هنا ، نصف استخدام طريقة التصوير أحادية الجزيء ، ستائر الحمض النووي ، لدراسة الآلية الفيزيائية الحيوية لمكثفات EWS-FLI1 المتجمعة على الحمض النووي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم العثور على جينات الاندماج الناتجة عن نقل الكروموسومات في العديد من الأورام الصلبة أو سرطان الدم. EWS-FLI1 ، الذي ينتمي إلى عائلة FUS / EWS / TAF15 (FET) من البروتينات السرطانية الاندماجية ، هو أحد جينات الاندماج الأكثر مشاركة في ساركوما إيوينغ. عادة ما تحتوي بروتينات اندماج عائلة FET هذه على مجال منخفض التعقيد (LCD) من بروتين FET في نهايتها N ومجال ربط الحمض النووي (DBD) في نهايتها C. تم التأكيد على أن EWS-FLI1 يشكل مكثفات جزيئية حيوية في مواضع الربط المستهدفة بسبب تفاعلات LCD-LCD و LCD-DBD ، ويمكن لهذه المكثفات تجنيد بوليميراز RNA II لتعزيز النسخ الجيني. ومع ذلك ، فإن كيفية تجميع هذه المكثفات في مواقع الربط الخاصة بها لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق طريقة الفيزياء الحيوية أحادية الجزيء - ستائر الحمض النووي - لتصور عمليات التجميع هذه لمكثفات EWS-FLI1. هنا ، تتم مناقشة البروتوكول التجريبي التفصيلي ونهج تحليل البيانات لتطبيق ستائر الحمض النووي في دراسة المكثفات الجزيئية الحيوية التي تتجمع على الحمض النووي المستهدف.
المقدمة
يعد تنظيم النسخ خطوة حاسمة للتعبير الجيني الدقيق في الخلايا الحية. تشارك العديد من العوامل ، مثل تعديل الكروموسومات وعوامل النسخ (TFs) والحمض النووي الريبي غير المشفر ، في هذه العملية المعقدة1،2،3. من بين هذه العوامل ، تساهم TFs في خصوصية تنظيم النسخ من خلال التعرف على تسلسلات الحمض النووي المحددة المعروفة باسم المروجين أو المعززات وربطها ، وبالتالي تجنيد بروتينات وظيفية أخرى لتنشيط أو قمع النسخ4،5،6،7. كيف تمكنت فرق العمل هذه من البحث عن مواقعها ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير المزيج الرئيسي ثنائي الطبقة الدهنية
- اشطف القوارير الزجاجية بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) والإيثانول بنسبة 99٪ وجففها في فرن تجفيف 60 درجة مئوية.
- اصنع مزيج الدهون الرئيسي عن طريق إذابة 1 جم من 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ، 100 مجم من الدهون المتفاعلة مع البولي إيثيلين جلايكول (PEGylated) (18: 1 من 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [ميثوكسي (البولي إيثيلين جلايكول) -2000] (ملح الأمونيوم) (PEG2000 DOPE) و 25 ملغ من الدهون الحيوية (18: 1 من 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (غطاء البيوتينيل) (ملح الصوديوم) (Biotinyl Cap DOPE)) في 10 مل من الكلوروفورم.
- قم بإعداد 1 مل من خليط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر الرسم التخطيطي لستائر الحمض النووي في الشكل 1 أ والشكل 1 ب والشكل 1 د. تم العثور على تسلسل الهدف المستنسخ الذي يحتوي على 25 تكرارا غير متقطع ل GGAA في مروج NORB1 في ساركوما إيوينغ. هذا التسلسل المستهدف أمر بالغ الأهمية لتوظيف EWS-FLI128. تم تصور جزيئات EWS-FLI1 من خلال الكشف عن إشارات EWS-FLI1 التي تحمل علامة mCherry والتي تم الحصول عليها باستخدام ليزر 561 نانومتر (الشكل 1C<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظرا لأن نهج الجزيء الواحد حساس للغاية لمحتويات نظام التفاعل ، يجب بذل جهد إضافي لضمان جودة جيدة لجميع المواد والمحاليل أثناء تجارب ستائر الحمض النووي ، وخاصة الدهون المحضرة في القسمين 1 و 2 والمخازن المؤقتة المستخدمة في القسم 5. يجب استخدام الكواشف ذات النقاء العالي لإعداد المخازن المؤقتة ، ويجب تحضير المخازن المؤقتة حديثا للفحص أحادي الجزيء
عندما تم مسح 500 نانومتر mCherry المسمى EWS-FLI1 في الغرفة ، ظهرت العديد من النقاط الأرجواني على الحمض النووي Lambda الذي يحتوي على تسلسل 25× GGAA. لاحظ .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل منح NSFC رقم 31670762 (Z.Q.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 488 نانومتر ضخ ليزر الحالة الصلبة | متماسك | OBIS488LS | |
| 561 نانومتر ضخ ليزر الحالة الصلبة | متماسك | OBIS561LS | |
| أجار | راون | R003215-50 جم | |
| بيوتينيل DOPE | أفانتي | 870273P | |
| مصل الأبقار الألبومين | سيجما | A7030 | |
| كلوروفورم | أمريسكو | 1595C027 | |
| طلاء إلكترا 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | الطلاء الواقي الموصل |
| Deoxyribonuclease I البقر | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| غطاء زجاجي | فيشر Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| مستخلصات التعبئة Lambda | Epicenter | MP5120 | |
| MgCl2< / sub> | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| نيكون المجهر المقلوب | نيكون | كسوف Ti | |
| NZCYM مرق | سيجما | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K ، إيثيل لاكتات 4٪ | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K ، ANISOLE 2٪ | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B كاميرا CMOS العلمية | القياسات الضوئية | Prime95B | |
| بروتيناز K | NEB | P8107S | |
| زجاج السيليكا | G.Finkenbeiner | ||
| صمام حقن سداسي | الاتجاهات Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | مخفف مع ddH 2 < / sub >O |
| جهاز هارفارد | مضخة 11 Elite | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 يوديد (491/509) | Invitrogen | Y3601 | مخفف ب DMSO |
المراجع
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histon....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
