مقالة منهجية

عزل وثقافة الخلايا الظهارية البشرية الأولية باستخدام Y-27632

5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62978

⸱

نوفمبر 6, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم طريقة معدلة لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجيفال الإنسان عن طريق إضافة مثبط الصخرة، Y-27632، إلى الطريقة التقليدية. هذه الطريقة أسهل وأقل استهلاكا للوقت ، وتعزز خصائص الخلايا الجذعية ، وتنتج أعدادا أكبر من الخلايا الظهارية عالية الإمكانات لكل من المختبر والتطبيقات السريرية.

الملخص

النسيج اللثة هو الهيكل الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ويلعب أدوارا ذات مغزى في العديد من الوظائف عن طريق الفم. الظهارة اللثة هي بنية مهمة من الأنسجة اللثة ، وخاصة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة. دراسة وظائف الخلايا الظهارية الغنجيفال له قيمة علمية حاسمة، مثل إصلاح العيوب الفموية والكشف عن توافق المواد الحيوية. كما الخلايا الظهارية الغنجية البشرية هي خلايا الكيراتينية متباينة للغاية، وعمرها قصير، وأنها من الصعب المرور. حتى الآن، هناك طريقتان فقط لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الغنجيفال، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية. ومع ذلك، فإن الوقت اللازم للحصول على الخلايا الظهارية باستخدام طريقة الزرع المباشر أطول، ومعدل بقاء الخلية من الطريقة الأنزيمية أقل. سريريا، الحصول على النسيج الغنجيفال محدودة، لذلك هناك حاجة إلى عزل مستقرة وفعالة وبسيطة في المختبر ونظام الثقافة. قمنا بتحسين الطريقة الأنزيمية التقليدية بإضافة Y-27632 ، وهو مثبط كيناز (ROCK) مرتبط ب Rho ، والذي يمكن أن يعزز بشكل انتقائي نمو الخلايا الظهارية. لدينا طريقة انزيمية معدلة يبسط خطوات الطريقة الأنزيمية التقليدية ويزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية، والتي لديها مزايا كبيرة على طريقة explant المباشرة وطريقة الأنزيمية.

المقدمة

اللثة البشرية ، وهي بنية الدفاع الخط الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ، ليس فقط حاجزا ماديا وكيميائية1، ولكن أيضا يفرز فئات مختلفة من الوسطاء الالتهابيين الذين يشاركون في الاستجابات المناعية ويشكلون حاجزا مناعيا2،3. تلعب ظهارة اللثة دورا مهما في إصلاح وتجديد أنسجة اللثة. لذلك ، فإن دراسة الدفاع والمناعة من ظهارة اللثة ذات أهمية كبيرة لفهم حدوث التهاب اللثة وتشخيصه وعلاجه. عزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجية من الأنسجة الغنجية البشرية هي الخطوة الأولى المطلوبة لدراسة ظهارة الغنجيفال. يتطلب هذا الإجراء عمليات أساسية مثل إنتاج خلايا البذور لهندسة الأنسجة ، والنماذج المختبرية للأمراض المرتبطة باللثة ، ومواد لإصلاح عيوب اللثة.

تتميز الخلايا الظهارية الغنجية الأولية بانخفاض معدل الانقسام في المختبر4، وقد بحث الباحثون عن طريقة عزل وزراعة مثالية لعقود. حتى الآن، اثنين من تقنيات مختلفة، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية، وتستخدم عادة في المختبرات للحصول على خلايا الظهارة gingival الأولية في المختبر4،5. طريقة explant المباشر له مزايا مثل شرط وجود كمية أقل من عينات الأنسجة وإجراءات العزل البسيطة ، ولكن لديها مساوئ وقت أطول للثقافة والتعرض للتلوث5. على الرغم من أن الأسلوب الأنزيمي يقصر وقت الثقافة المطلوب ، إلا أن الكفاءة منخفضة نسبيا وتختلف اعتمادا على الإنزيمات والمتوسطة المستخدمة. وأظهر Kedjarune وآخرون6 أن طريقة الزرع المباشر، التي تتطلب المزيد من الوقت قبل الثقافة الفرعية (أسبوعين)، تبدو أكثر نجاحا لزراعة الخلايا الظهارية الغنجية مقارنة بصورة الأنزيمية. ومع ذلك، وبمقارنة هاتين الطريقتين، وجد كلينغبيل وآخرون 7 أن الطريقة الأنزيمية كان لها أفضل النتائج للثقافات الأولية للخلايا الظهارية الفموية، وكان من الممكنالحصول على الغلة المثالية للخلايا في أقصر فترة زمنية (11.9 يوما مقابل 14.2 يوما).

لذلك ، كان من المهم تطوير طريقة أكثر ملاءمة وفعالية لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الفموية4. كنا قد ذكرت سابقا أن إضافة Y-27632, مثبط كيناز البروتين المرتبطة رو (روك), يبسط إجراء العزل من خلايا البشرة الأولية الإنسان وخلايا القرنية منأنسجةالجلد الكبار 8,9,10. طورنا G-المتوسطة، وسيلة تلقيح مشروطة جديدة أن يفصل تلقائيا البشرة من الخلايا الجلدية ويدعم نمو وغلة الخلايا البشرةالأولية 8،9،10. في هذه الدراسة، طورنا تقنية جديدة للعزل والثقافة الخالية من المصل للخلايا الظهارية الغنجية من خلال الجمع بين G-medium وY-27632. في جوهرها ، ويستند أسلوبنا على تبسيط الطريقة الأنزيمية التقليدية من خطوتين ، لذلك قارنا طريقتنا الجديدة مع طريقة الزرع المباشر. هذه الطريقة الأنزيمية المعدلة تقصر بشكل كبير الوقت اللازم لفصل الخلايا الظهارية الغنجية عن الأنسجة الغنجيفالية وتزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية الغنجيفالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول هي أنسجة النخل البالغ الطازجة التي يتم التخلص منها من استخراج الأسنان المتضررة في قسم جراحة الوجه والفكين وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية في المؤسسة (البروتوكول رقم 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 GR201711، التاريخ: 02-27-2017).

1. الاستعدادات

  1. جمع الأنسجة النهمية الكبار الطازجة في أنابيب 15 مل تحتوي على 10 مل من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) تكملها 3٪ البنسلين / العقدية (P /S) والحفاظ على الأنسجة عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: تعامل مع الأنسجة كما هو مفصل أدناه في غضون 24 ساعة بعد استئصالها.

2. إعداد الكواشف والثقافة المتوسطة

  1. إعداد حل الغسيل: 3٪ P/ S. ميكس 50 مل من برنامج تلفزيوني مع 1.5 مل من البنسلين (100 U/mL) و 1.5 مل من الستربتومايسين (100 ملغم / لتر).
  2. إعداد 500 مل من المتوسط المحتوي على عامل النمو (يسمى G-medium): DMEM/F12 (3:1) متوسط يحتوي على 1٪ P/S، 2٪ ملحق B27، 20 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة (EGF)، 40 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2)، و 40 ميكروغرام / مل من fungizone.
  3. إعداد حلول الهضم إنزيم للطريقة الجديدة: حل 125 ملغ من مسحوق ديسباس و 125 ملغ من مسحوق الكولاجين من النوع الأول في 50 مل من DMEM.
    ملاحظة: تصفية جميع الحلول الانزيم من خلال مصفاة 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. إعداد 500 مل من المتوسط لتحييد الهضم الأنزيمي: 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ P / S في المتوسط DMEM.

3. طريقة الزرع المباشر

  1. معالجة الأنسجة الغنجية مسبقا
    1. غسل الأنسجة gingival مع 5 مل من الإيثانول 75٪ لمدة 30 s. ثم، شطف مرتين مع 5 مل من محلول الغسيل (الخطوة 2.1) لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: إجراء جميع يغسل في أطباق زراعة الخلايا بقطر 50 ملم.
  2. Gingival ثقافة الخلايا الظهارية
    1. قطع الأنسجة gingival إلى 1 ملم3 قطع ومبعثر لهم في طبق ثقافة الخلية 100 ملم. استخدام ملقط مدببة غرامة ومقص العيون لعمليات القطع.
    2. أضف G-medium (الخطوة 2.2) إلى طبق الثقافة. ثم، احتضان طبق الثقافة في حاضنة 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية. استخدم مجهر مقلوب (40x) لفحص الأنسجة كل 24 ساعة.
    3. إزالة قطع الأنسجة gingival عندما انتشرت الخلايا الظهارية إلى 2-5 ملم في القطر حول قطع الأنسجة. تغيير G-المتوسطة كل 2-4 أيام.

4. طريقة الأنزيمية المعدلة الجديدة

  1. معالجة الأنسجة الغنجية مسبقا
    1. لهذا، اتبع نفس الخطوات كما هو موضح لأسلوب explant المباشر الخطوة 3.1.1.
  2. هضم الأنسجة الغنجية
    1. قطع الأنسجة gingival إلى قطع صغيرة، ما يقرب من <1 ملم في الحجم، مع اثنين من ريش معقمة. كرر عملية التقطيع بشفرة جراحية.
    2. إضافة 1 مل من 2.5 ملغم / مل ديسباس + كولاجيناز الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل تحتوي على قطع الأنسجة gingival، ومن ثم احتضان أنبوب لمدة 15-20 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية.
    3. عندما يصبح النسيج شفافا وفلوكولنت ، أضف 1 مل من محلول التحييد لإنهاء الهضم. مزيج تماما الحل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 10-15 مرات. مرر الحل من خلال فلتر شبكة 100 ميكرومتر.
    4. جهاز طرد مركزي عند 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    5. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في الجزء السفلي في 10 مل من المتوسطة التي تحتوي على عامل النمو (الخطوة 2.2). نقل تعليق الخلية إلى طبق ثقافة الخلية 100 ملم. أضف 10 ميكرومتر من Y-27632 إلى طبق ثقافة الخلية.
    6. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪. استبدل G-medium القديم مع G-medium الطازج كل يومين. مراقبة الخلايا في اليوم 1 واليوم 3.

5. تمرير الخلية

  1. أخرج الطبق من الحاضنة، وأزل الوسط المستهلك واغسله مرتين مع PBS. أضف 2 مل من 0.05٪ تريبسين لكل طبق 100 مم.
    ملاحظة: هز الطبق للتأكد من وجود اتصال كاف بين حل تريبسين وأسفل الطبق.
  2. اترك الطبق في حاضنة حوالي 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لعملية الهضم.
  3. استخدم المجهر (40x) لفحص الخلايا والتأكد من أن معظم الخلايا قد انفصلت عن الجزء السفلي من الطبق.
  4. أضف 2 مل من محلول الإبطال لإيقاف الهضم ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. ماصة صعودا وهبوطا 10-15 مرة. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة supernatant ببطء. إعادة إنفاق الخلايا مع 10 مل من G-المتوسطة وعدد الخلايا.
  6. أضف حوالي 1 × 106 خلايا في 10 مل من G-medium و 10 ميكرومتر Y-27632 لكل طبق 100 مم.
  7. تجديد G-المتوسطة وY-27632 كل يومين. عرض الخلايا في اليوم 1 واليوم 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 1 رسم تخطيطي لطريقة الإكسبلانت المباشرة والأسلوب الأنزيمي المعدل. طريقة explant المباشرة لا تحتاج إلى أي إنزيم هضمي خلال العملية برمتها. في المقابل ، عادة ما تحتاج الطريقة الأنزيمية التقليدية إلى مجموعتين من الإنزيمات الهضمية ، ديسباس والكولاجيناز ، لفصل الورقة الظهارية عن طبقة الخلايا الليفية الأساسية ، ثم التريبسين لإطلاق الخلايا الظهارية إلى تعليق. أسلوبنا الجديد يغفل خطوة الانفصال وهو أسلوب مبسط الأنزيمية. وعلاوة على ذلك، إضافة Y-27632 إلى G-المتوسطة يعزز بشكل فعال نمو الخلايا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

النسيج gingival هو هيكل رئيسي يحافظ على سلامة اللثة والصحة. الخلايا الظهارية Gingival لها أدوار هامة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة ويمكن استخدامها في البحث العلمي والتطبيقات السريرية والمجالات ذات الصلة، بما في ذلك بيولوجيا الفم، وعلم الصيدلة، وعلم السموم، ونقص الغشاء المخاطي عن طريق الفم18. لذلك ، من الضروري تطوير طريقة مستقرة وفعالة لحصاد الخلايا الظهارية الفموية19. الخلايا الظهارية الأولية هي نوع من الخلايا المتمايزة تماما مع عدد قليل من المقاطع وعمر قصير. وقد ثبت أن زرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل البرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة شاندونغ (ZR2019ZD36) والبرنامج الرئيسي للبحث والتطوير في مقاطعة شاندونغ (2019GSF108107) إلى X.W. برنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة شاندونغ (2018GSF118240) إلى J.G. مشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2018WS163) إلى Z.X. ومشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2019WS045) إلى J.S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اختصارات الأسماءو تعليقات
الكونتيسة عداد الخلايا الآليشنغهاي Ruiyu Bio-science & التكنولوجيا Co.Ltd.BBA0218ACحاضنة CO2 العد الأوتوماتيكي
CO2 51026333 علميةحرارية لحضانة الخلايا
Sorvall ST 16R أجهزة الطرد المركزيالحرارية العلمية75004380الطرد المركزي الخلية
طبق ثقافة الخلاياEppendorf30702115لزراعة الخلايا
50 مل أنبوب الطرد المركزيKIRGEN171003للطرد
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملKIRGEN190691Jلهضم الخلايا
مصفاة الخليةCorning مدمجة431792ترشيح الخلية
محلول الفوسفات المخزنSolarbio Life ScienceP1020-500محلول الغسيل
DMEMThermo ScientificC11995500مكون من وسط التحييد
محدد K-SFMLife تقنيات10785-012اللثة الظهارية   زراعة الخلايا المتوسطة
البنسلين ستربتومايسينالحرارية العلمية15140-122المضادات الحيوية
مصل الأبقار الجنينيالصناعات البيولوجية04-001-1AC5مكون وسط التحييد
0.05٪ تقنيات حياة التربسين25300-062لوسط تخفيف التفكك HGGEPCs
Life Technologies50-9701لمصفوفة الطلاء
DispaseGibco17105-041لعزل HGGEPCs
Collagenase Type ILife Technologies17100-017لعزل HGGEPCs
F12 مزيج المغذيات ، HamsLife Technologies31765035مكون من G-medium
B27Supplement Life Technologies17504044عامل النمو في G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595عامل النمو في G-medium
Y-27632تشغيل الجيناتIAD1011مثبط
ROCK FungizoneGibco15290026التحضير
لبروتين بشري مؤتلفG-medium EGF جيبكوPHG0311نمو في
مجموعة عد الخلايا المتوسطة G-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04لمقايسة تكاثر الخلايا
Rabbit Anti-Human CK18Abcamab82254لتلوين التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز ل HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10Abcamab76318لتلوين التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز ل HGGEPCs
فأر ماوس مضاد للإنسانتقنية إشارات خلية3390لتلوين التألق المناعي للأرومات الليفية اللثوية
الأرنب المضاد للإنسان pan-ckBD 550951لتلطيخ التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز للأرانب HGGEPCs
المضادة ل Ki67Abcam15580لتلوين التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز للأرانب HGGEPCs
المضادة ل p63Biolegend 619002لتلوين التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز للأرانب HGGEPCs
المضادة ل p75NGFRAbcamab52987لتلوين التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز ل HGGEPCs
المركزي للخلايا عامل Vimentin

المراجع

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ROCK

مقالات ذات صلة