يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تشريح الغدد اللعابية اليرقات من البعوض الغامبي Anopheles و المناعة

4.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62989

⸱

سبتمبر 30, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

في هذه المقالة

ملخص

الغدة اللعابية للبعوض البالغة (SG) مطلوبة لنقل جميع مسببات الأمراض المنقولة بالبعوض إلى مضيفيهم البشريين ، بما في ذلك الفيروسات والطفيليات. يوضح هذا الفيديو العزلة الفعالة ل SGs عن مرحلة اليرقات (L4) بعوض Anopheles gambiae وإعداد L4 SGs لمزيد من التحليل.

الملخص

الغدد اللعابية البعوض (SGs) هي جهاز بوابة المطلوبة لانتقال مسببات الأمراض التي تنقلها الحشرات. تتراكم العوامل المسببة للأمراض، بما في ذلك الفيروسات وطفيليات البلازموديوم التي تسبب الملاريا، في التجاويف الإفرازية لخلايا SG. هنا ، يستعدون لانتقال العدوى إلى مضيفيهم الفقاريين خلال وجبة دم لاحقة. كما تشكل الغدد البالغة كصياغة لبقايا برعم القناة SG اليرقات التي تستمر إلى ما بعد انحلال الهستوليسيس SG الجرو المبكر ، فإن SG اليرقات هي هدف مثالي للتدخلات التي تحد من انتقال المرض. يمكن أن يساعد فهم تطوير اليرقات في تطوير فهم أفضل لمورفولوجيا اليرقات والتكيفات الوظيفية والمساعدة في تقييم التدخلات الجديدة التي تستهدف هذا الجهاز. يوضح بروتوكول الفيديو هذا تقنية فعالة لعزل وإصلاح وتلطيخ اليرقات من البعوض الغامبي Anopheles. يتم إصلاح الغدد التي يتم تشريحها من اليرقات في محلول الإيثانول بنسبة 25٪ في خليط حمض الخليك الميثانول الجليدي ، يليه غسل الأسيتون البارد. بعد بضعة شطف في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) ، يمكن أن تكون ملطخة SGs مع مجموعة واسعة من الأصباغ علامة و / أو antisera ضد البروتينات التي أعرب عنها SG. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لعزل اليرقات SG لجمع الأنسجة لتحليل التهجين في الموقع ، والتطبيقات النسخية الأخرى ، والدراسات البروتيوميكية.

المقدمة

الملاريا هي تهديد رئيسي للصحة العامة تسبب ما يقرب من 230 مليون إصابة وما يقدر ب 409,000 حالة وفاة في عام 20191. غالبية الوفيات في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى وتسببها الطفيلي بلازموديوم فالسيباروم، الذي ناقل الحشرات هو Anopheles gambiae، موضوع هذا العرض التوضيحي بالفيديو. وعلى الرغم من أن الأرقام تشير إلى انخفاض كبير في معدل الوفيات السنوي منذ مطلع القرن (انخفاض عدد الوفيات السنوية بمقدار 300,000 >)، فإن الانخفاضات الواعدة في معدلات الأمراض التي لوحظت في الفترة من عام 2000 إلى عام 2015 آخذة في الانخفاض، مما يشير إلى الحاجة إلى نهج جديدة للحد من انتقال الأمراض2. ومن بين الاستراتيجيات الإضافية الواعدة لمكافحة الملاريا وربما القضاء عليها استهداف قدرة البعوض الناقلة باستخدام تحرير الجينات المستندة إلى CRISPR/Cas9 ومحرك الجينات3و4و5. والواقع أن استهداف ناقل البعوض (من خلال التوسع في استخدام الناموسيات المعالجة بمبيدات الحشرات) هو الذي كان له أكبر الأثر على الحد من انتقال الأمراض6.

البعوض الإناث الحصول على خلايا اللعبة البلازموديوم من الإنسان المصاب خلال وجبة الدم. بعد الإخصاب والنضج واجتياز الظهارة الوسطى والتوسع السكاني والملاحة الهيموكويل في مضيفيهم البعوض ملزمة، ومئات إلى عشرات الآلاف من sporozoites البلازموديوم غزو SGs البعوض وملء تجاويف إفراز الخلايا إفراز constituent. مرة واحدة داخل تجاويف إفرازية ، والطفيليات والوصول المباشر إلى القناة اللعابية ، وبالتالي تستعد لانتقال العدوى إلى مضيف الفقاريات الجديدة على وجبة الدم المقبل. ولأن مجموعات ال SGs حاسمة لانتقال الزنجة المسببة للملاريا إلى مضيفيهم البشريين، وتشير الدراسات المختبرية إلى أن ال SGs ليست ضرورية لتغذية الدم أو بقاء البعوض أو البراز7و8و9،فإنها تمثل هدفا مثاليا لتدابير منع انتقال العدوى. تشكل SGs البعوض الكبار كصياغة لبقايا "برعم القناة" في SGs اليرقات التي تستمر إلى ما بعد انحلال الهستوليسيس SGالمبكر 10، مما يجعل اليرقات SG هدفا مثاليا للتدخلات للحد من انتقال المرض في مرحلة البلوغ.

إن توصيف مرحلة اليرقات في تطوير SG يمكن أن يساعد ليس فقط في تطوير فهم أفضل لمورفولوجيا وتكييفاته الوظيفية ولكن يمكن أن يساعد أيضا في تقييم التدخلات الجديدة التي تستهدف هذا الجهاز من خلال تحرير الجينات من المنظمين الرئيسيين في SG. لأن جميع الدراسات السابقة لهندسة الغدة اللعابية اليرقات تسبق التصبغ المناعي وتقنيات التصويرالحديثة 10،11، فقد وضعنا بروتوكولا لعزل وتلطيخ الغدد اللعابية مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة وعلامات الخلية12. يوضح هذا الفيديو هذا النهج لاستخراج تثبيت وتلطيخ اليرقات SGs من يرقات Anopheles gambiae L4 للتصوير البؤري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الحلول والأدوات

  1. إعداد حل تشريح
    1. لإعداد حل تشريح، إضافة 2.5 مل من الإيثانول 100٪ إلى 7.5 مل من المقطر H2O في أنبوب بلاستيكي 15. عكس الأنبوب 3 مرات لخلط.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
  2. إعداد مخزون ملحي عازل بالفوسفات 10x (PBS)
    1. لإعداد مخزون برنامج تلفزيوني 10x، إضافة 17.8 غرامنا 2HPO4• 2H2O، 2.4 ز KH2PO4،80 غرام NaCl، و 2 ز KCl إلى 800 مل من المياه deionized. تخلط مع شريط ضجة على لوحة ضجة حتى المواد الصلبة قد حلت تماما. ضبط حجم النهائي إلى 1 لتر مع المياه النقية.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  3. إعداد برنامج تلفزيوني 1x
    1. إضافة 10 مل من 10x PBS إلى 90 مل من H2O في زجاجة معقمة. أغلق الغطاء بإحكام وعكس 3x لخلط.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  4. إعداد التثبيت.
    1. إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى 200 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي. جعل الحل الطازجة في كل مرة.
  5. بناء طبق المعجون (طبق زراعة الأنسجة مليئة المطاط السيليكون)
    1. اخلطي مكونات (1:50) من الايبوكسي (1 جم) والماء (50 مل) واسكبي الخليط في طبق بيتري. انتظر حتى تجف المكونات قبل الاستخدام.
      ملاحظة: بمجرد تشييدها، يمكن استخدام طبق المعجون لسنوات.

2. تشريح الغدة (الشكل 1A)

  1. جمع يرقات L4 في مرحلة متأخرة (~ 10 أيام بعد الفتحة؛ الشكل 2) من تغذية الصواني باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
    ملاحظة: انظر هذا دليل مفيد على الانترنت تربية البعوض القياسية والثقافة اليرقات13.
    1. ضع طبق المعجون على خشبة مسرح المجهر تشريح ونقل اليرقات على لوحة المعجون.
      ملاحظة: عند نقل اليرقات للتشريح الأولي ، من المفيد نقل ~ 10 يرقات إلى الشريحة في وقت واحد باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.
  2. ضع قطرة من محلول التشريح (1:3 EtOH: H2O) على طبق المعجون ، منفصلة عن اليرقات العشر.
  3. استخدم ماصة نقل بلاستيكية أو ماصة زجاجية يمكن التخلص منها لوضع يرقة L4 واحدة في قطرة EtOH بنسبة 25٪.
  4. خذ ملقط (# 5) ، واحد في كل يد ، ومع اليد غير المهيمنة ، أمسك رأس اليرقة. باستخدام اليد المهيمنة ، فهم اليرقة مع ملقط أسفل الرأس وسحب بلطف مع الحد الأدنى من القوة المستمرة ، بحيث ينفصل الرأس عن بقية الجسم وتظل الغدد متصلة بالرأس. تجاهل جزء الجسم من جثة اليرقة.
    ملاحظة: عند تشريح، تعيين منشفة ورقية في مكان قريب لجمع جثث اليرقات.
  5. جمع الرأس / الغدد في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق. استخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني ل~ 40 تشريح الغدد مع رؤوسهم المرفقة. انتظر رؤوس / SGs إلى بالوعة إلى أسفل المخزن المؤقت.

3. تثبيت لتلطيخ الأجسام المضادة (الشكل 1B)

  1. استنزاف برنامج تلفزيوني بدءا من الجزء العلوي من أنبوب الطرد الدقيق باستخدام ماصة نقل الزجاج، وتجنب أنسجة البعوض لزجة وإزالة أكبر قدر ممكن من حل برنامج تلفزيوني دون الإضرار الأنسجة. استبدال الحل مع 800 ميكرولتر من خليط 3:1 من الميثانول إلى حمض الخليك الجليدي. ضع الأنبوب عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (موصى به من 12 إلى 24 ساعة؛ يفضل 19 ساعة).
  2. في اليوم التالي، واستنزاف الحل واستبداله مع 1 مل من الأسيتون الباردة 100٪. ترك لمدة 90 s.
  3. إزالة الأسيتون وشطف الأنسجة بلطف ثلاث مرات مع 1 مل من 1x PBS في كل مرة.
    ملاحظة: يجب أن تطفو العينات ببطء مع التدفق، ثم تقع مرة أخرى إلى أسفل الأنبوب بحلول الوقت الذي تكتمل فيه كل إضافة برنامج تلفزيوني.

4. التثبيط المناعي (الشكل 1B)

  1. إضافة الأجسام المضادة الأولية (مثل، Rab11) في التخفيف المناسب (1:100) في 200 ميكرولتر من الحجم الإجمالي لبرنامج تلفزيوني 1x. دوامة محتويات أنبوب بلطف مع طرف ماصة. حضانة بين عشية وضحاها في 4 °C.
  2. إزالة الحل الأساسي للأجسام المضادة وغسل ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x (pipetting بلطف الحل داخل وخارج ماصة).
  3. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (أليكس فلور 488 الماعز المضادة الأرنب) في التخفيف المناسب (1:200) في 200 ميكرولتر من الحجم الإجمالي. دوامة محتويات أنبوب بلطف مع طرف ماصة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
  4. إضافة الأصباغ، مثل النيل الأحمر (الدهون، 5 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر) و / أو Hoechst (الحمض النووي، 3 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر)، إلى 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني في هذه المرحلة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة إضافية. غسل بلطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.

5. تصاعد الغدد الملطخة للفحص المجهري (الشكل 1C)

  1. ماصة 200 ميكرولتر من 100٪ الجلسرين على شريحة المجهر.
    ملاحظة: كما الجلسرين لزج, ترك طرف ماصة في السائل حتى تصل إلى حجم المناسبة. لوحظ أي تقلص الأنسجة عند الذهاب مباشرة إلى 100٪ الجلسرين. ومع ذلك, يمكن للباحثين الذهاب من خلال 30٪ و 50٪ يغسل الجلسرين في أنابيب قبل نقل العينات إلى 100٪ الجلسرين.
  2. نقل رؤساء الملون (تصل إلى 20 لكل شريحة) مع الغدد المرفقة (جنبا إلى جنب مع غيرها من الهياكل الداخلية) إلى الشريحة المجهر باستخدام فرشاة ناعمة(الشكل 3A). نشر العينات بحيث يتم توزيعها بالتساوي على طول الشريحة الزجاجية.
    ملاحظة: عند إيداع الغدد على شريحة غطاء مع فرشاة، يمكن استخدام ملقط لتوجيه بلطف SGs بحيث تكون كلها موجهة في نفس الاتجاه.
  3. عرض تحت المجهر تشريح، وفصل رأس اليرقات من الغدد باستخدام اثنين من أزواج من ملقط وسحب بعناية النسيجين في اتجاهين متعاكسين.
    ملاحظة: كما أنه من الصعب عزل تماما SGs، ببساطة إزالة رؤساء، وترك SGs والهياكل الداخلية المرتبطة بها. حتى لو ظلت SGs مرتبطة بأنسجة أخرى ، فمن السهل التعرف عليها عندما تكون ملطخة ب Hoechst وعلامات أخرى (الشكل 3B، C).
  4. إزالة وتجاهل رؤساء وتكرار عملية الفصل لكل SG.
    ملاحظة: عند إزالة الرؤوس، قم بتعيين منشفة ورقية قريبة لجمعها.
  5. ضع بلطف غطاء سميك 1.5 مم على الجزء العلوي (تجنب فقاعات الهواء) وختم مع طلاء الأظافر واضحة.
  6. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في حاوية مقاومة للضوء.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ الشرائح المعدة من الغدد الملطخة في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى ستة أشهر إلى سنة واحدة دون أي تغييرات ملحوظة في الجودة. إذا بدأ الجلسرين في التسرب مع مرور الأشهر ، ارفع بلطف الغطاء وماصة في المزيد من الجلسرين لملء الثقوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الغدد اللعابية سهلة التشريح نسبيا من جميع يرقات المرحلة 4. يمكن تمييز يرقات الذكور والإناث في مرحلة يرقات L4 المتأخرة بشريط أحمر على طول الصدر الظهري للإناث ولكن ليس الذكور(الشكل 2). نلاحظ أيضا أن مورفولوجيا الهوائيات أكثر تفصيلا في الذكور منها في يرقات L4 الأنثوية (الشكل 2) ، على غرار الاختلافات الملاحظة في هذا الهيكل في البعوض البالغ. جنبا إلى جنب مع النمو الكلي الكبير خلال مرحلة L4 ، تشكل الغدد اللعابية أيضا تجويف خلال L412. تكشف الغدد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا من بروتوكول تشريح Drosophila SG وبروتوكول تشريح البعوض البالغ14و15و16. ومع ذلك ، فإن معظم العلامات لم تخترق غشاء الطابق السفلي (البيانات غير المعروضة) عند استخدام طرق تشريح الكبار وتلطيخ SG. وشملت تعديلات بروتوكول الكبار تشريح الغدد في محلول EtOH 25٪، وغسل الغدد مع مزيج من MeOH وحمض الخليك الجليدي، وبعد غسل الأسيتون 90 ق. في بروتوكول الكبار الأصلي، تم تشريح SGs الكبار في 1x PBS14...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

شكر وتقدير

ونود أن نشكر معهد جونز هوبكنز لأبحاث الملاريا على إمكانية الوصول إلى يرقات أنغامبيا وتربية هذه اليرقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  KH2PO4Millipore SigmaP9791
  Na2HPO4 • 2H2OMillipore Sigma71643
  كلوريد الصوديومميليبور سيجماS7653
179124الأسيتونميليبور سيجما
بشعيرات ناعمةطقم فرش الطلاء بالتفاصيل B08LH63D89
زلات الغطاء (22 × 50 مم)VWR48393-195
DAPI (DNA)ThermoFisher ScientificD1306
الكحول الإيثيلي 200 برهانMillipore SigmaEX0276
جيلسون بيتمان P200 ماصةجيلسونP200
حمض الخليك الجليديسيجما ألدريتش695092
ملقط المجوهرات ، دومونت رقم 5ميليبور سيجماF6521
KClميليبور سيجما58221
ميثانولميليبور سيجما1414209
طلاء الأظافرأمازون (سالي هانسن)B08148YH9M
أحمر النيل (الدهون) مناشفThermoFisher ScientificN1142
ULINES-7128
(لصنع لوحة المعجون)الماصة FB0875712
GilsonTips E200ST
ماصة نقل البلاستيكفيشر الأجسام المضادة الأولية S304671
(على سبيل المثال ، Crb ، Rab11) دراساتالتنموية بنك الورم الهجين (DSHB) ؛ Andrew LabMouse anti-Crb (Cq4) أو Rabbit anti-Rab11
الأجسام المضادة الثانوية مع علامات الفلورسنت (على سبيل المثال ، Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)ThermoFisher ScientificA11008
راتنج السيليكون وعامل المعالجة للوحة المعجونDow Chemicals - Ximeter SiliconePMX-200
Slides ، بلوري من طرف واحد لوضع العلاماتVWR   20 × 50 مم48393-195
جنين القمح AgglutininThermoFisher ScientificW834
فرشاة / مناديل ورقية من لوحة بتري نصائح ThermoFisher Scientificالعلمية

المراجع

  1. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
  2. Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
  3. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553(2020).
  4. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  5. Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).
  6. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672(2015).
  7. Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115(1981).
  8. Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
  9. Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).
  10. Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
  11. Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).
  12. Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
  13. Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
  14. Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617(2015).
  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
  17. Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
  18. Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
  19. Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
  20. Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تشريح الغدد اللعابية اليرقات من البعوض الغامبي Anopheles و المناعة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.