Method Article

إعداد العينة والكمية النسبية باستخدام الميثيل الاختزالي للأمينات لدراسات علم البيبتي

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة طريقة إعداد عينة تستند إلى تعطيل الحرارة للحفاظ على الببتيدات الذاتية تجنب تدهور بعد الوفاة، تليها الكمية النسبية باستخدام وضع العلامات النظيرية بالإضافة إلى LC-MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تعريف Peptidomics على أنه التحليل النوعي والكمي للببتيدات في عينة بيولوجية. وتشمل تطبيقاتها الرئيسية تحديد المؤشرات الحيوية الببتيد للمرض أو الإجهاد البيئي، وتحديد الببتيدات العصبية والهرمونات والببتيدات النشطة بيولوجيا داخل الخلايا، واكتشاف الببتيدات المضادة للميكروبات والنوترية من التحللات المائية البروتينية، ويمكن استخدامها في الدراسات لفهم العمليات البروتيوليكية. وقد ساهم التقدم الأخير في إعداد العينات وطرق الفصل وتقنيات قياس الطيف الكتلي والأدوات الحسابية المتعلقة بتسلسل البروتين في زيادة عدد الببتيدات المحددة والببتيدات المميزة. دراسات الببتيدات في كثير من الأحيان تحليل الببتيدات التي يتم إنشاؤها بشكل طبيعي في الخلايا. هنا ، يتم وصف بروتوكول إعداد العينة على أساس تعطيل الحرارة ، مما يلغي نشاط البروتيز ، والاستخراج مع ظروف خفيفة ، لذلك لا يوجد انشقاق في روابط الببتيد. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر أيضا الكمية النسبية للببتيدات باستخدام وسم النظائر المستقرة عن طريق الميثيل الاختزالي للأمينات. هذه الطريقة وضع العلامات لديها بعض المزايا والكواشف المتاحة تجاريا، وغير مكلفة بالمقارنة مع غيرها، مستقرة كيميائيا، ويسمح بتحليل ما يصل إلى خمس عينات في تشغيل LC-MS واحد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز علوم "Omics" بالتحليل العميق لمجموعة الجزيئات ، مثل الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، البروتينات ، الببتيدات ، المستقلبات ، إلخ. وقد أحدثت هذه مجموعات البيانات على نطاق واسع (علم الجينوم، وعلم النسخ، والبروتيوميات، وعلم البيبتيدم، وعلم الأيض، وما إلى ذلك) ثورة في علم الأحياء وأدت إلى فهم متقدم للعمليات البيولوجية1. بدأ مصطلح peptidomics في أوائل القرن العشرين ، وقد أشار إليه بعض المؤلفين على أنه فرع من proteomics2. ومع ذلك ، فإن peptidomics له خصائص متميزة ، حيث يكون الاهتمام الرئيسي هو التحقيق في محتوى الببتيدات المتولد بشكل طبيعي أثناء العمليات الخلوية ، وكذلك توصيف النشاط البيولوجي لهذه

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تكييف الإجراء التالي لاستخراج الببتيد والميثيل الاختزالي من الإجراءات المنشورة سابقا24,25,26,27. وقد اتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للمجلس الوطني لمراقبة التجارب على الحيوانات ووافقت عليه لجنة الأخلاقيات لاستخدام الحيوانات في معهد العلوم البيولوجية بجامعة ولاية ساو باولو. يتم عرض خطوات البروتوكول في الشكل 1.

ملاحظة: إعداد كافة الحلول المائية في المياه فائقة النحافة.

1. استخراج الببتيد

  1. ثقافة الخلية
    1. زراعة خلايا SHS....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تخزين النتائج التي تم الحصول عليها من أشواط أجريت على مطياف الكتلة في ملفات البيانات الخام التي يمكن فتحها في برنامج مطياف الكتلة. في أطياف MS ، من الممكن مراقبة مجموعات الذروة التي تمثل الببتيدات المسماة وفقا لنظام وضع العلامات المستخدم ، بدءا من 2-5 تسميات. على سبيل المثال، في الشكل 2، يتم تمثيل أزواج القمم التي تم اكتشافها في وقت كروماتوغرافي في تجربة حيث تم استخدام ملصقين نظائريين فقط في عينتين مختلفتين في نفس الشوط. ويبين الشكل 3 احتمالات أخرى لنتائج إي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في معظم الدراسات peptidomics، واحدة من الخطوات الحاسمة هي، دون شك، وإعداد العينة التي ينبغي أن يؤديها بعناية لتجنب وجود شظايا الببتيد التي ولدتها proteases بعد بضع دقائق بعد الوفاة. وأظهرت الدراسات الأولية على مقتطفات الدماغ التي أعدت من عينات غير الميكروويف وجود عدد كبير من شظايا البروتين في ميكروفيترات 10-kDa. وقد وصفت نهج مختلفة لتجنب أطياف الببتيد من تدهور البروتين: تركيز الميكروويف تشعيع الحيوان sacrifice6,8, تشريح cryostat تليها عازلة استخراج

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا توجد مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم تطوير واستخدام التقنيات الموصوفة هنا من خلال منحة المجلس الوطني البرازيلي للبحوث 420811/2018-4 (LMC)؛ منح فونداساو دي أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC) و2019/17433-3 (LOF) و21/01286-1 (MEME). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار نشرها أو إعدادها.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مرشحات قطع 10 كيلو دالتونميرك ميليبورUFC801024Amicon Ultra-4 ، غشاء PLGC Ultracel-PL ، 10 كيلو دالتون
أسيتونسيجما-ألدريتش179124
أسيتونيتريلسيجما ألدريتش1000291000
بيكربونات الأمونيومسيجما ألدريتش11213
عمود تحليلي (عمود سهل) عمودسهل(SC200)  10 سم ، ID75 وميكرو ؛ م ، 3 وميكرو ؛ م ، C18-A2
إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفوناتسيجما ألدريتشE10521MS-222
فلوريسكامينسيجما ألدريتشF9015
محلول الفورمالديهايدسيجما ألدريتش252549
الفورمالديهايد <سوب>13< / سوب>ج ، د2< / sub> ، محلولسيجما ألدريتش596388
الفورمالديهايد-د2 الحلسيجما ألدريتش492620
حمض الفورميكسيجما ألدريتش33015
غطاء الدخانكيميسQ216
حمض الهيدروكلوريك - حمض الهيدروكلوريك سيجماألدريتش258148
LoBind أنابيب الاحتفاظ بالبروتينEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velosثيرمو فيشر العلميLTQ Velos
فرن الميكروويفباناسونيكNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.الإصدار 8.5
ملحي مخزن بالفوسفاتInvitrogen3002أقراص
العمود المسبق (EASY-Column) ThermoFisher Scientific(SC001)2 سم ، ID100 & micro ؛ م ، 5 وميكرو ؛ م ، C18-A1
أجهزة الطرد المركزي المبردةHermleZ326Kللأنابيب المخروطية
أجهزة الطرد المركزي المبردةVS15000CFNIIالرؤيةللأنابيب الدقيقة
أعمدة التنظيف العكسية الطور   ؛   (خرطوشة Oasis HLB 1 cc)ووترز186000383الواحة HLB 1 سم مكعب خرطوشة
الصوديوم سيانوبوروديوتيريد - NaBD3< / sub>CNسيجما ألدريتش190020
سيانوبوروهيدريد الصوديوم - NaBH3< / sub>CNسيجما ألدريتش156159
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS9763ملاحظة: 0.2 م PB = 0.1 م الرقم الهيدروجيني العازل للفوسفات 6.8 (26.85 مل من Na2< / sub>HPO3< / sub> 1M) بالإضافة إلى 0.1 M عازلة الفوسفات درجة الحموضة 6.8 (23.15 مل من NaH2PO3 1M) إلى 250 مل من الماء
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
البروتيماكسالببتيد القياسي: LTLRTKL
ثلاثي إيثيل الأمونيوم عازلة - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك - TFASigma-AldrichT6508
مياه فائقة النقاءMilli-QDirect-Q 3UV
جهاز طرد مركزي فراغيGeneVacMiVac DNA مكثف
حمام مائيCientec266
Xcalibur برنامجThermoFisher ScientificOPTON-30965
محلول تسلسل الأحماض الأمينية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptidomics StudiesReductive MethylationIsotopic LabelingPeptide QuantitationSample PreparationMass SpectrometryPeptide ExtractionHeat InactivationNeuroblastoma CellsPeptide Biomarkers

Related Articles