشاف الغربي
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125ل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
KIT ، iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891للنسخ العكسي PCR (RT-PCR
) مرشح Millex-GP ، 0.22 & micro ؛ mMerck MilliporeSLGP033RBللترشيح
Mini-PROTEAB TGX GelsBio-Rad4561043ل SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-Wالكشف عن تركيز البروتين
غشاء النايلونPALLT42754غشاء لغشاء dot-ELISA
Parafilm MSigmaP7793-1EAصنع نظام غذائي اصطناعي شطائر
الأرانب المضادة ل LssgMP الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد الببتيدات LssgMPGenstriptRabbit الجسم المضاد متعدد النسيلة الأساسي المضاد ل LssgMP للنشاف الغربي
الأرنب المضاد للجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد ل RSVGenstriptRabbit الجسم المضاد متعدد النسيلة الأساسي المضاد ل RSV للنشاف الغربي و dot-ELISA
RNAprep مجموعة صغيرة نقيةTIANGENDP420لاستخراج الحمض النووي الريبي
الغربي #PA110

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636(2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949(2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082(2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909(2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312(2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216(2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254(2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840(2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS Page

مقالات ذات صلة