يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي

2.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62974

⸱

سبتمبر 8, 2021

 ,  , 
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف استخدام طريقة التصوير أحادية الجزيء ، ستائر الحمض النووي ، لدراسة الآلية الفيزيائية الحيوية لمكثفات EWS-FLI1 المتجمعة على الحمض النووي.

الملخص

تم العثور على جينات الاندماج الناتجة عن نقل الكروموسومات في العديد من الأورام الصلبة أو سرطان الدم. EWS-FLI1 ، الذي ينتمي إلى عائلة FUS / EWS / TAF15 (FET) من البروتينات السرطانية الاندماجية ، هو أحد جينات الاندماج الأكثر مشاركة في ساركوما إيوينغ. عادة ما تحتوي بروتينات اندماج عائلة FET هذه على مجال منخفض التعقيد (LCD) من بروتين FET في نهايتها N ومجال ربط الحمض النووي (DBD) في نهايتها C. تم التأكيد على أن EWS-FLI1 يشكل مكثفات جزيئية حيوية في مواضع الربط المستهدفة بسبب تفاعلات LCD-LCD و LCD-DBD ، ويمكن لهذه المكثفات تجنيد بوليميراز RNA II لتعزيز النسخ الجيني. ومع ذلك ، فإن كيفية تجميع هذه المكثفات في مواقع الربط الخاصة بها لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق طريقة الفيزياء الحيوية أحادية الجزيء - ستائر الحمض النووي - لتصور عمليات التجميع هذه لمكثفات EWS-FLI1. هنا ، تتم مناقشة البروتوكول التجريبي التفصيلي ونهج تحليل البيانات لتطبيق ستائر الحمض النووي في دراسة المكثفات الجزيئية الحيوية التي تتجمع على الحمض النووي المستهدف.

المقدمة

يعد تنظيم النسخ خطوة حاسمة للتعبير الجيني الدقيق في الخلايا الحية. تشارك العديد من العوامل ، مثل تعديل الكروموسومات وعوامل النسخ (TFs) والحمض النووي الريبي غير المشفر ، في هذه العملية المعقدة1،2،3. من بين هذه العوامل ، تساهم TFs في خصوصية تنظيم النسخ من خلال التعرف على تسلسلات الحمض النووي المحددة المعروفة باسم المروجين أو المعززات وربطها ، وبالتالي تجنيد بروتينات وظيفية أخرى لتنشيط أو قمع النسخ4،5،6،7. كيف تمكنت فرق العمل هذه من البحث عن مواقعها المستهدفة في الجينوم البشري والتفاعل مع الحمض النووي المغلف بالهستونات والبروتينات غير المرتبطة بالحمض النووي قد حيرت العلماء لعقود. في السنوات القليلة الماضية ، تم بناء العديد من النماذج الكلاسيكية لآلية البحث المستهدفة ل TFs لوصف كيفية "الانزلاق" أو "القفز" أو "القفز" أو "النقل بين القطاعات" على طول سلسلة الحمض النووي8،9،10،11. تركز هذه النماذج على سلوك البحث عن الحمض النووي لجزيء TF واحد. ومع ذلك ، تظهر الدراسات الحديثة أن بعض TFs تخضع لفصل الطور السائل والسائل (LLPS) إما بمفردها في النواة أو مع مجمع الوسيط12. ترتبط القطرات المرصودة ل TFs بمناطق المروج أو المحسن ، مما يسلط الضوء على دور تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية في النسخ والجينوم ثلاثي الأبعاد13،14،15. ترتبط هذه المكثفات الجزيئية الحيوية بمقصورات تفتقر إلى الغشاء في الجسم الحي وفي المختبر. يتم تشكيلها عبر LLPS ، حيث تكون الجزيئات الحيوية المعيارية والمناطق المضطربة جوهريا (IDRs) للبروتينات قوتين دافعتين رئيسيتين للتفاعلات متعددة التكافؤ16. وبالتالي ، لا تبحث TFs عن الحمض النووي فحسب ، بل تعمل أيضا بشكل تآزري داخل هذه المكثفات4،17،18. حتى الآن ، لا تزال الخاصية الفيزيائية الحيوية لمكثفات النسخ هذه على الحمض النووي غير واضحة.

لذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تطبيق طريقة أحادية الجزيء - ستائر الحمض النووي - لتصوير تكوين وديناميكيات مكثفات النسخ التي شكلتها TFs على الحمض النووي في المختبر مباشرة. تم تطبيق ستائر الحمض النووي ، وهي منصة تصوير عالية الإنتاجية في المختبر لدراسة التفاعل بين البروتينات والحمض النووي ، في إصلاح الحمض النووي19،20،21 ، والبحث المستهدف 22 ، و LLPS17،23،24. يتم طلاء خلية التدفق من ستائر الحمض النووي بطبقات ثنائية دهنية بيوتينيل لتخميل السطح والسماح للجزيئات الحيوية بالانتشار على السطح. تحد الأنماط المتعرجة النانوية من حركة الحمض النووي. يمكن محاذاة ركائز الحمض النووي Lambda Biotinylated على طول حواف الحاجز وتمتد بواسطة التدفق العازل الموجه. تسمح نفس تسلسلات البداية والنهاية لجميع الجزيئات بتتبع البروتين على الحمض النووي ووصف توزيع موضع أحداث الربط25,26. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين ستائر الحمض النووي والفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) يساعد على تقليل ضوضاء الخلفية واكتشاف الإشارات على مستوى جزيء واحد. وبالتالي ، يمكن أن تكون ستائر الحمض النووي طريقة واعدة للتحقيق في ديناميكيات تكوين مكثفات النسخ على أشكال الحمض النووي. تصف هذه الورقة مثال على بروتين ورمي اندماجي لعائلة FUS / EWS / TAF15 (FET) ، EWS-FLI1 ، الناتج عن إزفاء الكروموسومات. تم استخدام Lambda DNA الذي يحتوي على 25× GGAA - تسلسل الربط ل EWS-FLI127 - كركيزة للحمض النووي في تجارب ستائر الحمض النووي لمراقبة كيفية خضوع جزيئات EWS-FLI1 ل LLPS على الحمض النووي. تناقش هذه المخطوطة البروتوكول التجريبي وطرق تحليل البيانات بالتفصيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير المزيج الرئيسي ثنائي الطبقة الدهنية

  1. اشطف القوارير الزجاجية بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) والإيثانول بنسبة 99٪ وجففها في فرن تجفيف 60 درجة مئوية.
  2. اصنع مزيج الدهون الرئيسي عن طريق إذابة 1 جم من 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ، 100 مجم من الدهون المتفاعلة مع البولي إيثيلين جلايكول (PEGylated) (18: 1 من 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [ميثوكسي (البولي إيثيلين جلايكول) -2000] (ملح الأمونيوم) (PEG2000 DOPE) و 25 ملغ من الدهون الحيوية (18: 1 من 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (غطاء البيوتينيل) (ملح الصوديوم) (Biotinyl Cap DOPE)) في 10 مل من الكلوروفورم.
  3. قم بإعداد 1 مل من خليط الدهون الرئيسي لكل قارورة وتخزينها في -20 درجة مئوية في قوارير زجاجية نظيفة.
    ملاحظة: قم بتخزين الدهون المذابة في قوارير زجاجية وقم بتغطية غطاء القارورة بالبارافيلم أثناء التخزين.

2. تحضير محلول الجسيمات الشحمية

  1. اشطف قارورة زجاجية سعة 2 مل ب ddH2O و 99٪ إيثانول وجففها جيدا في فرن تجفيف 60 درجة مئوية.
  2. شطف حقنة زجاجية 250 ميكرولتر مع الكلوروفورم ثم نقل 200 ميكرولتر من مزيج الدهون الرئيسية في قارورة الزجاج الجاف.
  3. استخدم مسدس رش النيتروجين لتدفق N2 برفق أثناء تدوير القارورة باستمرار في اتجاه واحد.
    ملاحظة: سيساعد N2 على تبخر الكلوروفورم ، وستشكل الدهون المتبقية طبقة رقيقة على جدار القارورة الزجاجية. اضبط تيار النيتروجين ليكون لطيفا جدا في البداية وقم بزيادة التدفق عند ظهور فيلم أبيض في القارورة ؛ أكمل عملية التبخر هذه في غضون 5 دقائق.
  4. انقل القارورة الزجاجية إلى فرن تجفيف فراغ في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 16-24 ساعة لإزالة الكلوروفورم بالكامل من الدهون.
  5. أضف 2 مل من المخزن المؤقت للدهون الطازجة (10 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) و 100 mM NaCl) إلى القارورة الزجاجية وقم بإذابة الدهون عند RT لمدة 2 ساعة. دوامة الحل عدة مرات ونقله إلى أنبوب ثقافة البولي بروبلين 5 مل.
  6. قم بتقطيع محلول الدهون على الجليد باستخدام سونيكاتور ذو طرف دقيق لتشكيل حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة ، باستخدام الإعدادات التالية: 6 ثوان على 12 ثانية (سعة 20٪) لمدة 6 دورات ، ثم 6 ثوان على 6 ثوان (سعة 30٪) لمدة 3 دورات ، وأخيرا 10 ثوان (سعة 40٪).
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي زيادة درجة الحرارة أثناء الصوتنة إلى انفجار الرغوة وتدمير الجسيمات الشحمية. لذلك ، تحقق من حالة الرغوة ودرجة الحرارة وقم بتجديد الجليد بشكل متكرر.
  7. قم بتصفية الجسيمات الشحمية من خلال مرشح حقنة نايلون 0.22 ميكرومتر ، وحاصل القسمة ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: مع انخفاض حركتها مع التخزين المطول ، يجب استخدام الجسيمات الشحمية في غضون 2-3 أشهر أو تحضيرها طازجة قبل الاستخدام.

3. تسلسل الاستنساخ والبيوتينيل للحمض النووي لامدا

  1. إدخال الزخارف الملزمة في الحمض النووي لامدا
    1. اهضم الجزء المستهدف الذي يحتوي على الزخارف الملزمة والحمض النووي Lambda باستخدام NheI و XhoI. قم بربط الجزء المستهدف بالحمض النووي Lambda باستخدام T4 ligase طوال الليل في RT.
    2. خلايا E.coli VCS257 في وسط LB خال من المضادات الحيوية حتى يصل OD600 إلى 0.6. قم بتخزين البكتيريا في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
    3. سخني محلول الربط عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإفساد T4 ligase.
    4. قم بإذابة مستخلص العاثية Lambda ، وامزجه مع المنتج المربوط برفق عن طريق السحب بأطراف حادة ، واحتضان الخليط في RT لمدة 2 ساعة.
    5. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت SM (50 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 100 mM NaCl ، و 8 mM MgCl2 ، المصفى من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر) و 20 ميكرولتر من الكلوروفورم في خليط التغليف من الخطوة 3.1.4 ، واخلطه جيدا ، وطرد مركزي المحلول.
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على نشاط مستخلص العبوة عند 4 درجات مئوية لفترات طويلة.
    6. تحضير خليط التفاعل عن طريق خلط 10 ميكرولتر من مستخلص العبوة مع 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت SM و 100 ميكرولتر من خلايا VCS257 (من الخطوة 3.1.2) معا ، واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يعتمد تركيز محلول التغليف على كثافة لويحات العاثية في اليوم التالي ؛ يمكن تخفيفه أو إضافته حسب الحاجة.
    7. خذ ~ 5 مل من الآجار العلوي المذاب (22 جم / لتر مرق NZCYM مع 15 جم / لتر أجار) في أنبوب سعة 15 مل. بمجرد أن يبرد الآجار العلوي إلى ~ 42 درجة مئوية ، أضف خليط التفاعل (من الخطوة 3.1.6) ببطء باستخدام ماصة حادة النهاية واسكب السائل على صفيحة أجار LB خالية من المضادات الحيوية. احتفظ باللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.
    8. تأكد من اللويحات الإيجابية بين لويحات العاثية الشفافة على لوحة أجار العلوية بواسطة PCR. انقل اللويحات الموجبة إلى صفيحة أجار علوية جديدة مع ماصة واحتفظ باللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.
    9. أضف 400 ميكرولتر من خلايا VCS257 إلى 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10 mM MgCl 2 و 10 mM CaCl2 ، وقم بتلقيح لوحة واحدة في خليط الخلايا هذا ، واحتضانها في شاكر 37 درجة مئوية عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
    10. أضف 800 ميكرولتر من هذا المعلق الذي يحتوي على لوحة العاثية إلى 200 مل من مرق NZCYM في دورق سعة 2 لتر واحتضانه في شاكر 37 درجة مئوية عند 125 دورة في الدقيقة.
    11. قياس OD600 من التعليق البكتيري بعد ~ 4 ساعات من الزراعة. ضع في اعتبارك أن قيمة OD600 سترتفع أولا ثم تنخفض إلى قاع عند ~ 0.2. أوقف الحضانة عندما تكون قيمة OD 600 على وشك الارتفاع مرة أخرى ، وأضف500 ميكرولتر من الكلوروفورم ، واهتز عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق أخرى.
      ملاحظة: الزيادة في OD600 بعد الحوض الصغير ستحدث بسرعة ؛ وبالتالي ، يجب قياس قيمة OD600 في كثير من الأحيان عندما تنخفض إلى 0.3 لتجنب نمو خلايا VCS257 المفرط في الثقافة.
    12. انقل مزرعة العاثية إلى زجاجة سعة 500 مل ، وأضف 11.7 جم من كلوريد الصوديوم ، ورج الزجاجة. احتضان الزجاجة على الثلج لمدة 10 دقائق.
    13. انقل التعليق بالتساوي إلى أربعة أنابيب سعة 50 مل. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب بسرعة 12000 × جم لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يجب القيام بجميع خطوات الطرد المركزي هذه في القسم 3.1 عند 4 درجات مئوية.
    14. انقل المواد الطافية إلى أربعة أنابيب جديدة سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي مرة أخرى بنفس السرعة لمدة 5 دقائق.
    15. اجمع المواد الطافية ، وأضف 10٪ (وزن / حجم) مسحوق PEG8000 ، وقم بتدويرها عند 4 درجات مئوية لاحتضانها لمدة 30 دقيقة.
    16. أجهزة الطرد المركزي للمعلقات من الخطوة 3.1.15 عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة للحصول على كريات العاثية.
    17. أعد تعليق الكريات في 1 مل من محلول تخفيف العاثيات (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, و 10 mM MgCl2) في أربعة أنابيب وصب كل 4 مل من هذه المخاليط في أنبوب 50 مل.
    18. يضاف إنزيم RNase A (10 ملغم/مل) وDNase I (4 ملغم/مل) إلى تركيزات نهائية تبلغ 20 ميكروغرام/مل و5 ميكروغرام/مل ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحلل الأحماض النووية الزائدة.
    19. أضف 4.5 مل من 300 مللي مل Tris-HCl (درجة حموضة 7.5) ، 2.76 مل من 0.5 M حمض رباعي الخليك إيثيلين ديامين (EDTA) ، 1.67 مل من 10٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) ، و 75 ميكرولتر من البروتيناز K (10 مجم / مل) في الأنبوب ، واحتضانه عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    20. أضف 4.5 مل من أسيتات البوتاسيوم 3 M المبردة مسبقا ، واحتضانها على الثلج لمدة 10 دقائق.
    21. جهاز طرد مركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 10 دقائق ، وقم بتدوير المادة الطافية لمدة 5 دقائق إضافية عند 10000 × جم.
    22. أضف 70٪ من حجم الأيزوبروبانول إلى المادة الطافية المجمعة (من الخطوة 3.1.21) مع خلط كاف ، واحتضان في RT لمدة 2 دقيقة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من الأيزوبروبانول وقم بتدويره مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: سيتم تلطيخ حبيبات الحمض النووي قبل أول 10 دقائق من الطرد المركزي ؛ سيتم تركيز الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب بعد الطرد المركزي الثاني لمدة 5 دقائق.
    23. اغسل الحمض النووي المترسب ب 2-3 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ وقم بتدويره مرة أخرى لمدة 1 دقيقة. جفف الحبيبات عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة ، ثم أعد تعليق الحمض النووي في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) و 1 mM EDTA) طوال الليل عند RT.
    24. انقل الحمض النووي إلى أنبوب سعة 1.5 مل وقم بتدويره بسرعة 18000 × جم لمدة 3 دقائق. نقل الحمض النووي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. احصل على الحمض النووي Lambda المنقى وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد الحمض النووي البيوتين لامدا
    1. قم بإذابة 50 ميكرولتر من الحمض النووي Lambda المنقى بزخارف مستنسخة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: نظرا لأن طول Lambda DNA ~ 48 كيلو بايت في الدقيقة ، يجب تسخينه قبل السحب لتجنب فواصل الحمض النووي.
    2. امزج 50 ميكرولتر من الحمض النووي لامدا ، 1 ميكرولتر من برايمر البيوتين (5 '- (فوس) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3 ') (100 ميكرومتر) و 54 ميكرولتر من ddH2O معا. شارك في احتضان الخليط على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق واتركه على المقعد ليبرد إلى RT.
    3. أضف 12 ميكرولتر من 10x T4 ligase buffer و 3 ميكرولتر من T4 ligase ، واحتضان في RT لعدة ساعات أو طوال الليل.
    4. أضف كمية متساوية من خليط الفينول كلوروفورم (1: 1) إلى منتج الربط ، واخلطه جيدا على الفور ، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة دقيقتين عند RT.
    5. انقل المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي بعناية إلى أنبوب جديد ، وأضف حجما متساويا من الكلوروفورم ، واخلطه جيدا ، ثم جهاز طرد مركزي بسرعة 12000 × جم لمدة 2 دقيقة.
    6. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد ، إضافة حجم متساو من الأيزوبروبانول و 10 ٪ من حجم خلات الصوديوم 3 M ، واحتضان في RT لمدة 2 دقيقة. جهاز طرد مركزي للخليط على حرارة 12000 × جم لمدة 5 دقائق.
    7. قم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الحبيبات بنسبة 75٪ من الإيثانول ، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 12000 × جم لمدة 5 دقائق.
    8. قم بإزالة 75٪ من الإيثانول ، وجفف الحمض النووي بالهواء عند RT لمدة 10 دقائق ، واستخدم 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE لإذابة الحمض النووي.
    9. أضف 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (30٪ (وزن / حجم) PEG8000 و 30 mM MgCl 2) إلى 120 ميكرولتر من المحلول من الخطوة3.2.8 ، وقم بتدويره عند 4 درجات مئوية لمدة 20-24 ساعة.
    10. جهاز طرد مركزي للخليط على حرارة 18000 جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
    11. استخدم 180 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقا بنسبة 75٪ لغسل الحبيبات ، وكرر الخطوة 3.2.10.
    12. جفف الحبيبات عند RT، واستخدم 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE150 لإذابة الحمض النووي.

4. حواجز متعرجة نانوية

  1. تنظيف الشرائح في الأسيتون لمدة 20 دقيقة عن طريق صوتنة ونقلها إلى حاوية زجاجية جديدة مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم لصوتنة لمدة 20 دقيقة أخرى. امزج 90 مل من H 2 SO4 مع 30 مل من H 2 O2 ، واغمر الشرائح فيهذا الخليط لمدة 30 دقيقة. شطف الشرائح مع الأسيتون والأيزوبروبانول وتجفيف الشرائح مع N2.
    ملاحظة: خلط H 2 SO4 و H 2 O2هو عملية طاردة للحرارة. اتخاذ احتياطات السلامة الكافية أثناء العملية.
  2. قم بتغطية الشريحة النظيفة باستخدام polymethylmethacrylate (PMMA) 25 كيلو دالتون ، PMMA 49.5 كيلو دالتون ، والطبقة العليا من الطلاء الواقي الموصل على التوالي. استخدم الطباعة الحجرية بحزمة الإلكترون لكتابة الحواجز المتعرجة (الشكل 1 أ).
  3. اغسل الشرائح باستخدام ddH 2 Oلإزالة الطبقة الواقية الموصلة وتجفيف الشرائح باستخدام N2.
  4. قم بإيداع طبقة 30 نانومتر من الكروم (Cr) باستخدام آلة رش المغنطرون وإزالة طبقات PMMA المتبقية باستخدام الأسيتون.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام خلية تدفق واحدة لأكثر من 20 تجربة ستائر الحمض النووي. لإعادة استخدام خلية التدفق ، اغسلها بالإيثانول والمنظفات وهيدروكسيد الصوديوم.

5. تنقية بروتين EWS-FLI1

ملاحظة: تعد ملاحظة 500 نانومتر EWS-FLI1 على الحمض النووي Lambda بزخارف 25× GGAA مثالا جيدا لتطبيق ستائر الحمض النووي على تكوين المكثفات. EWS-FLI1 هو بروتين اندماج يجمع بين الطرف N ل EWSR1 (1-265) والطرف C ل FLI1 (220-453). تم دمج علامة mCherry في الطرف N لبروتين الاندماج EWS-FLI1 للتصور.

  1. استنساخ جين EWS-FLI1 في ناقل pRSF معاد تشكيله أو أي ناقل تعبير بدائيات النوى مناسب آخر.
  2. تحويل ترميز البلازميد 7x His-mCherry-EWSFLI1 إلى سلالة E.coli BL21 (DE3) ؛ تنمو مستعمرة واحدة في 5 مل من وسط LB عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. عندما تصل قيمة OD600 إلى 0.6-0.8 بعد النقل إلى 2 لتر من وسط رطل ، أضف 0.5 mM IPTG وهز مزرعة الخلية عند 18 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  3. قم بالطرد المركزي للمزرعة لإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا باستخدام محلول التحلل (50 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 1 M KCl ؛ 1 M اليوريا ؛ 10 mM إيميدازول ؛ 1.5 mM بيتا ميركابتوإيثانول (β-ME) ؛ و 5 ٪ الجلسرين).
  4. بعد الصوتنة والطرد المركزي عند 18000 × جم لمدة ~ 30 دقيقة ، قم بتحميل المادة الطافية على راتنج Ni-NTA المتوازن في حجم 5 أضعاف من محلول التحلل ، ثم اغسل الراتنج بحجم 10 أضعاف من محلول الغسيل المؤقت (50 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 M KCl ، 1 M اليوريا ، 40 mM imidazole ، 1.5 mM β-ME ، و 5٪ الجلسرين).
  5. قم بتخفيف البروتين المرتبط ب 15 مل من محلول الشطف (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) ، 1 M KCl ، 1 M urea ، 500 mM imidazole ، 1.5 mM β-ME ، و 5٪ glycerol) وركز الشطف إلى ~ 500 ميكرولتر.
  6. قم بتحميل محلول البروتين المركز على عمود ترشيح الهلام وتحليل المنتجات بواسطة رحلان جل SDS-polyacrylamide gel. قم بتجميد البروتين المنقى بسرعة في النيتروجين السائل وخزنه في -80 درجة مئوية.

6. إعداد الحمض النووي ستائر التدفق

  1. قم بإعداد خلية تدفق ذات حواجز نانوية متعرجة لتجربة ستائر الحمض النووي وتحديد اتجاه التدفق. للقيام بذلك ، قم بتوصيل أنابيب الإدخال والإخراج في الاتجاه الصحيح.
  2. اغسل خلية التدفق ب 2.5 مل من المخزن المؤقت للدهون باستخدام حقنتين سعة 3 مل. تأكد من عدم وجود فقاعة في خلية التدفق.
  3. قم بإزالة المحقنة من الإخراج ، وحقن 1 مل من محلول الجسيمات الشحمية (40 ميكرولتر من مخزون الجسيمات الشحمية من القسم 2 و 960 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدهون) ثلاث مرات مع حضانة لمدة 5 دقائق بعد كل حقنة.
  4. لخطوة الشفاء ، اغسل خلية التدفق ب 2.5 مل من المخزن المؤقت للدهون ببطء ، واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون وقت الشفاء أطول إذا لزم الأمر ؛ في حالة ظهور أي فقاعات ، قم بإجراء الشفاء المزدوج عن طريق تكرار الخطوتين 5.3 و 5.4 لإزالة الفقاعات.
  5. تحضير 30 مل من المخزن المؤقت لألبومين مصل الأبقار (BSA) (40 mM Tris-HCl (pH 7.5) ، 2 mM MgCl2 ، 1 mM dithiothreitol ، و 0.5 mg / mL BSA للتخميل السطحي). بعد 30 دقيقة من الشفاء ، اغسل خلية التدفق ب 2.5 مل من المخزن المؤقت BSA من جانب الإخراج.
    ملاحظة: مخزون BSA عبارة عن محلول 20 مجم / مل مخزن عند 4 درجات مئوية ويجب استخدامه في غضون 1-2 أسابيع. يمكن ضبط تركيز BSA في المخزن المؤقت وفقا لحالة السطح.
  6. حقن 800 ميكرولتر من مخزن الستربتافيدين (10 ميكرولتر من مخزون الستربتافيدين 1 مجم / مل ، 790 ميكرولتر من محلول BSA) في خلية التدفق من جانب الإدخال في خطوتين مع 10 دقائق من الحضانة بعد كل خطوة.
    ملاحظة: يثبت الستربتافيدين الحمض النووي على الدهون بسبب تعددها عن طريق سد الفجوة بين الدهون الحيوية والحمض النووي البيوتينيل.
  7. اغسل خلية التدفق ب 2.5 مل من محلول BSA المؤقت لإزالة جميع جزيئات الستربتافيدين الحرة.
  8. تمييع الحمض النووي Biotin-Lambda بزخارف مستنسخة من القسم 3 باستخدام مخزن BSA (2.5 ميكرولتر من الحمض النووي و 998 ميكرولتر من مخزن BSA المؤقت). حقن الحمض النووي لامدا 4 مرات ببطء على فترات 5 دقائق.
  9. قم بتشغيل المجهر ونظام أشباه الموصلات المعدنية التكميلية (sCMOS) العلمي أثناء الحقن. اغسل الأنبوب ب 10 مل من ddH 2 O. اشطف المنشور وموصل الأنبوب بالماء ومنظف كوفيت سائل2٪ و 99٪ إيثانول. قم بإعداد مخزن التصوير المؤقت عن طريق إضافة KCl وصبغة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل إلى مخزن BSA المؤقت للحصول على تركيزات نهائية تبلغ 150 mM و 0.5 nM ، على التوالي ، وتناول ما لا يقل عن 20 مل من مخزن التصوير المؤقت في حقنة سعة 30 مل.
  10. قم بإعداد خلية التدفق على مرحلة المجهر وقم بتوصيلها بنظام الموائع الدقيقة.
  11. استخدم معدل تدفق 0.03 مل / دقيقة لطرد جزيئات الحمض النووي إلى الحاجز لمدة 10 دقائق ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة مع توقف التدفق ، ثم قم بإيقاف تشغيله للسماح للحمض النووي بالانتشار أفقيا.
    ملاحظة: الغرض من هذه الحضانة التي تستغرق 30 دقيقة هو السماح لجزيء الحمض النووي بالتوزيع بشكل متساو أمام الحاجز من خلال الانتشار البسيط لأن جزيئات الحمض النووي تميل إلى التراكم على جانب الحاجز المغلق أمام المدخلات حيث يتم غسلها. يمكن تعديل وقت الحضانة حسب الضرورة.

7. تصوير تكوين تكثيف EWS-FLI1 على ستائر الحمض النووي

  1. افتح برنامج التصوير ، وابحث عن مواضع 3 × 3 أنماط متعرجة تحت المجال الساطع وقم بتمييزها.
  2. قم بتشغيل التدفق بسرعة 0.2 مل / دقيقة لتلطيخ الحمض النووي بصبغة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل لمدة 10 دقائق.
  3. تمييع mCherry-EWS-FLI1 مع المخزن المؤقت للتصوير إلى تركيز 100 نانومتر في 100 ميكرولتر في الأنبوب.
  4. قم بتحميل عينة البروتين من خلال الصمام باستخدام حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر ، وقم بتغيير معدل التدفق إلى 0.4 مل / دقيقة.
  5. قم بتشغيل ليزر 488 نانومتر وقم بمسح مسبق لكل منطقة للتحقق من حالة توزيع الحمض النووي ؛ حدد المنطقة التي تتوزع فيها جزيئات الحمض النووي بالتساوي. اضبط طاقة الليزر على 10٪ لليزر 488 نانومتر و 20٪ لليزر 561 نانومتر. استخدم مقياس الطاقة لقياس طاقة الليزر الحقيقية بالقرب من المنشور: 4.5 ميجاوات لليزر 488 نانومتر و 16.0 ميجاوات لليزر 561 نانومتر.
  6. الحصول على الصور
    1. ابدأ في الحصول على الصور على فترات 2 ثانية باستخدام كل من ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر في وقت واحد.
    2. قم بتغيير الصمام من الوضع اليدوي إلى وضع الحقن للسماح للمخزن المؤقت للتصوير بطرد عينة البروتين في خلية التدفق بعد 60 ثانية.
      ملاحظة: ستستغرق هذه العملية ~ 30 ثانية ، وسيتم تغطية مجال الرؤية بإشارات mCherry بمجرد وصول بروتينات EWS-FLI1 إلى خلية التدفق.
    3. لإزالة EWS-FLI1 المجاني ، استمر في غسل خلية التدفق باستخدام مخزن التصوير المؤقت لمدة 5 دقائق مع تشغيل ليزر 561 نانومتر فقط. أوقف التدفق واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. قم بتشغيل التدفق عند 0.4 مل / دقيقة للسماح للحمض النووي بالتمدد ، والحصول على صور على فترات 2 ثانية بين الإطارات المختلفة للحصول على بيانات عالية الإنتاجية لتشكيل مكثفات EWS-FLI1.

8. تحليل الشدة ل mCherry-EWS-FLI1

  1. قم باستيراد البيانات كتسلسلات صور إلى برنامج ImageJ ، واختر النقاط النقطية في مواقع GGAA × 25 في مربع 8× 8 بكسل ، واحفظ الصورة بتنسيق .tif.
  2. احسب الشدة كمجموع الكثافة في مربع 8×8 بكسل ، بما في ذلك النقطة بأكملها ، وقم بإزالة الخلفية عن طريق طرح كثافة الخلفية في منطقة من نفس الحجم بالقرب من مربع 8 × 8 بكسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر الرسم التخطيطي لستائر الحمض النووي في الشكل 1 أ والشكل 1 ب والشكل 1 د. تم العثور على تسلسل الهدف المستنسخ الذي يحتوي على 25 تكرارا غير متقطع ل GGAA في مروج NORB1 في ساركوما إيوينغ. هذا التسلسل المستهدف أمر بالغ الأهمية لتوظيف EWS-FLI128. تم تصور جزيئات EWS-FLI1 من خلال الكشف عن إشارات EWS-FLI1 التي تحمل علامة mCherry والتي تم الحصول عليها باستخدام ليزر 561 نانومتر (الشكل 1C<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نظرا لأن نهج الجزيء الواحد حساس للغاية لمحتويات نظام التفاعل ، يجب بذل جهد إضافي لضمان جودة جيدة لجميع المواد والمحاليل أثناء تجارب ستائر الحمض النووي ، وخاصة الدهون المحضرة في القسمين 1 و 2 والمخازن المؤقتة المستخدمة في القسم 5. يجب استخدام الكواشف ذات النقاء العالي لإعداد المخازن المؤقتة ، ويجب تحضير المخازن المؤقتة حديثا للفحص أحادي الجزيء

عندما تم مسح 500 نانومتر mCherry المسمى EWS-FLI1 في الغرفة ، ظهرت العديد من النقاط الأرجواني على الحمض النووي Lambda الذي يحتوي على تسلسل 25× GGAA. لاحظ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منح NSFC رقم 31670762 (Z.Q.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
488 نانومتر ضخ ليزر الحالة الصلبةمتماسكOBIS488LS
561 نانومتر ضخ ليزر الحالة الصلبةمتماسكOBIS561LS
أجارراونR003215-50 جم
بيوتينيل DOPEأفانتي870273P
مصل الأبقار الألبومينسيجماA7030
كلوروفورمأمريسكو1595C027
طلاء إلكترا 92Allresist GmbHAR-PC 5090.02الطلاء الواقي الموصل
Deoxyribonuclease I البقرSigmaD5139-2MG
DOPCAvanti850375P
DTTSigmaD9779
غطاء زجاجيفيشر Scientific12-544-7
Hellmanex IIISigmaZ805939-1EA
KClSigma60130
Lambda DNANEBN3013S
مستخلصات التعبئة LambdaEpicenterMP5120
MgCl2< / sub>SigmaM2670
NaClSigmas3014
NanoportIdexN-333-01
NheI-HFNEBR3131S
نيكون المجهر المقلوبنيكونكسوف Ti
NZCYM مرقسيجماN3643-250G
PEG-2000 DOPEAvanti880130P-1G
PEG-8000Amresco25322-68-3
PMMA 200K ، إيثيل لاكتات 4٪Allresist GmbHAR-P 649.04
PMMA 950K ، ANISOLE 2٪Allresist GmbHAR-P 672.02
Prime 95B كاميرا CMOS العلميةالقياسات الضوئيةPrime95B
بروتيناز KNEBP8107S
زجاج السيليكاG.Finkenbeiner
صمام حقن سداسيالاتجاهات IdexMXP9900-000
StreptavidinThermoS888مخفف مع ddH 2 < / sub >O
جهاز هارفاردمضخة 11 Elite
T4 DNA LigaseNEBM0202S
Tris baseSigmaT6066
XhoINEBR0146V
YOYO-1 يوديد (491/509)InvitrogenY3601مخفف ب DMSO
شريحة مضخة

المراجع

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ستائر الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجينالفصل الطوريالبروتينات الورمية الاندماجيةتكثيفات عوامل النسخالتكثيفات الجزيئية الحيويةإزاحة الحركة الكهربائيةخلية تدفق مائعية دقيقةوسم mCherry
التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.