توضح هذه المقالة تغليف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك. نحن نثبت أن تقنية تغليف الموائع الدقيقة هذه تمكن من التكوين الفعال للكرويات hPSC.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصنيع الموائع الدقيقة للكبسولات الدقيقة Core-Shell التي تحمل كرويات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) أو الكروية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) فوائد تحسين نتائج التمايز وقابلية التوسع. في هذه الورقة ، نصف استراتيجية للتكوين القوي والقابل للتكرار للكرويات hPSC حيث يتم استخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك لمحاصرة hPSCs داخل كبسولات microcapsule الأساسية shell. يحتوي الحل الأساسي على تعليق خلية واحدة من hPSCs وتم جعله لزجا من خلال دمج البولي (الإيثيلين جلايكول) عالي الوزن الجزيئي (PEG) ووسائط تدرج الكثافة. يتكون تيار القشرة من PEG-4 arm-maleimide أو PEG-4-Mal ويتدفق جنبا إلى جنب مع التيار الأساسي نحو تقاطعين نفطيين متتاليين. حدث تكوين القطيرات عند تقاطع الزيت الأول مع محلول قذيفة يلتف حول القلب. حدث التشابك الكيميائي للقذيفة عند تقاطع الزيت الثاني عن طريق إدخال رابط متقاطع ثنائي الثيول (1,4-dithiothreitol أو DTT) إلى هذه القطرات. يتفاعل الرابط المتقاطع مع المجموعات الوظيفية الماليميدية عبر كيمياء النقر ، مما يؤدي إلى تكوين قشرة هيدروجيل حول الكبسولات الدقيقة. أنتجت تقنية التغليف الخاصة بنا كبسولات قطرها 400 ميكرومتر بمعدل 10 كبسولات في الثانية. تحتوي الكبسولات الناتجة على قشرة هيدروجيل ونواة مائية سمحت للخلايا المفردة بالتجمع بسرعة في مجاميع وتشكيل كرويات. لم تؤثر عملية التغليف سلبا على صلاحية hPSCs ، حيث لوحظت قابلية >95٪ من الجدوى بعد 3 أيام من التغليف. وللمقارنة، فإن مركبات الكربون الهيدروكلورية المغلفة في جسيمات هلامية صلبة (بدون نواة مائية) لم تشكل كرويات وكان لها قابلية <50٪ قابلة للحياة بعد 3 أيام من التغليف. حدث التكوين الكروي ل hPSCs داخل الكبسولات الدقيقة ذات الغلاف الأساسي في غضون 48 ساعة بعد التغليف ، مع كون القطر الكروي دالة على كثافة تلقيح الخلايا. بشكل عام ، كانت تقنية تغليف الموائع الدقيقة الموصوفة في هذا البروتوكول مناسبة تماما لتغليف hPSCs وتشكيل كروي.
المقدمة
هناك اهتمام كبير في الثقافات ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بسبب تحسين تعدد القدرات وإمكانات التمايز التي يوفرها تنسيق الثقافة هذا1،2،3. عادة ما يتم تشكيل hPSCs في كرويات أو تنسيقات أخرى للثقافة ثلاثية الأبعاد عن طريق المفاعلات الحيوية والآبار الدقيقة والمواد الهلامية المائية والسقالات البوليمرية4،5،6. يوفر التغليف وسيلة أخرى لتنظيم hPSCs مفردة في كرويات. بمجرد تغليف الكريات hPSC ، يمكن التعامل معها بسهولة ونقلها إلى لوحات microtiter للتمايز أو نمذجة الأمراض أو تجارب اختبار المخدرات. كما أن تغليف hPSCs في طبقة هيدروجيل يحمي الخلايا من تلف القص ويسمح بزراعة الكرويات في مفاعل حيوي بمعدلات عالية من التحريك7.
تطورت منهجيتنا لتغليف الخلايا الجذعية بمرور الوقت. أولا، ركزنا على الجسيمات الدقيقة الهيدروجيل الصلبة وأظهرنا نجاحا في تغليف وزراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESCs)8. ومع ذلك، لوحظ أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لها صلاحية منخفضة عند تغليفها في مثل هذه الجسيمات الدقيقة الهيدروجيلية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة حاجة هذه الخلايا إلى إعادة الاتصال بين الخلايا والخلايا بعد التغليف. لقد استنتجنا أن الكبسولة الدقيقة غير المتجانسة ، التي تمتلك نواة مائية ، قد تكون أكثر ملاءمة لتغليف الخلايا التي تعتمد على إعادة التأسيس السريع لاتصالات الخلايا الخلوية. تم تكييف مفهوم جهاز الموائع الدقيقة الذي يركز على التدفق المحوري المشترك لصنع كبسولات صغيرة من الغلاف المائي الأساسي / الهيدروجيل من He et al.9 ، ولكن بدلا من الجينات المستخدمة في النهج الأصلي ، تم دمج هيدروجيل قائم على PEG في القشرة. لقد أظهرنا لأول مرة التغليف الناجح والتكوين الكروي لخلايا الكبد الأولية في الكبسولات الدقيقة ذات القشرة الأساسية10 ووصفنا مؤخرا تغليف خلايا hES و iPS7. كما هو موضح في الشكل 1A ، يتم تصنيع الكبسولات في جهاز تركيز التدفق حيث تنتقل تيارات التدفق الصدفي والأساسي من جانب إلى آخر إلى التدفق المحوري المشترك قبل الطرد إلى مرحلة الزيت. يحتوي التدفق الأساسي على خلايا وإضافات تزيد من لزوجة المحلول (PEG MW 35kD غير التفاعلي و iodixanol - الاسم التجاري OptiPrep) بينما يحتوي تيار القشرة على جزيئات تفاعلية (PEG-4-Mal). يتم فصل تيار التدفق المحوري المشترك المستمر إلى قطرات تحتفظ ببنية الغلاف الأساسي. يتم جعل بنية الغلاف الأساسي دائمة عن طريق التعرض ل di-thiol crosslinker (DTT) ، والذي يتفاعل مع PEG-4-Mal عبر كيمياء النقر ويؤدي إلى تكوين جلد هيدروجيل رقيق (~ 10 ميكرومتر) أو قذيفة. بعد كسر المستحلب ونقل الكبسولات إلى مرحلة مائية ، تنتشر جزيئات PEG من القلب ويتم استبدالها بجزيئات الماء. هذا يؤدي إلى كبسولات مائية أساسية وهيدروجيل قذيفة.
فيما يلي إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية صنع أجهزة الموائع الدقيقة ، وكيفية تحضير الخلايا ، وكيفية إجراء تغليف hPSCs.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصنيع الجهاز
- قم بعمل تصميمات لجهاز التغليف الدقيق وجهاز التفكك باستخدام برنامج CAD10,11.
- قم بتغطية الطبقات الثلاث من SU-8 المقاومة للضوء بالتتابع على رقاقة السيليكون (الشكل 2A) لتحقيق هياكل ذات ارتفاعات مطلوبة: 60 و 100 و 150 ميكرومتر.
ملاحظة: عملية القوالب العلوية والسفلية متطابقة.- قم بتغطية رقاقة سيليكون نظيفة مقاس 10 سم مع مقاومة سلبية للضوء SU-8 2025 عند 1100 دورة في الدقيقة لإنشاء أول طبقة 60 ميكرومتر. بعد الخبز الناعم عند 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على صفيحة ساخنة ، قم بفضح القالب باستخدام مصفف بدون قناع عن طريق تحميل ملف تصميم نمط القناة الأساسية إلى جهاز الكمبيوتر μPG 101. ثم تابع خبز ما بعد التعرض عند 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وعند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتدوير طبقة SU-8 2025 الثانية (40 ميكرومتر) عند 1500 دورة في الدقيقة وقم بعرضها عن طريق تحميل ملف CAD المناسب لنمط قناة shell.
ملاحظة: كانت المخبوزات اللينة وما بعد التعرض مشابهة للخطوة السابقة. - قم بتدوير طبقة SU-8 2025 الثالثة عند 1400 دورة في الدقيقة لتحقيق ارتفاع 50 ميكرومتر وتكرار العملية المذكورة أعلاه ولكن كشف الهياكل لمرحلة الزيت.
- قم بتطوير القالب مع جميع الطبقات الثلاث في خطوة واحدة عن طريق الغمر في مطور SU-8 حتى تتم إزالة جميع مقاومة الضوء غير المكشوفة.
- اخبز القالب بقوة على صفيحة ساخنة عند 160 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحسين الالتصاق وختم الشقوق الطفيفة التي يمكن أن تظهر بعد التطور.
- قم بتعريض القالب للكلوروتريميثيل سيلان لتجنب ربط المطاط الصناعي في الخطوة التالية وضعه في أطباق بتري 15 سم حتى الاستخدام.
- قم بإعداد قالب جهاز التفكك بنفس الطريقة ، كما هو موضح في الشكل 1D والشكل 2B. قم بتدوير طبقة واحدة من مقاومة الضوء SU-8 على رقاقة سيليكون ، كما هو موضح سابقا في الخطوة 1.2.3 ، لتحقيق هياكل ذات الارتفاع المطلوب: 50 ميكرومتر. قم بإجراء الخبز الناعم وما بعد التعرض ، والتطوير ، والخبز الصلب بشكل مشابه للخطوة السابقة.
ملاحظة: غطت مجموعة من الوظائف المثلثة الشكل الغرفة بأكملها، مع تناقص التباعد بين الوظائف مع انخفاض عرض الغرفة باتجاه المنفذ. كانت أعمدة المثلث 200 ميكرومتر لكل جانب مع درجة تتراوح من 400 ميكرومتر (عند المدخل) إلى 30 ميكرومتر (عند المخرج). - تحضير القوالب عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS).
- امزج قاعدة المطاط الصناعي PDMS وعامل معالجة المطاط الصناعي بنسبة 10: 1 واط / واط في جهاز طرد مركزي كوكبي. صب الخليط على كل من القوالب الرئيسية للتغليف الدقيق والقالب الرئيسي للتفكك لإنشاء طبقة 3-4 مم.
ملاحظة: يكفي خليط من 50 جم من قاعدة المطاط الصناعي مع 5 جم من عامل المعالجة لتغطية قالب رئيسي بسماكة 3 مم. - ضع أطباق بتري التي تحتوي على القوالب في مجفف فراغ لمدة 15 دقيقة لإزالة الغاز من PDMS غير المعالج.
- انقل أطباق بتري إلى الفرن واخبزها على حرارة 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 60 دقيقة.
- قم بإزالة القوالب الرئيسية من الفرن واتركها تبرد. باستخدام سكين دقيق ، قم بقطع PDMS بعناية وفقا لشكل الرقاقة وقشر قطع PDMS من القالب الرئيسي.
- قم بقطع ألواح PDMS عن طريق تقليم حواف كل جهاز باستخدام مشرط ، ثم قم بثقب منافذ سائل المدخل / المخرج في جهاز التفكك وفقط في جهاز الموائع الدقيقة العلوي باستخدام إبر الفولاذ المقاوم للصدأ. قم بتغطية الأجهزة بشريط سحري لتجنب التلوث.
ملاحظة: مقياس الإبرة هو 14 جم و 15 جم لمنافذ المدخل والمخرج ، على التوالي. - للترابط ، عالج الجوانب المنقوشة لقطع PDMS العلوية والسفلية باستخدام بلازما O2 على محفور البلازما لمدة دقيقتين.
- قم بمحاذاة جزأي PDMS تحت منظار مجسمة بعد إضافة طبقة رقيقة منفصلة من الماء المقطر مباشرة في القنوات الدقيقة (2 ميكرولتر).
- ضع جهاز PDMS المحاذاة في الفرن على درجة حرارة 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لإكمال الترابط واستعادة PDMS إلى حالته الأصلية الكارهة للماء. قم بتخزين الأجهزة حتى مزيد من الاستخدام.
ملاحظة: ينتج عن ذلك جهاز تركيز تدفق محوري واحد بثلاثة ارتفاعات مختلفة تبلغ 120 ميكرومتر للنواة و 200 ميكرومتر للقذيفة و 300 ميكرومتر لقنوات النفط. - من أجل استخدام الجهاز مباشرة بعد الترابط البلازما ، قم بحقن 30 ميكرولتر بعناية ولكن بحزم من محلول الطلاء الكارهة للماء في القنوات المائعة لتحقيق طلاء مسعور. ثم ، قم على الفور بتطهير الهواء في القنوات حتى لا يتم ملاحظة أي بقايا من محلول الطلاء الكارهة للماء في الجهاز.
- قم بربط جهاز التفكك عن طريق معالجة الجانب المزخرف من الجهاز أولا وزجاج منزلق نظيف ببلازما O2 لمدة دقيقتين ، ثم قم بتجميعها لمزيد من المعالجة في الفرن عند 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن تخزين الأجهزة حتى الاستخدام مرة أخرى.
- امزج قاعدة المطاط الصناعي PDMS وعامل معالجة المطاط الصناعي بنسبة 10: 1 واط / واط في جهاز طرد مركزي كوكبي. صب الخليط على كل من القوالب الرئيسية للتغليف الدقيق والقالب الرئيسي للتفكك لإنشاء طبقة 3-4 مم.
2. إعداد الحلول
- حلول الأسهم. أولا ، قم بإعداد محاليل المخزون (المحاليل المركزة) التي سيتم تخفيفها إلى تركيزات أقل للاستخدام الفعلي.
ملاحظة: تستخدم حلول المخزون لتوفير وقت التحضير، والحفاظ على المواد، وتقليل مساحة التخزين، وتحسين الدقة عند إعداد حل عمل بتركيزات أقل.- قم بإعداد 30 مل من محلول أساسي 2x (16٪ PEG و 34٪ وسائط تدرج الكثافة): امزج 4.8 جم من 35 kDa PEG ، و 10.2 مل من وسائط تدرج الكثافة ، و 19.8 مل من وسائط DMEM / F12. قم بتصفية هذا الحل الأساسي باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
- تحضير 50 مل من الزيت المعدني مع 3 ٪ من الفاعل بالسطح: مزيج 48.5 مل من الزيت المعدني و 1.5 مل من الفاعل بالسطح. يحفظ في حالة معقمة بعد الترشيح من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
- تحضير 50 مل من الزيت المعدني مع 0.5 ٪ من الفاعل بالسطح: مزيج 49.75 مل من الزيت المعدني و 0.25 مل من الفاعل بالسطح. يحفظ في حالة معقمة.
- تحضير 1 M Dithiotheritol (DTT): إذابة 1.5425 غرام من DTT في 10 مل من الماء المقطر. يحفظ في حالة معقمة.
- تحضير 1 م ثلاثي إيثانولامين (TEA): أضف 66.4 ميكرولتر من الشاي في 433.6 ميكرولتر من الماء المقطر. يحفظ في حالة معقمة.
- تحضير 1 ٪ Pluronic F127 (PF127): إذابة 100 ملغ من PF127 في 10 مل من الماء المقطر. يحفظ في حالة معقمة.
- حلول العمل
- تحضير مستحلب كروس لينكر عن طريق خلط 4.5 مل من الزيت المعدني مع 3٪ من الفاعل بالسطح و 300 ميكرولتر من 1 M DTT (نسبة 1:15). دوامة الحل لمدة 2 دقيقة وسونيكات لمدة 45-60 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية في 20 درجة مئوية. قم بتحميل هذا الحل إلى حقنة سعة 5 مل بإبرة 27 جم.
ملاحظة: يتم توليد المستحلب عن طريق خليط الزيت / الماء الصوتي. - تحضير محلول زيت التدريع عن طريق تحميل الزيت المعدني مع 0.5٪ من الفاعل بالسطح إلى حقنة 5 مل مع إبرة 27 G.
- تحضير محلول القشرة (8٪ w/v PEG-4-Mal و 15 mM TEA) عن طريق إضافة 32 ملغ من PEG-4-Mal في 400 ميكرولتر من 1x DPBS لتشكيل محلول 8٪ w/v ، ودوامة المحلول لمدة دقيقتين. ثم ، أضف 6 ميكرولتر من 1 M TEA (التركيز النهائي 15 mM TEA). أخيرا ، جهاز طرد مركزي عند 13000 × g لمدة 5 دقائق من خلال مرشح دوار وإبقائه في الظلام على الروك لمدة 30 دقيقة. ثم ، قم بتحميل هذا الحل إلى حقنة 1 مل بإبرة 27 G.
ملاحظة: اترك حاوية PEG-4-Mal للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل فتح الغطاء، ونفخ غاز N 2 لاستبدال O 2 ب N2 قبل إغلاق الغطاء. دوامة الشاي قبل إضافة إلى الحل.
- تحضير مستحلب كروس لينكر عن طريق خلط 4.5 مل من الزيت المعدني مع 3٪ من الفاعل بالسطح و 300 ميكرولتر من 1 M DTT (نسبة 1:15). دوامة الحل لمدة 2 دقيقة وسونيكات لمدة 45-60 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية في 20 درجة مئوية. قم بتحميل هذا الحل إلى حقنة سعة 5 مل بإبرة 27 جم.
- تحضير تعليق الخلية في المحلول الأساسي
- عالج hPSCs بالتريبسين لمدة 5 إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم ، جمعها من لوحات. قم بإخماد التربسين بالوسط بعد انفصال الخلية ، ثم انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- جهاز طرد مركزي لتعليق الخلايا السائبة (400 × جم ، 5 دقائق). استنشق بعناية supernatant ثم أعد تعليق بيليه الخلية باستخدام الحد الأدنى من حجم وسط النمو. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا تلقائي.
ملاحظة: تحتوي أليكوتات الخلايا النموذجية على 12-20 × 106 خلايا وهي كافية لصنع 400 ميكرولتر من المحلول الأساسي. - خذ 12-20 × 106 خلايا من تعليق الخلايا السائبة وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية / الوسائط (400 × جم ، 5 دقائق).
- استنشق الوسائط بعناية من حبيبات الخلية. ثم ، أضف وسائط 200 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من محلول PEG 2x (التركيز النهائي 30-50 × 106 خلية / مل) واخلطها بلطف.
ملاحظة: أدت تركيزات الخلايا المنخفضة (أقل من 20 × 106 خلايا/مل) إلى العديد من الكبسولات الفارغة. - أضف 30 ميكرولتر من 1٪ PF127 إلى المحلول.
- أدخل قضيب تحريك صغير (2 مم × 7 مم) في حقنة سعة 1 مل ، ثم قم بتحميل الخلية التي تحتوي على محلول أساسي في المحقنة بإبرة 27 جم. حافظ على برودة المحلول بالثلج أثناء عملية التغليف بأكملها.
3. الإعداد التجريبي
- ضع جهاز قطرات PDMS المستعبد، بطول أربع قطع بطول 20 سم وقطعة واحدة من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل بطول 5 سم (0.38 مم I.D. × 1.1 مم O.D.)، وقطعة واحدة من أنبوب مخرج 10 سم (0.5 مم I.D. × 1.5 مم O.D.)، وست قطع من أنابيب التركيب 0.5 سم (1 مم ID.D. × 1.8 مم O.D.) تحت مصدر ضوء مبيد للجراثيم (عادة ما يكون مدمجا في خزانات السلامة البيولوجية) وتعقيمها لمدة 30 دقيقه.
- استخدم الملقط لتركيب الأنابيب في منافذ المدخل المائعة ومنافذ التفكك.
- استخدم القطع الثلاث من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل بطول 20 سم للقشرة والزيت ومداخل مستحلب الوصلة المتقاطعة وقطعة واحدة لمدخل جهاز التفكك. ثم ، أدخل الطرف الآخر من الأنابيب في إبرة المحقنة مع المحلول المقابل. وفي الوقت نفسه ، قم بتوصيل المدخل الأساسي لجهاز الموائع الدقيقة ومخرج جهاز التفكك بأنبوب ميكروتوبي واحد بحجم 5 سم (الشكل 1C).
ملاحظة: يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة للمدخل مثبتة بإحكام داخل الأنابيب المناسبة ، والتي تم إدخالها في الخطوة الأخيرة. - أدخل أنبوب مخرج واحد في منفذ مخرج الانسيابية وضع الطرف الآخر في خزان التجميع.
- ضع الجهاز على مرحلة المجهر وقم بتوصيل الأنبوب لتجنب التحرك. قم بمحاذاة المجهر وتركيزه على فوهة الجهاز لفحص التدفق.
- ضع كل حقنة على مضخات حقنة مختلفة وقم بتأمينها بشكل صحيح (الشكل 1B). قم ببرمجة كل مضخة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لمعدلات التدفق التالية: الأساسية (3-5 ميكرولتر / دقيقة) ، القشرة (3-5 ميكرولتر / دقيقة) ، زيت التدريع (20-80 ميكرولتر / دقيقة) ، وزيت الربط المتقاطع (40-60 ميكرولتر / دقيقة). بدء التدفق في جميع المضخات.
- انتظر حتى يدخل كل سائل إلى الجهاز واملأ القنوات أثناء دفع الهواء المتبقي للخارج.
ملاحظة: إذا كانت هناك كمية كبيرة من الهواء في أنابيب المدخل، فقم بزيادة كل معدل تدفق مؤقتا حتى تتم إزالة الهواء بالكامل. ضع في اعتبارك أن معدل التدفق المفرط يمكن أن يؤدي إلى فشل سندات PDMS إلى PDMS. - عندما يستقر تكوين الكبسولة (الشكل 3) ، ضع الطرف الآخر من أنبوب التجميع في أنبوب مخروطي جديد مع 5 مل من وسائط mTeSR.
ملاحظة: تحتوي الوسائط على مثبط ROCK 10 ميكرومتر ، و 100 U / mL البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. - بعد جمع عدد كاف من الكبسولات ، احتضنها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق. ستكون الكبسولات الموجودة في مرحلة الزيت في الجزء العلوي من الأنبوب (انظر الشكل 4A). يؤدي النقر بلطف على الأنبوب إلى إرسال كبسولات إلى الرواسب إلى القاع. بعد ذلك ، قد يتم شفط معظم النفط ووسائل الإعلام.
- جمع الكبسولات من الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي ، ووضعها على مصفاة خلية (حجم المسام 100 ميكرومتر) ، وغسلها بكميات وفيرة من الوسائط. بعد ذلك ، قم بجمع الكبسولات الدقيقة باستخدام وسائط 2 مل في لوحة استزراع 6 آبار عن طريق تشغيل الوسائط عبر المرشح أثناء قلبها أعلى لوحة البئر (انظر الشكل 4A).
4. زراعة وتحليل hPSC في كبسولات دقيقة
- الثقافة الأساسية
- احتضن كبسولات الخلايا الجذعية في طبق من 6 أطباق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- قم بتغيير الوسائط كل يومين عن طريق جمع الكبسولات على مرشح مصفاة الخلايا ، وغسلها بالوسائط الزائدة ، وإعادة تثبيتها في بئر جديد في ألواح 6 آبار مع وسائط 2 مل كما حدث في الخطوة 3.10.
- ثقافة الكبسولات لمدة 10 أيام على الأقل.
- إجراء الفحص الحي / الميت لتحديد جدوى الخلايا الجذعية المغلفة.
- إذابة محاليل الفحص الحية / الميتة (إيثيديوم هوموديمر-1 وكالسين AM).
- أضف 4 ميكرولتر من 2 ميكرومتر إيثيديوم هوموديمر-1 و 1 ميكرولتر من محاليل 4 ميكرومتر كالسيين AM إلى 2 مل من DPBS المعقمة. دوامة لضمان الخلط الكامل.
- جمع ما يقرب من 100 كبسولة صغيرة على مصفاة الخلايا وشطفها مع DPBS معقمة للسماح بانتشار المتوسطة من الكبسولات.
- اجمعها مرة أخرى إلى لوحة 12 بئر باستخدام 1 مل من المحلول المعد في الخطوة 4.2.2. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري.
ملاحظة: يتم تحديد صلاحية الخلية كميا عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الحية، التي يتم تصورها على أنها خضراء، من بين العدد الإجمالي للخلايا.
- توصيف حجم كروي.
- عند الرغبة ، ضع صفيحة البئر مع كبسولات صغيرة تحت المجهر وقم بقياس قطر الكرويات الموضحة في البرنامج ذي الصلة باستخدام قضبان مقياس مناسبة.
- قياس وتحليل حجم الكروية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باتباع البروتوكول المذكور أعلاه ، سيتمكن القارئ من تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة وإنتاج كبسولات دقيقة حاملة للخلايا. ويبين الشكل 3 ألف أمثلة على الكبسولات الدقيقة المثلى ودون المثلى المصنعة باستخدام توليد قطرات الموائع الدقيقة. أدت التركيبات المختلفة من PEG-4-Mal إلى كبسولات ذات مورفولوجيات مختلفة - ارتبطت الكبسولات المجعدة بالهلام الضعيف ، وانخفاض السلامة الميكانيكية ، ولم تتحمل الزراعة في مفاعل حيوي متحرك. تمثل الكبسولات الملساء التي لوحظت في محتوى PEG بنسبة >6٪ مورفولوجيا الكبسولة المطلو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تؤدي عملية التغليف الموصوفة هنا إلى تكوين كروي hPSC قابل للتكرار. يجعل شكل الكبسولة الدقيقة من السهل توزيع الكرويات في آبار صفيحة ميكروتيتر للتجارب التي تهدف إلى تحسين / تحسين بروتوكولات التمايز أو اختبار العلاجات. يمكن أيضا استخدام كرويات الخلايا الجذعية المغلفة في مزارع التعليق حيث تحمي قذيفة الهيدروجيل الخلايا من التلف الناجم عن القص7.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول. من المهم الحفاظ على معدلات تدفق تيارات القلب والقشرة والزيت ضمن النطاق الموضح في قسم ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال المنح المقدمة من مركز Mayo Clinic للطب التجديدي ، ومؤسسة J. W. Kieckhefer ، ومؤسسة آل نهيان ، والطب التجديدي في مينيسوتا (RMM 101617 TR 004) ، والمعاهد الوطنية للصحة (DK107255).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.22 وميكرو ؛ م مرشحات حقنة | جينيسي Scientific | 25-244 | |
| 1 مل حقنة طرف قفل | لوري BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4 أذرع PEG maleimide ، 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 مل حقنة طرف قفل | لور BD | 309646 | |
| 6 آبار غير المعالجة لوحة | الولايات المتحدة الأمريكية Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD برنامج | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 & micro ؛ حجم المسام م | 335583 | الكاردينال | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| الكونتيسة الثانية FL تقنية الحياة الأوتوماتيكية للخلايا | A27974 | ||
| لوحة تسخين رقمية | Dataplate | ||
| خلاط دوامة رقمية | فيشر Scientific | 215370 | |
| الماء المقطر | Gibco | 15230-162 | |
| ديثيوثيريتول (DTT) | سيجما | D0632-10G | |
| DMEM / F12 وسائل الإعلام | جيبكو | 11320-033 | |
| فالكون 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | فيشر العلمية | 14-959-53A | |
| فيشربراند أكوسبين مايكرو 17 أجهزة الطرد المركزي | الدقيقة لايف | 13-100-675 | |
| هيراسيل فيوس 160i حاضنة CO2 | 50144906 علمية | ||
| مجهر مضان مقلوب بمحركات | أوليمبوس | أوليمبوس IX83 | |
| لوريل سبين كوترز | لوريل تكنولوجيز | WS-650MZ-23NPPB | |
| طقم تلطيخ الثدييات الحية / الميتة | فيشر | L3224 | |
| دبابيس | الشريط السحري | 483535 | |
| الأنابيب الطبية الدقيقة (0.015 "معرف × 0.043" OD) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE / 2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Fallps | Fisher Scientific | XX6200006P | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | توريد CML | 901-14-025 | |
| إبر-الفولاذ المقاوم للصدأ 15 مقياس | CML توريد | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| فرن | حراري علمي | HERA THERM | |
| البنسلين: ستربتومايسين (10،000 وحدة / مل بنسلين G ، 10 مجم / مل ستربتومايسين) | الجوزاء | 400-109 | |
| بتري طبق 150 × 20 تنفيس معقم | Sarstedt، Inc. | 82.1184.500 | |
| نظام تنظيف البلازما | نظام هندسة الإنتاجية ، Inc. | YES-G500 | |
| بلورونيك F-127 | سيجما | P2443-250G | |
| بولي (إيثيلين جلايكول) 35 كيلو دالتون | سيجما | 94646-250G-F | |
| إبرة PrecisionGlide 27G | BD | مثبط الصخور 305109 | |
| Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| رقاقة سيليكون 100 مم | رقاقة جامعة | 452 | |
| زجاج منزلق (75 مم وحاد ؛ 25 مم) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X مرشح أنبوب الطرد المركزي (0.22 وميكرو ؛ م) | كوستار | 8160 | |
| SU-8 2025 | كاياكو المواد المتقدمة | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 مطور | كاياكو للمواد المتقدمة | Y020100 4000L1PE | |
| التصميم الجراحي Royaltek شفرات مشرط جراحية من الفولاذ المقاوم | فيشر علمي | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 مجموعة مطاط سيليكون (PDMS) | داو | كورنينج 2065622 | |
| مضخة حقنة | نظام مضخة عصر جديد ، Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02 "معرف × 0.06" OD) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04 "معرف × 0.07" OD) | كول بارمر | 06419-04 | |
| منظف بالموجات فوق الصوتية FS20D | فيشر العلمي | CPN-962-152R | |
| مجفف فراغ | بيل آرت | F42025-0000 | |
| مجهر ستيريو زايس ستيمي DV4 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| & كاتب ليزر PG 101 | هايدلبرغ إنسترومنتس | HI 1128 |
المراجع
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70(2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
