إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية للفأر في الخلايا الصباغية

ملخص

هنا ، نصف نظام إعادة برمجة مباشر محسن للخلايا الصباغية ونظام تعبئة فيروسات عالي الكفاءة ومركز يضمن إعادة برمجة مباشرة سلسة.

الملخص

فقدان وظيفة الخلايا الصباغية يؤدي إلى البهاق ، مما يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. في الوقت الحاضر ، لا يوجد علاج فعال طويل الأجل للبهاق. لذلك ، من الضروري تطوير علاج مناسب وفعال للبهاق. يبدو أن تقنية الطب التجديدي لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية هي علاج جديد واعد للبهاق. وهذا ينطوي على إعادة برمجة مباشرة من خلايا الجلد المريض إلى الخلايا الصباغية الوظيفية للمساعدة في تخفيف فقدان الخلايا الصباغية في المرضى الذين يعانون من البهاق. ومع ذلك ، يجب اختبار هذه الطريقة أولا على الفئران. على الرغم من أن إعادة البرمجة المباشرة تستخدم على نطاق واسع ، إلا أنه لا يوجد بروتوكول واضح لإعادة البرمجة المباشرة في الخلايا الصباغية. علاوة على ذلك ، فإن عدد عوامل النسخ المتاحة ساحق.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول نظام تغليف فيروس lentivirus المركز لإنتاج عوامل النسخ المختارة لإعادة برمجة خلايا الجلد إلى الخلايا الصباغية ، بما في ذلك Sox10 و Mitf و Pax3 و Sox2 و Sox9 و Snai2. أصيبت الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFs) بفيروس lentivirus المركز لجميع عوامل النسخ هذه لإعادة البرمجة المباشرة ل MEFs إلى الخلايا الصباغية المستحثة (iMels) في المختبر. علاوة على ذلك ، تم فحص عوامل النسخ هذه ، وتم تحسين النظام لإعادة البرمجة المباشرة إلى الخلايا الصباغية. تم زيادة التعبير عن العلامات المميزة للميلانين في iMels على مستوى الجين أو البروتين بشكل كبير. تشير هذه النتائج إلى أن إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية يمكن أن تكون استراتيجية علاجية جديدة ناجحة للبهاق وتؤكد آلية تطور الخلايا الصباغية ، والتي ستوفر الأساس لمزيد من إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية في الجسم الحي.

المقدمة

البهاق هو مرض جلدي يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. لأسباب مختلفة ، بما في ذلك تشوهات التمثيل الغذائي ، والإجهاد التأكسدي ، وتوليد الوسطاء الالتهابيين ، وانفصال الخلايا ، واستجابة المناعة الذاتية ، يتم فقدان الخلايا الصباغية الوظيفية ، ويتم إيقاف إفراز الميلانين ، مما يؤدي إلى تطور البهاق ^1,2. تحدث هذه الحالة على نطاق واسع وهي مشكلة خاصة على الوجه. العلاج الرئيسي هو الاستخدام النظامي للكورتيكوستيرويدات وأجهزة المناعة. يمكن استخدام العلاج الضوئي للأمراض الجهازية أو المحلية ، وهناك علاجات جراحية ، مثل زرع الجلد المثقب وزرع الخلايا الصباغية الذاتية³،

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة إدارة واستخدام المختبر في جامعة جيانغسو (UJS-IACUC-AP--20190305010). تم إجراء التجارب وفقا للمعايير التي وضعتها جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية المختبرات (AAALAC International). لم تكن هناك تجارب تشمل البشر ، لذلك لم يكن هذا العمل بحاجة إلى موافقة من لجنة أخلاقيات البحوث البشرية. ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف.

1. بناء نظام تغليف فيروس lentivirus مركز لعوامل النسخ

1. إنتاج الفيروس المركز (الشكل 1 ألف، باء)
   1. طبق 1.5 × 10⁶ خلايا HEK-293T في طبق 60 مم واستزرع هذه الخلايا بوسط طبيعي (انظر....

النتائج

تتضمن هذه المقالة بروتوكولات نظام تغليف فيروس lentivirus المركز لإنتاج lentivirus من عوامل النسخ لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية وبروتوكولات لفحص عوامل النسخ وإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية من MEFs.

تم تقييم نجاح إنتاج فيروس lentivirus المركز من خلال ملاحظة شدة التألق ل GFP (الشكل 1A) أو عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 1B) بعد إصابة خلايا HEK-293T لمدة 48 ساعة بفيروس lentivirus غير المركز (1x) و.......

المناقشة

تعد جودة الفيروس أمرا بالغ الأهمية لنجاح إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية في هذا البروتوكول. طريقة تعبئة وتركيز الفيروسات في هذا البروتوكول بسيطة وسهلة التكرار ولا تعتمد على أي كاشف مركز مساعد. يمكن اتباع هذا البروتوكول بنجاح في معظم المختبرات. لضمان جودة الفيروس المركز ، تحتاج النقاط التالية إلى اهتمام خاص. واحد هو حالة خلية HEK-293T. على الرغم من أن خلايا HEK-293T هي خلايا مخلدة ، إلا أن الخلايا المستخدمة لصنع الفيروس المركز يجب أن تكون خلايا سليمة في غضون 10 ممرات (يتناقص العيار مع مرور أعلى).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.05٪ Trypsin-EDTA	Gibco	25300-062	مخزنة عند -20 درجة ؛ ج
0.45 مو ؛ مرشح M	Millipore	SLHVR33RB
5 مل أنبوب دائري من البوليسترين	Falcon	352052
95٪ / 100٪ إيثانول	LANBAO	210106	مخزنة في RT
Adenine	Sigma	A2786	تركيز المخزون 40 مجم / مل التركيز النهائي 24 & micro ؛ جم / مل
Alexa Fluor 555 الماعز المضاد للفأر IgG2a	Invitrogen	A21137	تخفيف 1: 500 لاستخدام
المضادات الحيوية (القلم / البكتيريا)	Gibco	15140-122	المخزنة عند -20 درجة ؛ C
Anti-TRP1 / TYRP1 الأجسام المضادة	Millipore	MABC592	المضيف / النمط المتماثل: الفأر IgG2a تفاعل الأنواع: الفأر / الإنسان تخفيف 1: 200 لاستخدام
Anti-TRP2 / DCT الأجسام المضادة	Abcam	ab74073	المضيف / النمط المتماثل: Rabbit IgG تفاعل الأنواع: الفأر / التخفيف البشري 1: 200 لاستخدام
CHIR99021	Stemgent	04-0004	تركيز المخزون 10 mM نهائي التركيز 3 &MU ؛ M
توكسين الكوليرا	Sigma	C8052	تركيز المخزون 0.3 مجم / مل التركيز النهائي 20 pM
Cy3 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) Jackson	Immunoresearch	111-165-144	تخفيف 1: 500 لاستخدام
DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز)	HyClone	SH30243.01	مخزنة عند 4 درجة ؛ ج
DMSO	Sigma	D2650	مخزنة في RT
FBS	Gibco	10270-106	مخزنة عند -20 درجة ؛ C معطل بالحرارة قبل الاستخدام
الجيلاتين	Sigma	G9391	المخزن في
بلازميدات RT GFP-PURO (MITF ، Sox10 ، Pax3 ، Sox2 ، Sox9 و Snai2)	Hanheng Biological Technology Co.، Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	مخزنة عند -20 درجة ؛ C
Hematoxylin	Abcam	ab220365	مخزنة في RT
Human EDN3	American Peptide	88-5-10A	تركيز المخزون 100 مو ؛ M التركيز النهائي 0.1 & mu ؛ M
هيدروكورتيزون	سيجما	H0888	تركيز المخزون 100 & ميكرو; جم / مل التركيز النهائي 0.5 & ميكرو ؛ g / mL
L-DOPA	Sigma	D9628	مخزنة في RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	كاشف التعداء ، مخزنة في 4 درجات ؛
مجموعة تلطيخ C Masson-Fontana	Solarbio	G2032	مخزنة عند 4 درجات ؛ C
بلسم محايد	Solarbio	G8590	مخزن في 4 درجات ؛ C
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	المخزن في RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	المخزن في RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)	Sigma	P8139	تركيز المخزون 1 mM التركيز النهائي 200 نانومتر
Polybrene	Sigma	H9268	كاشف تعداء بوليمري كاتيوني ؛ تركيز المخزون 8 مو ؛ ز /& مايكرو ؛ L التركيز النهائي 4 نانوغرام /& ميكرو ؛ L
Puromycin	Gibco	A11138-03	مخزنة عند -20 درجة ؛ ج
المؤتلف البشري bFGF	Invitrogen	13256-029	تركيز المخزون 4 مو ؛ جم / مل < br / > التركيز النهائي 10 نانوغرام / مل
الأنسولين البشري المؤتلف	سيجما   ؛	I3536	تركيز المخزون 10 ملغم/مل التركيز النهائي 5 & جم / مل
مؤتلف SCF البشري	R & D	255-SC-010	تركيز المخزون 200 مو ؛ جم / مل التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل
RPMI-1640	Gibco	11875-093	مخزنة عند 4 درجات ؛ C
Xylene	Sigma	1330-20-7	مخزنة في RT