هذا البروتوكول مخصص للتصور microtubule زائد نهاية بواسطة EB3 البروتين transfection لدراسة خصائصها الحيوية في ثقافة الخلايا الأولية. تم تنفيذ البروتوكول على الخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية التي تم الحصول عليها من مرضى مرض هنتنغتون.
مقالة منهجية
Microtubule زائد نهاية ديناميات التصور في نموذج مرض هنتنغتون على أساس الخلايا الليفية الجلد الأساسية البشرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Transfection مع بروتين علامة المسمى fluorescently من الفائدة في تركيبة مع المجهر الفيديو الفاصل الزمني هو وسيلة كلاسيكية لدراسة الخصائص الديناميكية للهيكل الخلوي. يقدم هذا البروتوكول تقنية لإصابة الإنسان بالخلايا الليفية الأولية ، والتي يمكن أن تكون صعبة بسبب تفاصيل ظروف زراعة الخلايا الأولية. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الهيكل الخلوي صيانة الممتلكات الحيوية مستوى منخفض من العدوى للحصول على نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء دون التسبب في استقرار microtubule. من المهم اتخاذ تدابير لحماية الخلايا من الإجهاد الناجم عن الضوء وتلاشي الصبغة الفلورية. في سياق عملنا، اختبرنا طرق وبروتوكولات مختلفة للإصابة وكذلك ناقلات مختلفة لاختيار أفضل مزيج من الشروط المناسبة لدراسات الورم الليفي الأولي للإنسان. قمنا بتحليل مقاطع الفيديو الناتجة عن الفاصل الزمني وديناميكيات microtubule المحسوبة باستخدام ImageJ. ديناميات microtubules 'زائد ينتهي في أجزاء الخلية المختلفة ليست متشابهة ، لذلك قسمنا التحليل إلى مجموعات فرعية -- المنطقة المركزية ، ولاميلا ، وذيل الخلايا الليفية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه للتحليل المختبري لديناميكيات الهيكل الخلوي في عينات المرضى ، مما يتيح الخطوة التالية نحو فهم ديناميكيات تطور المرض المختلفة.
المقدمة
مرض هنتنغتون (HD) هو مرض تنكسي عصبي غير قابل للشفاء ناجم عن بروتين ترميز الجينات الطفرة (HTT). ويرتبط HTT في المقام الأول مع الحويصلات والبيبوليتولات الصغيرة، وربما تشارك في عمليات النقل التي تعتمد على microtubule1،2. لدراسة تأثير HTT متحولة على ديناميات microtubule، استخدمنا في التصور المختبري للبروتين EB3، الذي ينظم الخصائص الديناميكية لل microtubules عن طريق ربط وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي. لتحميل الفلورسنت المسمى EB3 في الخلايا الليفية الجلد البشري، تم تطبيق التراتوفيكيد البلازميد. استخدمنا ثقافة الخلايا الليفية الأولية التي تم الحصول عليها من خزعة جلد المرضى عالية الدقة لهذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للمركز الاتحادي للبحوث والسريرية للطب الفيزيائي والكيميائي للوكالة البيولوجية الطبية الاتحادية بتاريخ 08 سبتمبر 2015.
ملاحظة: الشكل 1 يعطي نظرة عامة على البروتوكول.
1. الحصول على ثقافة أساسية من الخلايا الليفية الجلد البشري (الشكل 2)
- تسليم خزعة إلى المختبر في غضون ساعات قليلة في وسائط النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) المتوسطة تكملها مع 50 ميكروغرام / مل من البنسلين و 50 U / مل من العقدية.
ملاحظة: يجب إجراء خزعة الجلد تحت ظروف معقمة من قبل الطبيب بعد أن يوقع المريض على موافقة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توضح أفلام GFP-EB3 الناتجة التي تم إنتاجها باستخدام البروتوكول(الشكل 1)الخصائص الديناميكية للبيبات الدقيقة. وتشارك Microtubules في عمليات الخلايا المختلفة، وخصائصها الحيوية تؤثر على مختلف خصائص الحياة من ثقافة الخلية البشرية الأولية من المواد خزعة المرضى(الشكل 2).
تحدد المعلمات التالية عدم الاستقرار الديناميكي للميكروبات: معدلات النمو (البلمرة) والتقلص (إزالة البوليمر)؛ تواتر الكوارث (الانتقال من البلمرة إلى إزالة البلمرة)؛ تواتر عملي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن الحصول على نتائج أفضل جودة لتحليل ديناميكيات microtubules من صور مجهرية عالية الجودة. من المهم مراقبة جميع الشروط اللازمة لتصوير الخلايا الحية بفارق زمني وضبط معلمات التصوير بشكل صحيح. استخدام أطباق خاصة ثقافة الخلية مع أسفل الزجاج (أطباق confocal) مهم، لأن الزجاج لديه مؤشر الانكسار مختلفة من الضوء من البلاستيك. سمك الزجاج وتوحيده على كامل مساحتها مهم للغاية أيضا ، لأن هذه المعلمات حاسمة لتركيز العينة العادية. انتهاك هذه المعلمات يؤدي حتما إلى فشل نظام التركيز المثالي مما أدى إلى تركيز سيئة مما يجعل من المستحيل استخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم 075-15-2019-1669 (نقل الخلايا الليفية)، من قبل مؤسسة العلوم الروسية، منحة رقم 19-15-00425 (جميع الأعمال الأخرى على زراعة الخلايا الليفية في المختبر). وقد دعم جزئيا من قبل برنامج تطوير جامعة موسكو الحكومية لومونوسوف PNR5.13 (التصوير والتحليل). يعترف المؤلفون بدعم مركز نيكون للتميز في معهد أ. ن. بيلوزيرسكي للبيولوجيا الفيزيائية والكيميائية. نريد أن نقدم شكرنا الخاص لإيكاترينا تاران لمساعدتها في التمثيل الصوتي. كما يشكر المؤلفون بافل بيلكوف على مساعدته في تحرير الفيديو. تم إنشاء الأرقام في المخطوطة مع BioRender.com.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > أجهزة < / قوي > | |||
| كاميرا iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf الطرد المركزي 5804 R | Eppendorf | ||
| Corporate Fluorescence مجموعة HYQ FITC | نيكون | البديل: Leica ، Olympus ، Zeiss | |
| LUNA-II Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| حاضنة مجهر للتصوير مدى الحياة | Okolab | H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| وحدة تحكم الغاز CO2-O2-UNIT-BL | |||
| عدسة موضوعية CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | بديل نيكون | : Leica و Olympus و Zeiss | |
| مجهر ضوئي مضان واسع النطاق Eclipse Ti-E | نيكون | البديلLeica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (الصورة J الإصدار 2.1.0 / 1.53c) | برنامج | ||
| NIS عناصر | نيكون | البديل: Leica, Olympus, Zeiss | |
| كواشف إضافيةقوي> | |||
| زيت معدني (زيت أبيض فاتح) | MP | طبق ثقافة الخلية 151694 | |
| < قوي > < / قوي > | |||
| طبق ثقافة الخلية | SPL Lifesciences | 20035 | |
| طبق متحد البؤر (سمك الزجاج 170 وميكرو ؛ م) | SPL Lifesciences | 211350 | البديل: |
| أنبوب الطرد المركزي المخروطي | SPL Lifesciences | 50015 | |
| قوارير مبردة | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest 615001< | ||
| strong>Cultivation< / strong> | |||
| Lipofectamine 3000 كاشف التعداء | L3000001 | ثيرمو فيشر العلمي | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | PanEko |  135 | |
| DMEM (وسائط النسر المعدلة من Dulbecco) | PanEko | C420  | |
| DPBS (Dulbecco's محلول ملح الفوسفات) | PanEko | P060  | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Hyclone | K053 / SH30071.03 | |
| الجيلاتين (جلد البقر) | PanEko |  070 | |
| GlutaMAX | ثيرمو فيشر | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| البنسلين الستربتومايسين | PanEko | A063 | |
| Trypsin-EDTA (0.25٪) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| transfection< / strong> | |||
| الحمض النووي البلازميد مع هدية EB3-GFP | اللطيفة للدكتور آي كافيرينا [جامعة فاندربيلت ، ناشفيل] بإذن من الدكتورة أ. أخمانوفا [جامعة إيراسموس ، روتردام] | ستيبانوفا وآخرون ، 2003 DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
المراجع
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن