هنا ، نصف استخدام مقايسة صفيحة دقيقة جديدة لتمكين التلاعب الميكانيكي بالجزيئات الحيوية أثناء إجراء فحوصات كيميائية حيوية جماعية. يتم تحقيق ذلك باستخدام غطاء صفيحة دقيقة معدل بمغناطيس لإنشاء ملاقط مغناطيسية ثابتة متعددة عبر الصفيحة الدقيقة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصف علم الأحياء الميكانيكي كيف تساهم القوى الفيزيائية والخصائص الميكانيكية للمادة البيولوجية في علم وظائف الأعضاء والمرض. عادة ما تكون هذه الأساليب عبارة عن طرق محدودة أحادية الجزيء ، مما يحد من توافرها. لتلبية هذه الحاجة ، تم تطوير اختبار صفيحة دقيقة تتيح التلاعب الميكانيكي أثناء إجراء فحوصات كيميائية حيوية قياسية. يتم تحقيق ذلك باستخدام مغناطيسات مدمجة في غطاء صفيحة دقيقة لإنشاء ملاقط مغناطيسية متعددة. في هذا الشكل ، تمارس القوة عبر الجزيئات الحيوية المتصلة بالخرز المغناطيسي ، أي ما يعادل الملقط المغناطيسي النموذجي. توضح الدراسة تطبيق هذه الأداة مع المقايسات القائمة على FRET لمراقبة مطابقات البروتين. ومع ذلك ، فإن هذا النهج قابل للتطبيق على نطاق واسع على الأنظمة البيولوجية المختلفة التي تتراوح من قياس النشاط الأنزيمي إلى تنشيط مسارات الإشارات في الخلايا الحية.
المقدمة
يركز علم الأحياء الميكانيكي على فهم كيف ينظم انتشار القوى الفيزيائية داخل الخلايا وبينها النشاط الخلوي1،2 وكيف يرتبط ذلك بتنظيم وديناميكيات كل من البروتينات والخلايا.
كشفت قياسات قوة الجزيء الواحد عن كيفية استخدام القوة في الأنظمة البيولوجية ، من البروتينات المفردة إلى الخلايا والأنسجة الكاملة3،4،5،6،7. تتطلب هذه التجارب الصعبة معدات متخصصة وخبرة تقنية. على العكس من ذلك ، يمكن إجراء فحوصا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم العثور على عينة من البروتينات المطلوبة لهذه التجربة وقائمة الكواشف في جدول المواد. يجب إنتاج بروتينات مكافئة لنظام دراسة المستخدم لقياس تغيرات التشكل.
غطاء مغناطيسي مطبوع 1. 3D
- صمم غطاء صفيحة دقيقة لإيواء المغناطيس داخل صفيحة دقيقة 24 بئرا. يمكن تنزيل مثال لملف CAD من GitHub12. القياسات موضحة في الشكل 1.
ملاحظة: يمكن تغيير ارتفاع قاعدة التمثال لتغيير المسافة بين المغناطيس والسطح لتغيير القوة المطبقة. بالإضافة إلى ذلك ، تعتمد القوة النهائية التي تمارس على الجسيم على حجم الجسيمات والفجوة بين زوج المغناطيس. معادلات لحساب القوة المطبقة لجسي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 2 مثالا على قياس المسح الضوئي جيدا حيث تم تسجيل شدة التألق ل GFP على فترات 1 مم عبر بئر الصفيحة الدقيقة. يتم إجراء قياسات التألق النموذجية في الموضع المركزي لبئر الصفيحة الدقيقة (الموضع 8,8 في الشكل 2) ؛ لذلك ، من المهم أن يكون هناك بروتين مرتبط في هذا الموقع. كما هو موضح في الشكل 2 ، تكون الشدة أعلى في وسط البئر داخل دائرة نصف قطرها بضعة ملليمترات. عادة ما يكون الشلل أفضل بعيدا عن حواف البئر ، وربما يرجع ذلك إلى ارتباط ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتيح هذا النهج تطبيق القياسات القائمة على القوة بسهولة في صفيحة دقيقة باستخدام قارئات الألواح الفلورية. الأهم من ذلك ، يفترض تنسيق الفحص هذا وجود بروتين وظيفي عندما يكون مرتبطا بسطح. لذلك ، هناك حاجة إلى معرفة مسبقة قبل الشروع في هذه القياسات للتأكد من وجود نشاط بروتيني. من المفيد أيضا التأكد من تحسين ارتباط الجزيئات بالخرز المغناطيسي والسطح لكل نظام.
يمكن تعديل هذا المفهوم ليعمل عبر جميع أنواع الصفائح الدقيقة. ومع ذلك ، يجب تكييف اختيار المغناطيس مع الصفائح .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.
شكر وتقدير
نشكر أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (A26206) ، و MRC (MR / M020606 / 1) ، والجمعية الملكية (RG150801) على التمويل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 24 بئر صفيحة زجاجية قاع | Cellvis | P24-1.5H-N | تتوفر مصادر متعددة. ما لم تكن هناك حاجة ، فمن الأفضل تجنب الأسطح المعالجة ونستخدم زجاج التصوير N1.5. |
| الأجسام المضادة لطلب تقديم العروض | Abcam | ab290 | تتوفر مصادر متعددة ولكن يجب التأكد من وجود الحد الأدنى من التفاعل مع GFP. |
| مقعد أعلى المجهر | الخفيف Optika | IM-3 | |
| مقعد أعلى الدوار | كول بالمر ستيوارت | SB3 | |
| Biotin-BSA | Sigma Aldrich | A8549 | |
| CAD البرمجيات - Sketch Up Educator | Sketch Up | يمكن استخدام برامج CAD البديلة. يجب على المستخدمين التأكد من أن تنسيقات الملفات متوافقة مع طابعتهم ثلاثية الأبعاد. | |
| Dynabeads Protein A | فيشر Scientific | 10746713 | 2.8 & micro; م الخرز المغناطيسي مع البروتين المؤتلف لاصق |
| التلامس | EVO-STIK | ||
| MagnaRack رف الفصل المغناطيسي | ThermoFisher Scientific | CS15000 | المعزل |
| المغناطيسي NaCl | فيشر Scientific | 10316943 | |
| نيوديميوم N42 5 مم مكعب مغناطيس | Supermagnete | W-05-N | |
| قارئ لوحة - ClarioStar | BMG Labtech | يمكن استخدام جميع أنظمة قارئ الألواح حيث تكون القياسات ممكنة من أسفل الصفيحة الدقيقة. يستثني غطاء المغناطيس القياسات القياسية من الأعلى | |
| Streptavidin | Sigma Aldrich | 189730 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 10142400 | |
| Ultimaker PETG Filament | Ultimaker | ||
| Ultimaker S3 - طابعة ثلاثية الأبعاد | Ultimaker |
المراجع
- Jansen, K. A., et al. A guide to mechanobiology: Where biology and physics meet. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, 3043-3052 (2015).
- Dos Santos, A., Toseland, C. P. Regulation of nuclear mechanics and the impact on dna damage. Int....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
