يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص هيدرولاز ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد في التوكسوبلازم جوندي و Neospora caninum للفحص عالي الإنتاجية باستخدام ذراع الروبوت

816 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62874

⸱

يوليو 22, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تم العثور على عدوى التوكسوبلازما جوندي والنيوسبورا الكانينوم في البشر وتؤدي إلى مشاكل صحية خطيرة. يشترك الطفيليان في هيدرولاز ثلاثي الفوسفات النيوكليوزيدي المتشابهين ويلعبان أدوارا مهمة في التكاثر والبقاء على قيد الحياة. أنشأنا فحصا عالي المستوى للإنزيمات التي تتطلب استخدام ذراع الروبوت.

الملخص

تصيب طفيليات الأوليات البشر والعديد من ذوات الدم الحار. يوجد التوكسوبلازما جوندي، وهو طفيلي رئيسي من الأوليات، بشكل شائع في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ومتلقي زراعة الأعضاء والنساء الحوامل، مما يؤدي إلى الحالة الصحية الخطيرة، داء المقوسات. ويسبب الأوليات الرئيسية الأخرى ، Neospora caninum ، التي تحمل العديد من أوجه التشابه مع Toxoplasma gondii ، أمراضا خطيرة في ، كما هو الحال مع التهاب الدماغ والنخاع والتهاب العضلات والتهاب الجذور في والأبقار ، مما يؤدي إلى ولادة عجول ميتة. كل هذه أظهرت هيدرولاز ثلاثي الفوسفات النوكليوزيد المتشابهة (NTPase). يحتوي Neospora caninum على NcNTPase ، بينما يحتوي Toxoplasma gondii على TgNTPase-I. يعتقد أن الإنزيمات تلعب أدوارا حاسمة في التكاثر والبقاء على قيد الحياة. من أجل إنشاء مركبات و / أو مستخلصات تمنع عدوى الأوليات ، قمنا باستهداف هذه الإنزيمات لاكتشاف الأدوية. كانت الخطوة التالية هي إنشاء اختبار جديد وحساس للغاية وعالي الدقة من خلال الجمع بين مقايسة الإنزيم الكيميائي الحيوي التقليدي ومقايسة الفلورسنت لتحديد محتوى ADP. لقد تحققنا أيضا من أن الفحص الجديد يفي بمعايير إجراء الفحص عالي الإنتاجية (HTS) في الإنزيمين الأوليين. أجرينا HTS ، وحددنا 19 مركبا وستة مقتطفات من مكتبتين من المركبات الاصطناعية ومكتبة مستخلصات مشتقة من البكتيريا البحرية ، على التوالي. في هذه الدراسة ، تم تقديم شرح مفصل حول كيفية تنفيذ HTS ، بما في ذلك معلومات حول إعداد الكواشف والأجهزة وذراع الروبوت وما إلى ذلك.

المقدمة

تم تأسيس الروبوتات كأدوات متطورة وقوية لتحقيق اختراقات كبيرة في مختلف المجالات خارج الصناعة وهندسة التصنيع ، مثل الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية والبحوث السريرية ، ولا سيما HTS1،2،3. التوكسوبلازما جوندي هو طفيلي رئيسي وحقيقيات النوى الطفيلية وحيدة الخلية4 التي تسبب مشاكل صحية خطيرة لدى البشر5 والعديد من الحرارية4 ، مما يؤدي إلى التهابات تؤدي إلى داء المقوسات ، وهي حالة خطيرة بشكل خاص في مرضى الإيدز6 ، ومتلقي زراعة الأعضاء7 ، والنساء الحوامل8. Neospora caninum ينتمي إلى Phylum Apicomplexa9 يصيب والأبقاربشكل أساسي 6 ، مما يؤدي إلى التهاب الدماغ والنخاع والتهاب العضلات والتهاب الجذور في10،11 والإجهاض في الأبقار12،13. علاوة على ذلك ، يظهر Neospora caninum أوجه تشابه مورفولوجية ونسالة وثيقة بين Toxoplasma gondii9،14. بالإضافة إلى ذلك ، لديهم هيدرولاز ثلاثي الفوسفات النيوكليوزيد (NTPase; EC3.6.1.15)14. تختلف الإنزيمات تماما عن ecto-ATPase14 التقليدية. تولد هذه الطفيليات كمية كبيرة من بروتينات NTPase ، 2٪ -8٪ من إجمالي البروتين وتلعب دورا مهما كإنزيمات نائمة في مرحلةالتكيزويت 15. وتجدر الإشارة إلى أنه في الحبيبات الإفرازية الكثيفة ، يتم تكثيفها16 وإفرازها في الفجوة الطفيلية16. كطابع إنزيمي كيميائي حيوي ، يتم تنشيط NTPase بواسطة dithiothreitol17. من المتوقع أن المحفزات مثل مركب ديثيول ، وهو إنزيم غير معروف مثل ثنائي كبريتيد أوكسيدوكتاز ثنائي كبريتيد ، وآخر يظهر نفس الطبيعة. لم يتم التعرف عليها بعد في الطفيليات. ومع ذلك ، يلعب الإنزيم دورا مهما في إطلاق تسرع التاكيزويت من الخلايا المضيفةالمصابة 17.

يحتوي التوكسوبلازما جوندي على شكلين إسويين NTPase18: إنزيم النوع الأول TgNTPase-I ، وإنزيم النوع الثاني TgNTPase-II18. يستخدم الأول بشكل تفضيلي نيوكليوسيدات ثلاثي الفوسفات كركيزة18. هذا الأخير يحلل كل من ثلاثي الفوسفات وثنائي الفوسفات النيوكليوسيدات18. التماثل هو 97٪ في مستويات الأحماضالأمينية 18. يحتوي Neospora caninum أيضا على تقويم العظام TgNTPase-I المسمى NcNTPase19. التماثل هو 73٪ في مستويات الأحماضالأمينية 19. أنتج البروفيسور أساي والبروفيسور هارادا مؤتلفات لكل من NTPase باستخدام الإشريكية القولونية وغيروا الطفرات النشطة بشكل أساسي كما ورد سابقا20. لقد تفضلوا بإهداء المسوخين النشطين. يمكن لكلا الإنزيمين تحويل ATP إلى ADP في المختبر20. في الآونة الأخيرة ، قمنا بقياس نشاط NTPase باستخدام محتوى ADP المتحلل بواسطة الإنزيمات. أخيرا ، نجحنا في إنشاء الاختبار عالي المستوى من خلال عملية تحديد محتوى ADP بمزيج من التألق والتفاعل الأنزيمي كما تم الإبلاغ عنه سابقا21،22. أجرينا أيضا فحصا عالي الإنتاجية (HTS) 22.

تقدم هذه الدراسة إجراءات مفصلة لمقايسة جديدة عالية الدقة ونطاق ديناميكي21 وشرحا مفصلا حول كيفية تحضير الكواشف لقياس نشاط الإنزيم وتطوير شدة الفلورسنت باستخدام ذراع روبوت ل HTS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التعبير عن وتنقية المؤتلف TgNTPase-I و NcNTPase

  1. تحضير البلازميد التعبيري وتقديمه إلى الإشريكية القولونية. سلالة BL21.
    ملاحظة: ترد معلومات مفصلة عن التركيبات والإجراءات في تقرير سابق14. في هذه الدراسة ، تم إهداء كل من TgNTPase-I و NcNTPase الطفرات النشطة بشكل أساسي من قبل البروفيسور أساي والبروفيسور هارادا

2. تحضير ووضع محلول تفاعل الفلورسنت الحيوي على اللوحة

  1. قم بإعداد محلول تفاعل الفلورسنت الحيوي 2x كما هو موضح في الجدول 1 ل 2 مل من المزيج الرئيسي لمقايسة 400 بئر بتنسيق 384 بئر.
  2. قم بإعداد محاليل المخزون باستخدام الماء المقطر (DW) لكل تركيز محدد باستثناء Resazurin و N-ethylmaleimide. قم بإذابة الكاشفين المتبقيين باستخدام DMSO بالتركيز المناسب. ثم قم بتخزين الكواشف عند -30 درجة مئوية حتى يحين وقت إجراء التجارب.
  3. أضف 15 ميكرولتر من محلول تفاعل الفلورسنت الحيوي 2x إلى كل من 368 بئرا (تنسيق 384 بئرا).
    ملاحظة: تعمل اللوحة الأولى كخزان للحصول على ما يكفي من الكاشف لإجراء التجارب مرتين.

3. ضع مركبات الاختبار أو المستخلصات في قاع كل بئر في لوحة الفحص

  1. ضع 0.5 ميكرولتر من كل مركب في قاع اللوحة باستخدام ذراع روبوت من اللوحة الأم للمكتبة ، بما في ذلك مركبات الاختبار.
  2. أضف 0.5 ميكرولتر من DMSO إلى كل من التحكم السلبي والإيجابي.

4. تحضير خليط تفاعل الإنزيم وبداية التفاعل

  1. تحضير محلول تفاعل الإنزيم كما هو موضح في الجدول 2.
  2. أضف NTPase (التركيز النهائي هو 0.0002 ميكروغرام / مل) إلى 50 مل من خليط تفاعل الإنزيم ، واخلطه بسرعة وانقله إلى خزان بلاستيكي.
  3. استمر في حقن 4.5 ميكرولتر في وقت واحد في كل بئر باستثناء خط التحكم السالب باستخدام ذراع الروبوت.
  4. أضف نفس الكمية من خليط تفاعل الإنزيم مع PBS بدلا من الإنزيم الذي يسبقه الحقن المتزامن.
  5. ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

5. إجراء قياس في الوقت الفعلي للأنشطة الأنزيمية باستخدام قارئ الألواح الدقيقة

  1. بعد 10 دقائق من الحضانة ، أضف في نفس الوقت 5 ميكرولتر من محلول تفاعل الفلورسنت الحيوي 2x إلى كل بئر على الفور باستخدام ذراع الروبوت.
  2. أوقف ذراع الروبوت مؤقتا لتثبيت المحلول في كل طرف فوق الموقع الذي سيتم وضع اللوحة فيه.
  3. بمجرد وضع لوحة الفحص في مكانها ، أعد تشغيل ذراع الروبوت.
    ملاحظة: لتجنب تشبع ADP المتولد ، قم بقياس شدة الفلورسنت على الفور.
  4. قم بتدوير اللوحة بسرعة (200 × جم لمدة 1 دقيقة) ، ثم ضع اللوحة في قارئ اللوحة.
  5. ابدأ القياس في الوقت الفعلي للتألق عند 540 نانومتر / 590 نانومتر (الإثارة / الانبعاث) كل دقيقة لمدة 1 ساعة.

6. تحليل النتائج

  1. احسب القيم كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) من العينات المشار إليها والمكررة في كل مجموعة تجريبية ؛ تكرار التجارب لضمان الاتساق.
  2. قم بإجراء دلالة إحصائية باستخدام اختبار t الخاص بالطالب.
  3. احسب القيم على أنها ذات دلالة إحصائية إذا كانت قيم P هي P < 0.05.
  4. احسب نسبة الإشارة إلى الخلفية (S / B) ونسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N) وعامل Z باستخدام الصيغ التالية:
    S / B = متوسط الترابط / متوسط السيارة
    S / N = (متوسط الترابط - متوسط المركبة) / مركبة الانحراف المعياري
    عامل Z = 1 - (3 × رابط الانحراف المعياري + مركبة الانحراف المعياري) / (متوسط الترابط - متوسط المركبة)
  5. تأكد من أن عامل S / B و S / N و Z أكثر من 3 و 10 و 0.5 على التوالي.
    ملاحظة: تأكد مما إذا كانت كل تجربة تفي بالمعيار العام الكافي لإجراء HTS كما هو مذكور في التقارير السابقة23،24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم تلخيص مبدأ الفحص في الشكل التكميلي 1 ويستند إلى تقرير سابق12،18. تم تصميم الاختبار بتنسيق 384 بئرا ، كما هو موضح في الشكل 1. تم تجنب أقصى اليمين واليسار على اللوحة. ثم تم استخدام الخطين المجاورين للخطين الأيمن والأيمن الأقصى كتحكم سلبي وتحكم إيجابي مع الإنزيم أو بدونه ، على التوالي (ن = 16). سمح ذلك بفحص 320 مركبا على اللوحة بسهولة. يشير الشكل 1 ب إلى اللوحة والحاوية وذراع الروبوت وأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد نجحنا في إنشاء نطاق ديناميكي عال جديد ومقايسة الدقة مع مزيج من مقايسة الإنزيم الكلاسيكي ومقايسة الفلورسنت ل ADP ، وهو المنتج النهائي من خلال ATPase ، بما في ذلك Tg و Nc ATPase22. من أجل إجراء HTS ، من المهم أن يكون للمقايسة قيم أفضل من عامل S / B و S / N و Z من مقايسة الإنزيم الكلاسيكي15،22. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حذف خطوة إيقاف تفاعل الإنزيم مع حمض مثل حمض الهيدروكلوريك واستخدام قياس التألق في الوقت ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين مصلحة مالية في هذه الدراسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منصة اكتشاف الأدوية والمعلوماتية وعلوم الحياة الهيكلية ، وهي منحة للبحث العلمي (C) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS-21K06566). يشكر المؤلفون بصدق أساي (كلية الطب بجامعة كيو) وهارادا (معهد كيوتو للتكنولوجيا) وستيفن ستراتون على إهداء اثنين من الطفرات النشطة المؤتلفة NTPase ومساهمته في إعداد هذه المخطوطة ، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 محطة عمل المرحلة EDR-384 SXBiotec Co.، Ltd.EDR-384SXذراع روبوت نظام الأنابيب
384 نصائح جيدةللتكنولوجيا الحيوية المحدودةحسب الطلب
ADP-hexokinaseAsahi Kasei Pharma Co.، Ltd.T-92
ATPالخميرة الشرقية ، المحدودة45140000
BSAواكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة011-15144
ديافوراز آييونيتيكا المحدودةدي -1
DMSONacalai Tesch، Inc.13406-55
خميرة شرقية منزعجة الهيدروجين G6Pالمحدودة306-50143
الجلوكوزواكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة049-31165
Greiner 384 بئر ضحل غير ملزم بئر ضحل أسود# 784900
HEPESWako Pure Chemical Industries، Ltd.342-01375
ملغ (CH3< / sub>COO) 2< / sub>واكو للصناعات الكيميائية النقية المحدودة130-00095
NADPالشرقية الخميرة المحدودة44332000
N-ethylmaleimideواكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة056-02062
فيراستار إف إسبي إم جي لابتك اليابان ذ.م.قارئ الألواح الدقيقة PHERAstar FSمتعدد الأوضاع
ResazurinWako Pure Chemical Industries، Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 بئر خزاناتالأنظار S30022 25 / CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries، Ltd.W01COBQE-4120
تريتون X-100ناكالاي تيش ، إنك.35501-02
منخفضة

المراجع

  1. Bianca, C. B., et al. A robotic platform to screen aqueous two-phase systems for overcoming inhibition in enzymatic reactions. Bioresource Technology. 280, 37-50 (2019).
  2. Aliaksei, V., Jan, D. B. Robot-scientists will lead tomorrow's biomaterials discovery. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 74-80 (2018).
  3. Mandeep, D., Kusum, P., Dharini, P., Nikolaos, E. L., Pratyoosh, S. Robotics for enzyme technology: innovations and technological perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105, 4089-4097 (2021).
  4. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , Elsevirer. Amsterdam, The Netherlands. (2008).
  6. Schäfer, G., et al. Immediate versus deferred antiretroviral therapy in HIV-infected patients presenting with acute AIDS-defining events (toxoplasmosis, Pneumocystis jirovecii-pneumonia): A prospective, randomized, open-label multicenter study (IDEAL-study). AIDS Research and Therapy. 16, 34(2019).
  7. Ramanan, P., et al. Toxoplasmosis in non-cardiac solid organ transplant recipients: A case series and review of literature. Transplant Infectious Disease. 26, 13218(2019).
  8. Rivera, E. M., et al. Toxoplasma gondii seropositivity associated to peri-urban living places in pregnant women in a rural area of Buenos Aires province, Argentina. Parasite Epidemiology and Control. 7, 00121(2019).
  9. Donahoe, S. L., Lindsay, S. A., Krockenberger, M., Phalen, D., Šlapeta, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife. International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife. 4, 216-238 (2015).
  10. Crookshanks, J. L., Taylor, S. M., Haines, D. M., Shelton, G. D. Treatment of canine pediatric Neospora caninum myositis following immunohistochemicalidentification of tachyzoites in muscle biopsies. TheCanadian Veterinary Journal. 48, 506-508 (2007).
  11. Bartner, L. R., et al. Testing for Bartonella ssp. DNA in cerebrospinal fluid of dogs with inflammatory central nervous system disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 32, 1983-1988 (2018).
  12. Changoluisa, D., Rivera-Olivero, I. A., Echeverria, G., Garcia-Bereguiain, M. A., de Waard, J. H. Working group "Applied Microbiology" of the School of Biological Sciences and Engineering at Yachay Tech University. Serology for Neosporosis, Q fever and Brucellosis to assess the cause of abortion in two dairy cattleherds in Ecuador. BMC Veterinary Research. 15, 194(2019).
  13. Serrano-Martínez, M. E., et al. Evaluation of abortions spontaneously induced by Neospora caninum and risk factors in dairy cattle from Lima, Peru. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria. 28, 215-220 (2019).
  14. Matoba, K., et al. Crystallization and preliminary X-ray structural analysis of nucleoside triphosphate hydrolases from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 66, 1445-1448 (2010).
  15. Nakaar, V., Beckers, C. J., Polotsky, V., Joiner, K. A. Basis for substrate specificity of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase. Molecular and Biochemical Parasitology. 97, 209-220 (1998).
  16. Pastor-Fernández, I., et al. The tandemly repeated NTPase (NTPDase) from Neospora caninum is a canonical dense granuleprotein whose RNA expression, protein secretion and phosphorylation coincides with the tachyzoite egress. Parasites and Vectors. 9, 352(2016).
  17. Silverman, J. A., et al. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. Journal of Biological Chemistry. 273, 12352-12359 (1998).
  18. Olias, P., Sibley, L. D. Functional analysis of the role of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolases I and II in acute mouse virulence and immune suppression. Infection and Immunity. 84, 1994-2001 (2016).
  19. Leineweber, M., et al. First Characterization of the Neospora caninum Dense Granule Protein GRA9. BioMed Research International. 2017, 6746437(2017).
  20. Krug, U., Zebisch, M., Krauss, M., Sträter, N. Structural insight into activation mechanism of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphatediphosphohydrolases by disulfide reduction. Journal of Biological Chemistry. 287, 3051-3066 (2012).
  21. Kumagai, K., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T. Development of a highly sensitive, high-throughput assay for glycosyltransferases using enzyme-coupled fluorescence detection. Analytical Biochemistry. , 146-155 (2014).
  22. Harada, M., et al. Establishment of novel high-standard chemiluminescent assay for NTPase in two protozoans and its high-throughput screening. Marine Drugs. 18, 161(2020).
  23. Kurata, R., et al. Establishment of novel reporter cells stably maintaining transcription factor-driven human secreted alkaline phosphatase expression. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, 224-231 (2018).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.