مقالة منهجية

Microtubule زائد نهاية ديناميات التصور في نموذج مرض هنتنغتون على أساس الخلايا الليفية الجلد الأساسية البشرية

2.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62963

⸱

يناير 8, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, 4Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول مخصص للتصور microtubule زائد نهاية بواسطة EB3 البروتين transfection لدراسة خصائصها الحيوية في ثقافة الخلايا الأولية. تم تنفيذ البروتوكول على الخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية التي تم الحصول عليها من مرضى مرض هنتنغتون.

الملخص

Transfection مع بروتين علامة المسمى fluorescently من الفائدة في تركيبة مع المجهر الفيديو الفاصل الزمني هو وسيلة كلاسيكية لدراسة الخصائص الديناميكية للهيكل الخلوي. يقدم هذا البروتوكول تقنية لإصابة الإنسان بالخلايا الليفية الأولية ، والتي يمكن أن تكون صعبة بسبب تفاصيل ظروف زراعة الخلايا الأولية. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الهيكل الخلوي صيانة الممتلكات الحيوية مستوى منخفض من العدوى للحصول على نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء دون التسبب في استقرار microtubule. من المهم اتخاذ تدابير لحماية الخلايا من الإجهاد الناجم عن الضوء وتلاشي الصبغة الفلورية. في سياق عملنا، اختبرنا طرق وبروتوكولات مختلفة للإصابة وكذلك ناقلات مختلفة لاختيار أفضل مزيج من الشروط المناسبة لدراسات الورم الليفي الأولي للإنسان. قمنا بتحليل مقاطع الفيديو الناتجة عن الفاصل الزمني وديناميكيات microtubule المحسوبة باستخدام ImageJ. ديناميات microtubules 'زائد ينتهي في أجزاء الخلية المختلفة ليست متشابهة ، لذلك قسمنا التحليل إلى مجموعات فرعية -- المنطقة المركزية ، ولاميلا ، وذيل الخلايا الليفية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه للتحليل المختبري لديناميكيات الهيكل الخلوي في عينات المرضى ، مما يتيح الخطوة التالية نحو فهم ديناميكيات تطور المرض المختلفة.

المقدمة

مرض هنتنغتون (HD) هو مرض تنكسي عصبي غير قابل للشفاء ناجم عن بروتين ترميز الجينات الطفرة (HTT). ويرتبط HTT في المقام الأول مع الحويصلات والبيبوليتولات الصغيرة، وربما تشارك في عمليات النقل التي تعتمد على microtubule1،2. لدراسة تأثير HTT متحولة على ديناميات microtubule، استخدمنا في التصور المختبري للبروتين EB3، الذي ينظم الخصائص الديناميكية لل microtubules عن طريق ربط وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي. لتحميل الفلورسنت المسمى EB3 في الخلايا الليفية الجلد البشري، تم تطبيق التراتوفيكيد البلازميد. استخدمنا ثقافة الخلايا الليفية الأولية التي تم الحصول عليها من خزعة جلد المرضى عالية الدقة لهذه الدراسة.

الطفرة في الجين البروتين HTT يؤدي إلى استطالة من البوليglutamine المسالك3. HTT له دور في عمليات خلوية مثل الغدد الصماء4، نقل الخلية1،2، تدهور البروتين5، إلخ. جزء كبير من هذه العمليات ينطوي على عناصر مختلفة من الهيكل الخلوي الخلية، بما في ذلك microtubules.

الخلايا الأولية البشرية هي أفضل نموذج لإعادة إنتاج الأحداث التي تحدث في خلايا المريض عن كثب قدر الإمكان. لإنشاء مثل هذه النماذج ، يحتاج المرء إلى عزل الخلايا عن مواد الخزعة البشرية (على سبيل المثال ، من العينات الجراحية). خط الخلية الأولية الناتجة مناسبة لدراسة الإمراض باستخدام مختلف الأساليب الوراثية والكيميائية الحيوية والجزيئية وبيولوجيا الخلايا. أيضا، ثقافات الخلايا الأولية البشرية بمثابة مقدمة لخلق مختلف الثقافات المتحولة وراثيا ومحورةوراثيا 6.

ومع ذلك ، على النقيض من ثقافات الخلايا الخالدة ، فإن العيب الكبير للخلايا الأولية هو قدرتها المحدودة على المرور. لذلك، نوصي باستخدام الخلايا في مرحلة الممرات المبكرة (حتى 15). الثقافات القديمة تتدهور بسرعة كبيرة، وتفقد خصائصها الفريدة. وبالتالي، ينبغي الاحتفاظ الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها حديثا المجمدة للتخزين على المدى الطويل.

ثقافات الخلايا الأولية عرضة لظروف الزراعة. ولذلك، فإنها غالبا ما تتطلب نهجا فريدة من نوعها والاستفادة المثلى من ظروف النمو. على وجه الخصوص ، فإن الخلايا الليفية الأولية للبشرة البشرية المستخدمة في تجاربنا تتطلب على الركيزة. ومن ثم، استخدمنا مختلف الطلاء إضافية (على سبيل المثال، الجيلاتين أو فيبروكتين) اعتمادا على نوع التجربة.

يحدد الهيكل الخلوي الخلوي شكل الخلية وحركتها وحركتها. ديناميات الهيكل الخلوي حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات داخل الخلايا على حد سواء في مرحلة ما بين المراحل والميتوسيس. على وجه الخصوص، والهيكل الخلوي بوليمر من توبولين، هي هياكل ديناميكية للغاية والقطبية، وتمكين النقل الحركي بوساطة البروتين الموجهة داخل الخلايا. نهايات microtubules هي في إعادة ترتيب مستمر، مراحل التجميع الخاصة بهم بالتناوب مع مراحل التفكيك، وهذا السلوك يسمى "عدم الاستقرار الديناميكي"7،8،9. تحول البروتينات المختلفة المرتبطة بها توازن تفاعل البلمرة ، مما يؤدي إما إلى تكوين البوليمر أو تكوين مونومر البروتين. إضافة وحدات توبولين الفرعية يحدث أساسا في نهاية زائد من microtubules10. تتكون عائلة البروتينات الملزمة النهائية (EB) من ثلاثة أعضاء: EB1 و EB2 و EB3. أنها بمثابة زائد نهاية تتبع البروتينات (+TIPs) وتنظيم الخصائص الديناميكية لل microtubules عن طريق ربط وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي11.

تستخدم العديد من الدراسات الفلورسنت المسمى جزيء أنبوبولين microinjection أو العدوى مع التصوير الفاصل الزمني وتحليل الفيديو لتصور microtubules في المختبر. قد تكون هذه الطرق الغازية والضارة للخلايا، وخاصة الخلايا البشرية الأولية. الخطوة الأكثر تحديا هي إيجاد ظروف لإصابة الخلايا. حاولنا الوصول إلى أعلى مستوى ممكن من العدوى دون التأثير على الجدوى ومورفولوجيا الخلايا الأصلية. تطبق هذه الدراسة الطريقة الكلاسيكية لدراسة الاختلافات في ديناميات microtubule في الخلايا الليفية الجلدية من المتبرعين الأصحاء والمرضى الذين يعانون من مرض هنتنغتون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للمركز الاتحادي للبحوث والسريرية للطب الفيزيائي والكيميائي للوكالة البيولوجية الطبية الاتحادية بتاريخ 08 سبتمبر 2015.

ملاحظة: الشكل 1 يعطي نظرة عامة على البروتوكول.

1. الحصول على ثقافة أساسية من الخلايا الليفية الجلد البشري (الشكل 2)

  1. تسليم خزعة إلى المختبر في غضون ساعات قليلة في وسائط النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) المتوسطة تكملها مع 50 ميكروغرام / مل من البنسلين و 50 U / مل من العقدية.
    ملاحظة: يجب إجراء خزعة الجلد تحت ظروف معقمة من قبل الطبيب بعد أن يوقع المريض على موافقة مستنيرة.
  2. ضع نسيج الخزعة في طبق بيتري 6 سم مع كمية صغيرة من الوسط.
  3. باستخدام مشرط معقم، قطع عينة الخزعة إلى قطع من حوالي 0.5-1 ملم في الحجم. مكان 1-2 شظايا حصلت في طبق بيتري 3.5 سم ووضع غطاء معقم على قطع خزعة. أضف ببطء 1.5 مل من متوسط النمو إلى التركيب التالي: DMEM ، 50 U / mL البنسلين - العقدية ، و 10 ٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
  4. الخلايا الليفية الثقافية في وسط النمو داخل حاضنة CO2 حافظت على 5٪ CO2، 37 ° C ، 80٪ رطوبة.
    ملاحظة: بعد 4-7 أيام، تبدأ الخلايا القرنية الأولى، ثم الخلايا الليفية، في الهجرة من الأنسجة إلى أسفل الطبق.

2. تخزين، تجميد، وإلغاء تجميد الثقافة الأولية

  1. إزالة الخلايا من طبق الثقافة (انظر النقاط 3.2-3.4).
  2. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x g. ثم تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 900 ميكرولتر من FBS المبردة.
  3. نقل إلى أنبوب التبريد قطرة قطرة وإضافة 100 ميكرولتر من كبريتيد ثنائي ميثيل (DMSO).
  4. ضع المبرد في ثلاجة منخفضة الحرارة عند -80 درجة مئوية. وبعد 24 ساعة، قم بنقل النيتروجين المبرد إلى النيتروجين السائل (−196 درجة مئوية) للتخزين على المدى الطويل.
  5. لإذابة الجليد في الخلايا المبردة، قم بإزالة التبريد من تخزين النيتروجين، وفي غضون دقيقة واحدة، قم بنقل 1 مل من المحتوى إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من وسيط النقل المحمى مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  6. إعادة إنفاق بعناية ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة 5 دقائق في 200 × ز. تجاهل supernatant، resuspend بيليه الخلية في الحجم المطلوب من المتوسط النمو ووضعها على طبق بيتري من القطر المطلوب.

3. زراعة الخلايا

  1. تغطية أسفل الطبق مع محلول الجيلاتين 0.1٪ المعبأة في الماء المقطر. حضانة لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة لتصور العدوى، يجب استخدام أطباق الأطباق ذات القاع الزجاجي (أطباق الكونفوجال ذات سمك الزجاج 170 ميكرومتر).
  2. إعداد وسيط ثقافة لها التكوين التالي: تكمل DMEM مع 10٪ FBS، 2 MM L-ألانيل-L-الجلوتامين، 50 U/mL البنسلين-streptomycin. تخلط جيدا وتخزينها في 4 °C. قم بتدفئة الوسط إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى الخلايا.
  3. تقييم الثقافة تحت المجهر. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا الليفية مع محلول ملح الفوسفات دولبيكو (DPBS).
  4. إضافة 1 مل من محلول التريبسين 0.25٪ قبل الدفء إلى الخلايا. تحقق من الخلايا تحت المجهر إذا كانت تنفصل عن الركيزة تماما. إلغاء تنشيط التريبسين مع 1 مل من وسيط الثقافة.
  5. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الأنبوب في 200 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant، وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسط الثقافة.
  6. عد عدد الخلايا. حساب العدد المطلوب من الخلايا لزرع لهم مع كثافة 8-15 × 103/ سم2 وإعادة الإنفاق في 2 مل من المتوسط الثقافة.
  7. إزالة محلول الجيلاتين من طبق الثقافة وإضافة 2 مل فورا من تعليق الخلية. زراعة الخلايا الليفية عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون.
  8. تحديث المتوسطة كل 2-4 أيام.
    ملاحظة: للتجارب، استخدم خلايا المقاطع 4-11.

4. العدوى

  1. استبدال الوسط الثقافي مع ثقافة جديدة متوسطة 24 ساعة قبل transfection.
    ملاحظة: يجب أن يكون التقاء الخلية 70-80٪.
  2. إعداد مجمع الحمض النووي الدهون على أساس مساحة وكثافة بذر الخلية. استخدام عامل العدوى القائم على الدهون.
    ملاحظة: استخدام كثافة البذر الخلية كما 1 × 104 خلايا / سم2.
  3. إضافة 3 ميكرولتر من كاشف العدوى التجارية إلى 125 ميكرولتر من الحد الأدنى الأمثل المتوسطة الأساسية (Opti-MEM) لا تحتوي على أي مضادات حيوية، دون لمس جدران الأنبوب. إعادة الإنفاق بلطف.
  4. تمييع الحمض النووي البلازميد (GFP-EB3) عن طريق إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 125 ميكرولتر من Opti-MEM. إعادة الإنفاق بلطف.
    ملاحظة: تم تلقي التعبير المتجه ترميز GFP-EB311 كهدية نوع من الدكتور I. كافرينا (جامعة فاندربيلت، ناشفيل) بإذن من الدكتور أ. أخمانوفا (جامعة إيراسموس، روتردام)11.
  5. إضافة الحمض النووي البلازميد المخفف إلى كل أنبوب من كاشف العدوى المخفف (1:1). حضانة لمدة 30 دقيقة.
  6. أضف مجمع الحمض النووي الدهني إلى طبق بيتري الذي يبلغ 6 سم ويحتوي على خلايا واخلطه مع أرجوحة صليبية لمدة 30 s. احتضان الخلايا مع عامل العدوى لمدة 24 ساعة ومن ثم تغيير إلى وسط جديد. تحليل كفاءة العدوى بعد 24 ساعة و 48 ساعة.
    ملاحظة: 24 ساعة بعد العدوى، كانت الكفاءة 10-15٪، وبعد 48 ساعة تصل إلى 40٪.

5. التحضير للتصوير

  1. قبل التصوير الحي للخلايا، قم بتغيير متوسط الثقافة إلى وسط بدون صبغة مؤشر درجة الحموضة لتقليل الفلورة الذاتية.
  2. تطبيق الزيوت المعدنية بعناية على السطح المتوسط لتغطية تماما المتوسطة، وعزلها عن البيئة الخارجية للحد من اختراق O2 والتبخر المتوسط.
  3. استخدم مصباح الزئبق والغمر الزيت 60x أو 100x عدسة الهدف مع فتحة أرقام عالية لالتقاط الصور.
    ملاحظة: بالنسبة للملاحظات في الجسم الحي، يجب أن يكون المجهر مجهزا وحاضنة للحفاظ على الظروف اللازمة للخلايا، بما في ذلك تسخين طاولة الجسم والعدسة إلى +37 درجة مئوية، وغرفة مغلقة مزودةبإمدادات ثاني أكسيد الكربون، ودعم مستوى الرطوبة. استخدام المياه المقطرة مزدوجة لخلق الرطوبة. تحقق من مستوى الماء المقطر المزدوج قبل التصوير.
  4. ضع طبق الكونفوجكال مع الخلايا في حامل المجهر قبل التصوير. تأكد من أن الطبق والكاميرا متصلان بشكل آمن بحامل الحامل لتجنب الانجراف أثناء التقاط الصور.

6. وضع المعلمات التصوير

  1. اختر قيم التعرض المنخفضة لأن الضوء يحفز أنواع الأكسجين التفاعلية الضارة بالخلايا (ROS).
    ملاحظة: لدراسة ديناميات microtubules في الخلايا الليفية الجلد البشري، تم اختيار التعرض 300 مللي ثانية.
  2. التركيز على الهدف من الاهتمام.
    ملاحظة: بالنسبة للتصوير الفاصل الزمني على المدى الطويل، استخدم نظام تثبيت التركيز التلقائي للتعويض عن التحول المحتمل على طول المحور z.
  3. اختر ظروف التصوير الأمثل اعتمادا على الحساسية الضوئية للخلايا ومعدل تلاشي الفلوروشروم.
    ملاحظة: بما أن الهياكل الدقيقة هي هياكل ديناميكية للغاية، يمكن اختيار فاصل زمني قصير إلى حد معقول، ويجب أن يكون معدل الإطار مرتفعا بما فيه الكفاية. للتحقيق في ديناميات microtubule في الخلايا الليفية الجلد، استخدمنا على تردد 1 إطار / ثانية لمدة 3-5 دقائق.
  4. عند تحديد الكائن التالي للحصول على الصورة، ابتعد عن المنطقة المصورة بالفعل. وبما أن هذه المنطقة كانت تحت تأثير الضوء، سيكون هناك تبييض ملحوظ للصور.
    ملاحظة: نظرا لاستخدام تردد تصوير عالي نسبيا، لم يغلق الغالق بين الصور، وأضاء المصباح طوال فترة التصوير، ولهذا السبب ازداد التلاشي.
  5. اختر الفيديو الأمثل لدراسة ديناميات microtubules بصريا ، مع الأخذ في الاعتبار جودة العدوى ، ونوعية صور microtubules (نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى) ، وعدم الانجراف في حالة الخلية المحللة(الشكل 3).
  6. استخدم مقاطع الفيديو المختارة لدراسة ديناميكيات microtubules الإضافية من خلال تتبعها في برنامج ImageJ أو فيجي(الشكل 4).
    ملاحظة: للحصول على إرشادات التحليل الكمي انظر الشكل التكميلي 2 والملف التكميلي 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

توضح أفلام GFP-EB3 الناتجة التي تم إنتاجها باستخدام البروتوكول(الشكل 1)الخصائص الديناميكية للبيبات الدقيقة. وتشارك Microtubules في عمليات الخلايا المختلفة، وخصائصها الحيوية تؤثر على مختلف خصائص الحياة من ثقافة الخلية البشرية الأولية من المواد خزعة المرضى(الشكل 2).

تحدد المعلمات التالية عدم الاستقرار الديناميكي للميكروبات: معدلات النمو (البلمرة) والتقلص (إزالة البوليمر)؛ تواتر الكوارث (الانتقال من البلمرة إلى إزالة البلمرة)؛ تواتر عملي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن الحصول على نتائج أفضل جودة لتحليل ديناميكيات microtubules من صور مجهرية عالية الجودة. من المهم مراقبة جميع الشروط اللازمة لتصوير الخلايا الحية بفارق زمني وضبط معلمات التصوير بشكل صحيح. استخدام أطباق خاصة ثقافة الخلية مع أسفل الزجاج (أطباق confocal) مهم، لأن الزجاج لديه مؤشر الانكسار مختلفة من الضوء من البلاستيك. سمك الزجاج وتوحيده على كامل مساحتها مهم للغاية أيضا ، لأن هذه المعلمات حاسمة لتركيز العينة العادية. انتهاك هذه المعلمات يؤدي حتما إلى فشل نظام التركيز المثالي مما أدى إلى تركيز سيئة مما يجعل من المستحيل استخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم 075-15-2019-1669 (نقل الخلايا الليفية)، من قبل مؤسسة العلوم الروسية، منحة رقم 19-15-00425 (جميع الأعمال الأخرى على زراعة الخلايا الليفية في المختبر). وقد دعم جزئيا من قبل برنامج تطوير جامعة موسكو الحكومية لومونوسوف PNR5.13 (التصوير والتحليل). يعترف المؤلفون بدعم مركز نيكون للتميز في معهد أ. ن. بيلوزيرسكي للبيولوجيا الفيزيائية والكيميائية. نريد أن نقدم شكرنا الخاص لإيكاترينا تاران لمساعدتها في التمثيل الصوتي. كما يشكر المؤلفون بافل بيلكوف على مساعدته في تحرير الفيديو. تم إنشاء الأرقام في المخطوطة مع BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > أجهزة < / قوي >
كاميرا iXon DU897 EMCCDAndor Technology
Eppendorf الطرد المركزي 5804 REppendorf
Corporate Fluorescence مجموعة HYQ FITCنيكونالبديل: Leica ، Olympus ، Zeiss
LUNA-II Cell CounteLogos BiosystemsL40002
حاضنة مجهر للتصوير مدى الحياةOkolabH301-T-UNIT-BL-PLUS
وحدة تحكم الغاز CO2-O2-UNIT-BL
عدسة موضوعية CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)بديل نيكون: Leica و Olympus و Zeiss
مجهر ضوئي مضان واسع النطاق Eclipse Ti-EنيكونالبديلLeica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (الصورة J الإصدار 2.1.0 / 1.53c)برنامج
NIS عناصرنيكونالبديل: Leica, Olympus, Zeiss
كواشف إضافيةقوي>
زيت معدني (زيت أبيض فاتح)MPطبق ثقافة الخلية 151694
< قوي > < / قوي >
طبق ثقافة الخليةSPL Lifesciences20035
طبق متحد البؤر (سمك الزجاج 170 وميكرو ؛ م)SPL Lifesciences211350البديل:
أنبوب الطرد المركزي المخروطيSPL Lifesciences50015
قوارير مبردةCorning-Costar430659
Microcentrifuge TubeNest 615001<
strong>Cultivation< / strong>
Lipofectamine 3000 كاشف التعداءL3000001ثيرمو فيشر العلمي
ثنائي ميثيل سلفوكسيدPanEkofigure-materials-1135
DMEM (وسائط النسر المعدلة من Dulbecco)PanEkoC420 figure-materials-2
DPBS (Dulbecco's محلول ملح الفوسفات)PanEkoP060 figure-materials-3
مصل الأبقار الجنينية (FBS)HycloneK053 / SH30071.03
الجيلاتين (جلد البقر)PanEkofigure-materials-4070
GlutaMAXثيرمو فيشر 35050038
Opti-MEM (1x) + GlutamaxGibco519850026
البنسلين الستربتومايسينPanEkoA063figure-materials-5
Trypsin-EDTA (0.25٪)Thermo Fisher Scientific25200072
transfection< / strong>
الحمض النووي البلازميد مع هدية EB3-GFPاللطيفة للدكتور آي كافيرينا [جامعة فاندربيلت ، ناشفيل] بإذن من الدكتورة أ. أخمانوفا
[جامعة إيراسموس ، روتردام]		ستيبانوفا وآخرون ، 2003 DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.23-07-02655.2003
مجموعة مرشحات وحدة التحكم في درجة الحرارة معالجة الصور مفتوح المصدر MatTek العلمي

المراجع

  1. Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
  2. Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
  3. MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
  4. Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
  5. Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
  6. Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  9. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
  10. Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
  11. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  12. Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
  13. O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
  14. Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
  15. Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
  16. Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
  17. van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  19. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
  20. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884(2016).
  21. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
  22. Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EB3 ImageJ

مقالات ذات صلة