الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي أساسي مسؤول عن توليد الطاقة في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك خلايا الكبد. هنا ، نصف طريقة لقياس أكسدة β الأحماض الدهنية في خلايا الكبد الأولية المعزولة حديثا باستخدام 14حمض بالمتيك المسمى C.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في تعليق خلايا الكبد الفئران المعزولة حديثا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي رئيسي لتلبية متطلبات الطاقة في الكبد وتوفير الركائز والعوامل المساعدة لعمليات إضافية ، مثل تكوين الكيتون وتكوين الجلوكوز ، والتي تعد ضرورية للحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله ودعم وظيفة العضو خارج الكبد في حالة الصيام. يحدث أكسدة β الأحماض الدهنية داخل الميتوكوندريا والبيروكسيزومات ويتم تنظيمها من خلال آليات متعددة ، بما في ذلك امتصاص وتنشيط الأحماض الدهنية ، ومستويات التعبير عن الإنزيم ، وتوافر العوامل المساعدة مثل الإنزيم المساعد A و NAD +. في الفحوصات التي تقيس أكسدة الأحماض الدهنية β في متجانسات الكبد ، يخفي تحلل الخلايا والإضافة الشائعة للمستويات فوق الفسيولوجية للعوامل المساعدة آثار هذه الآليات التنظيمية. علاوة على ذلك ، من الصعب التحكم في سلامة العضيات في المتجانسات ويمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين المستحضرات. قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في خلايا الكبد الأولية السليمة يتغلب على المزالق المذكورة أعلاه. يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس أكسدة الأحماض الدهنية β في تعليق خلايا الكبد الأولية للفئران المعزولة حديثا والمحتضنة ب 14حمض بالمتيك المسمى C. من خلال تجنب ساعات إلى أيام من الثقافة ، تتمتع هذه الطريقة بميزة الحفاظ بشكل أفضل على مستويات التعبير عن البروتين ونشاط المسار الأيضي للكبد الأصلي ، بما في ذلك تنشيط الأحماض الدهنية β الأكسدة التي لوحظت في خلايا الكبد المعزولة من الفئران الصائمة مقارنة بالفئران التي تم إطعامها.
المقدمة
الأحماض الدهنية β الأكسدة هي عملية أساسية في استقلاب الدهون ، مما يوفر مسارا تقويضيا لتحقيق التوازن بين تخليق الأحماض الدهنية وتناولها من النظام الغذائي. تولد هذه العملية الطاقة لأعضاء متعددة ، بما في ذلك عضلة القلب وقشرة الكلى والكبد الصائم ، وتستخدم الأحماض الدهنية التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي ، وتحلل الدهون في الأنسجة الدهنية ، ومخازن الدهون الثلاثية الداخلية 1,2.
تؤدي أكسدة الأحماض الدهنية من خلال مسار أكسدة β إلى تقصير متسلسل لسلسلة الأسيل الدهني بواسطة كربونين في وقت واحد ، يتم إطلاقهما على شكل أسيتيل CoA ، وتحدث هذه العملية في كل من الميتوكوندريا والبيروكسيزومات. في....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية على الفئران (C57BL/6J ، الذكور ، 9-11 أسبوعا من العمر) من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) بجامعة ويست فرجينيا.
1. عزل خلايا الكبد
- اعداد
- في الأيام التي تسبق عزل خلايا الكبد، قم بإعداد المخازن المؤقتة ووسائط زراعة الخلايا المدرجة في الجدول 1. قم بإعداد حمام مائي مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية بالقرب من المكان الذي سيتم فيه إجراء الجراحة.
- في يوم عزل خلايا الكبد ، تحت غطاء التدفق الرقائقي ، قم بنقل 35 مل من Buffer 1 إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل و 70 مل من Buffer 2 إلى كوب أو زجاجة معقمة سعة 100 مل.
- أضف المضادات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عادة ما ينتج عن تروية الكبد الموصوفة هنا 30-40 مليون خلية / كبد بمتوسط صلاحية يبلغ 80٪ ، كما هو مقدر من خلال استبعاد التربان الأزرق (الشكل 2). التركيز النموذجي للجلوكوز في المخزن المؤقت Krebs-Henseleit (KHB) ، والذي يستخدم لإعداد المخازن المؤقتة للتروية 1 و 2 ، هو 11 mM. عند قياس أكسدة β الأحماض الدهنية في خلايا الكبد المعزولة من الفئران الصائمة ، يمكن خفض تركيز الجلوكوز في KHB لتمثيل حالة الصيام بشكل أفضل. كما هو موضح في الشكل 2 ، فإن خفض تركيز الجلوكوز إلى 5.6.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أثناء تروية الكبد ، من الأهمية بمكان تجنب إدخال فقاعات الهواء ، لأنها تمنع الشعيرات الدموية الدقيقة في الكبد ، مما يمنع أو يقيد الدورة الدموية العازلة ويقلل بشكل عام من غلة خلايا الكبد وقابليتها للحياة20,21. يمكن للاحتياطات ، مثل فحص خط المدخل المملوء بالمخزن المؤقت عن كثب قبل تعليب IVC وتجنب رفع خط المدخل من الأنبوب الذي يحتوي على Buffer 1 للتبديل إلى Buffer 2 ، كما هو موضح هنا ، أن تقلل بنجاح من عدد التروية الفاشلة (الجدوى <70٪). استخدام مصائد الفقاعات في نظام .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM119528 إلى روبرتا ليوناردي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (R) - (+) - ملح الصوديوم إيتوموكسير | Tocris Bioscience | 4539 / 10 | |
| [1-14C] - حمض البالمتيك ، 50 & ndash ؛ 60 مللي Ci / ملي مول ، 0.5 مللي Ci / مل | كيماويات أمريكية ذات علامات إشعاعية | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES ، معقمة | Corning | 25060CI | |
| 10 & micro ؛ L الشعيرات الدموية / المكابس التي يمكن التخلص منها لماصة الإزاحة الإيجابية | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 & micro ؛ لتر ، 200 وميكرو ؛ L ، و 10 & ماصات وأطراف | |||
| 5 مل و 10 مل و 25 مل ماصات | |||
| 50 مل أنابيب طرد مركزي معقمة | CellTreat | 229421 | |
| 70٪ حمض بيركلوريك | فيشر Scientific | A2296-1LB | |
| BSA ، خالية من الأحماض الدهنية | فيشر ساينتفيك | BP9704100 | |
| CaCl 2< / sub> ثنائي هيدرات | MilliporeSigma | 223506 | |
| D- (+) - الجلوكوز | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| نظام الترشيح ، 0.22 & mu ؛ مرشح م PES ، 500 مل ، CellTreat | معقم 229707 | ||
| جنتاميسين كبريتات | جولد بيوتكنولوجي | G-400-25 | |
| HDPE ، 6.5 مل قوارير تلألؤ | فيشر ساينتفيك | 03-342-3 | |
| الدم | |||
| تحت الجلد إبر 22 جم ، 1.5 في | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | فيشر العلمي | BP366-1 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | مزيج محدد من الكولاجيناز المنقى الأول والثاني بتركيز متوسط من الثيرموليسين |
| M199 متوسط | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4< / sub> سباعي الهيدرات | MilliporeSigma | M1880 | |
| أجهزة الطرد المركزي | الدقيقة فيشر Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| مقص تشريح دقيق | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3< / sub> | Acros Organics | 424270010 | |
| حمض البالمتيك | MilliporeSigma | P0500 | |
| البنسلين / الستربتومايسين (100x) | Gibco | 15140122 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| ماصة الإزاحة الإيجابية MR-10 ، 10 & micro ؛ L | Mettler Toledo | 17008575 | |
| جهاز طرد مركزي مبرد مع إدخالات لأنابيب مخروطية سعة 50 مل | Eppendorf | 5810 R | |
| مستدير القاع ، 14 مل ، أنابيب اختبار ثقافة البولي بروبلين | فيشر Scientific | 14-956-9A | |
| عداد الوميض | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD كوكتيل | فيشر Scientific | SX18-4 | |
| حمام مائي يهتز ، سعة 30 لتر | نيو برونزويك العلمي | ؛ موديل G76 | |
| مصافي الخلايا المعقمة ، 100 وميكرو ؛ م | فيشر العلمي | 22363549 | |
| ملقط تضميد الإبهام | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| مضخة تمعجية متغيرة التدفق | حمامات مائية 138762 | ||
| فيشر Scientific ، 2 & ndash ؛ سعة |
المراجع
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
