ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي هي أهداف محتملة لأدوية السرطان. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتقييم الجزيئات الصغيرة لتثبيط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يستخدم هذا الفحص نوكلياز داخلي لإقران مثيلة الحمض النووي بتوليد التألق ويسمح بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مثيلة الحمض النووي ، وهي شكل من أشكال تنظيم الجينات اللاجينية ، مهمة للوظيفة الخلوية الطبيعية. في الخلايا ، تنشئ البروتينات التي تسمى DNA methyltransferases (DNMTs) نمط مثيلة الحمض النووي وتحافظ عليه. ترتبط التغييرات في نمط مثيلة الحمض النووي الطبيعي بتطور السرطان وتطوره ، مما يجعل DNMTs أهدافا محتملة لأدوية السرطان. وبالتالي ، فإن تحديد وتوصيف مثبطات الجزيئات الصغيرة الجديدة لهذه الإنزيمات له أهمية كبيرة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يمكن استخدامه للكشف عن مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يسمح اختبار الحركية المقترنة المستمرة بتحديد السرعات الأولية لمثيلة الحمض النووي في وجود وغياب مثبطات الجزيئات الصغيرة المحتملة. يستخدم الفحص نوكلياز Gla I الحساس للميثيل لإقران مثيلة ركيزة الحمض النووي hemimethylated لتوليد مضان.
يسمح هذا الفحص المستمر بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي. إجراء الفحص بكميات صغيرة في ألواح المعايرة الدقيقة يقلل من تكلفة الكواشف. باستخدام هذا الفحص ، تم إجراء شاشة مثال صغير لمثبطات DNMT1 ، وهو إيزوزيم DNMT الأكثر وفرة في البشر. المنتج الطبيعي للأنثراكينون عالي الاستبدال ، حمض اللاكايك A ، هو مثبط قوي ومنافس للحمض النووي ل DNMT1. هنا ، نفحص ثلاثة مثبطات جزيئات صغيرة محتملة - أنثراكينون أو جزيئات شبيهة بالأنثراكينون مع واحد إلى ثلاثة بدائل - بتركيزين لوصف بروتوكول الفحص. تستخدم السرعات الأولية لحساب النسبة المئوية للنشاط الملاحظ في وجود كل جزيء. يظهر أحد المركبات الثلاثة التي تم فحصها تثبيطا يعتمد على التركيز لنشاط DNMT1 ، مما يشير إلى أنه مثبط محتمل ل DNMT1.
المقدمة
مثيلة الحمض النووي هي علامة جينية مهمة تنظم التعبير الجيني وبنية الكروماتين. يحدث المثيلة في الغالب في ثنائي النوكليوتيدات CpG - السيتوزين يليه جوانوزين. تضاف مجموعة الميثيل إلى موضع 5 من السيتوزين. هناك حاجة إلى أنماط مثيلة الحمض النووي الصحيحة ، وبالتالي التعبير الجيني المناسب ، من أجل التطور والوظيفة الخلوية المناسبة. ارتبطت العديد من حالات المرض بالتغيرات في نمط المثيلة الطبيعي1،2،3. على سبيل المثال ، هناك صلة بين بدء السرطان وتقدمه والتعديلات في نمط مثيلة الحمض النووي. عادة ، تظهر الخلايا السرطانية مستويات إجمالية أقل من ميثيل سيتوزين ، مما يساهم في عدم استقرار الجينوم. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد حلول الفحص للشاشة
ملاحظة: يمكن تكييف تركيزات الركائز المستخدمة في هذا الفحص. بالنسبة إلى DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS ، فإن قيم Km المحددة تجريبيا لركيزة الحمض النووي لدبوس الشعر و SAM هي 1-2 نانومتر و 2 ميكرومتر ، على التوالي26,40.
- قم بإعداد 600 ميكرولتر من كل حالة فحص يتم اختبارها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد.
ملاحظة: يعتمد الحجم الإجمالي لحل الفحص المطلوب على عدد النسخ المتماثلة التي يتم إجراؤها. تم تشغيل كل حالة فحص في ثلاث نسخ لهذا البروتوكول.- أضف ddH 2O و 5x methylation buffer (250 mM Tris pH 7.5 ، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
DNMT1 النشط هو شرط أساسي لهذا التحليل. تم التعبير عن DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في E.coli وتم تنقيته إلى التجانس باتباع الإجراءات المنشورة مسبقا41. للتأكد من أن الإنزيم المنقى كان نشطا ، تم استخدام مقايسة متقطعة مقترنة بالنوكلياز الداخلي لفحص نشاط مثيلة الحمض النووي36. يستخدم هذا الفحص الحمض النووي المزدوج المكون من 32 زوجا من القواعد مع CpG أحادي الميثيل موضوعة في موقع انقسام Sau3A1. Sau3A1 يمكن أن يشق الحمض النووي للركيزة hemimethylated ؛ ومع ذلك ، يتم حظر الانقسا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لتحديد وتوصيف مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي ، يجب قياس نشاط الإنزيم. توجد عدة طرق لفحص نشاط ميثيل ترانسفيراز DNA. عادة ما يتم رصد النشاط باستخدام النشاط الإشعاعي. يمكن قياس نقل مجموعة الميثيل الموسومة من SAM29،30،31،32،33،34. كما تم وصف المقايسات القائمة على الهلام التي تستخدم نوكلياز داخلية حساسة للميثيل
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون جامعة باكنيل وقسم الكيمياء على دعمهم لهذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96 بئر نصف منطقة البوليسترين الأسود المسطح القاع غير المعالج ميكروبليت | كورنينج | 3694 | |
| 96 بئر البوليسترين مخروطية القاع الألواح | ThermoFisher | 249570 | |
| ألبومين مصل البقر | NEB | B9000S | |
| مركب 1 | مركب فحص 5812086 ChemBridge | ؛ معلق في DMSO إلى مركب 10 ملي | |
| مولار 2 | مركب فحص 6722175 ChemBridge ؛ معلق في DMSO إلى مركب 10 ملي | ||
| مولار 3 | مركب فحص 5249376 ChemBridge ؛ معلق في DMSO إلى 10 ملي مولار | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | نوكلياز داخلي حساس للميثيل |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| كلوريد المغنيسيوم | Sigma | M0250 | |
| قليل النوكليوتيد (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | مخصص مركب | داخليا دبوس الشعر المروي (الركيزة) |
| غلوتامات البوتاسيوم | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | المشترك للتبرع بالميثيل (الركيزة) |
| Tris Base | RPI | تي 60040 |
المراجع
- Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
- Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
