مقالة منهجية

ملاقط مغناطيسية في شكل صفيحة دقيقة

1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62994

⸱

فبراير 9, 2022

 , 
1Department of Oncology and Metabolism, University of Sheffield

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف استخدام مقايسة صفيحة دقيقة جديدة لتمكين التلاعب الميكانيكي بالجزيئات الحيوية أثناء إجراء فحوصات كيميائية حيوية جماعية. يتم تحقيق ذلك باستخدام غطاء صفيحة دقيقة معدل بمغناطيس لإنشاء ملاقط مغناطيسية ثابتة متعددة عبر الصفيحة الدقيقة.

الملخص

يصف علم الأحياء الميكانيكي كيف تساهم القوى الفيزيائية والخصائص الميكانيكية للمادة البيولوجية في علم وظائف الأعضاء والمرض. عادة ما تكون هذه الأساليب عبارة عن طرق محدودة أحادية الجزيء ، مما يحد من توافرها. لتلبية هذه الحاجة ، تم تطوير اختبار صفيحة دقيقة تتيح التلاعب الميكانيكي أثناء إجراء فحوصات كيميائية حيوية قياسية. يتم تحقيق ذلك باستخدام مغناطيسات مدمجة في غطاء صفيحة دقيقة لإنشاء ملاقط مغناطيسية متعددة. في هذا الشكل ، تمارس القوة عبر الجزيئات الحيوية المتصلة بالخرز المغناطيسي ، أي ما يعادل الملقط المغناطيسي النموذجي. توضح الدراسة تطبيق هذه الأداة مع المقايسات القائمة على FRET لمراقبة مطابقات البروتين. ومع ذلك ، فإن هذا النهج قابل للتطبيق على نطاق واسع على الأنظمة البيولوجية المختلفة التي تتراوح من قياس النشاط الأنزيمي إلى تنشيط مسارات الإشارات في الخلايا الحية.

المقدمة

يركز علم الأحياء الميكانيكي على فهم كيف ينظم انتشار القوى الفيزيائية داخل الخلايا وبينها النشاط الخلوي1،2 وكيف يرتبط ذلك بتنظيم وديناميكيات كل من البروتينات والخلايا.

كشفت قياسات قوة الجزيء الواحد عن كيفية استخدام القوة في الأنظمة البيولوجية ، من البروتينات المفردة إلى الخلايا والأنسجة الكاملة3،4،5،6،7. تتطلب هذه التجارب الصعبة معدات متخصصة وخبرة تقنية. على العكس من ذلك ، يمكن إجراء فحوصات كيميائية حيوية قياسية بإنتاجية أعلى في المعدات التجارية المتاحة بسهولة.

هنا ، تصف الدراسة اختبار علم الأحياء الميكانيكي الذي يتيح إجراء التلاعب القائم على الملقط المغناطيسي والمقايسات الكيميائية الحيوية معا8. يتم وضع المغناطيس على غطاء صفيحة دقيقة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1A-D) ، مما يتيح استخدام قارئات الألواح التجارية للمقايسات. يتم تطبيق القوة عبر الجزيء الحيوي المعني عن طريق اقتران الجزيء بالجسيمات المغناطيسية. ثم يمارس المغناطيس توترا عبر الجزيء. يؤدي تغيير المسافة بين الجسيمات والمغناطيس إلى ضبط القوة المبذولة عبر الجزيء الحيوي (الشكل 1E).

نحن نمثل استخدام هذا الاختبار باستخدام المحرك الجزيئي القائم على الأكتين ، Myosin VI. يتم تنظيم Myosin VI عن طريق الطي الخلفي داخل الجزيئات9. ثبت أن الميوسين السادس موجود في حالة تثبيط تلقائي ، حيث يؤدي ارتباط البروتينات الشريكة ، مثل NDP52 ، إلى ظهور الميوسين السادس10،11. لإجراء هذه الفحوصات ، سنستخدم بنية مزدوجة التسمية لمجال ذيل الميوسين VI مع Gfp الطرفي N و C-Terminal RFP حيث يولد الطي الخلفي للبروتين نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) بين GFP و RFP. تحمل المحطة N أيضا علامة البيوتينيل لتثبيت البروتين على السطح. نستخدم هذا الاختبار مع قياسات FRET لإظهار كيف يمكن للقوة أن تؤثر على طي الميوسين السادس للخلف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم العثور على عينة من البروتينات المطلوبة لهذه التجربة وقائمة الكواشف في جدول المواد. يجب إنتاج بروتينات مكافئة لنظام دراسة المستخدم لقياس تغيرات التشكل.

غطاء مغناطيسي مطبوع 1. 3D

  1. صمم غطاء صفيحة دقيقة لإيواء المغناطيس داخل صفيحة دقيقة 24 بئرا. يمكن تنزيل مثال لملف CAD من GitHub12. القياسات موضحة في الشكل 1.
    ملاحظة: يمكن تغيير ارتفاع قاعدة التمثال لتغيير المسافة بين المغناطيس والسطح لتغيير القوة المطبقة. بالإضافة إلى ذلك ، تعتمد القوة النهائية التي تمارس على الجسيم على حجم الجسيمات والفجوة بين زوج المغناطيس. معادلات لحساب القوة المطبقة لجسيمات 1 ميكرومتر و 2.8 ميكرومتر عند فجوات 0.5 مم و 1 مم و 2 مم مذكورة في دوس سانتوس وآخرون8. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا مع جسيمات 2.8 ميكرومتر وفجوة 2 مم ، استخدم المعادلة 1.
    المعادلة 1: figure-protocol-1
  2. طباعة ثلاثية الأبعاد غطاء صفيحة دقيقة باستخدام البولي إيثيلين تيريفثاليت جلايكول (PETG) على نظام طابعة ثلاثية الأبعاد.
    ملاحظة: استخدم طابعة بدقة طبقة تبلغ 0.02 مم لتمكين الدقة وقابلية التكرار. تمت مناقشة تأثير دقة الطابعة في Dos Santos et al.8.
  3. قم بإرفاق أزواج من مغناطيس النيوديميوم N42 المكعب مقاس 5 مم باستخدام مادة لاصقة على الركائز مع توجيه الأقطاب المغناطيسية لإنشاء المجال الموجه نحو الجزء السفلي من الصفيحة الدقيقة.
  4. اترك وضعا واحدا على الأقل فارغا ليكون بمثابة عنصر تحكم بدون مغناطيس.
  5. يحفظ في وعاء محكم الغلق بحجم كاف لوضع الغطاء وإزالته بسهولة.

2. تعديل سطح الصفيحة الدقيقة

  1. خذ صفيحة زجاجية نظيفة غير معالجة ذات قاع زجاجي 24 بئر.
  2. اغسل الآبار 3x باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل (50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) و 50 ملي كلوريد الصوديوم) في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 200 ميكرولتر من البيوتين BSA (0.2 مجم / مل) في مخزن الغسيل واتركه دون إزعاج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يستخدم البيوتين-BSA لكل من التخميل والمرفق. يمكن استخدام استراتيجيات التخميل وربط السطح الأخرى. للاستخدام والتحسين لأول مرة ، يمكن أن يختلف تركيز البيوتين BSA حتى 1 مجم / مل.
  4. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  5. أضف 200 ميكرولتر من الستربتافيدين (20 ميكروغرام / مل) في مخزن الغسيل واتركه دون إزعاج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: للاستخدام لأول مرة ، يمكن أن يختلف تركيز الستربتافيدين حتى 1 مجم / مل.
  6. قم بإزالة المحلول ثم اغسل الآبار 3x باستخدام محلول الغسيل.
  7. قم بتغطية الآبار ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  8. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. يجب استخدام اللوحات في نفس اليوم.

3. إعداد العينة: تثبيت البروتين

  1. اسمح للصفيحة الدقيقة المعدلة بالسطح بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. اغسل الآبار ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  3. أضف 100 نانومتر من البيوتين-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (بروتين عينة المخزون) واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في مخزن الغسيل.
    ملاحظة: يتم إنتاج هذا المثال من البروتين كما هو موضح من قبل دوس سانتوس وآخرون 8. يمكن أن تختلف أوقات التركيزات والحضانات حسب البروتين.
  4. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  5. قم بإعداد قارئ اللوحة لتسجيل أطياف التألق ل GFP (الإثارة 490 نانومتر والانبعاث 510-600 نانومتر) و RFP (الإثارة 560 نانومتر والانبعاث 580-650 نانومتر) لتأكيد وجود بروتينات الاندماج.
  6. إذا كان هناك نقص في البروتين ، فقم بزيادة التركيز في الخطوة 3.3.
    ملاحظة: يمكن أن يرتبط الارتباط الضعيف بعدم كفاية ارتباط البيوتين BSA و / أو الستربتافيدين ، وبالتالي ، يمكن زيادة الكميات بمقدار 10 أضعاف.
  7. إذا أمكن ، قم بإجراء قياس جيد لتحديد ما إذا كان بروتين الاندماج مرتبطا عبر الصفيحة الدقيقة (الشكل 2).
    ملاحظة: سيسجل هذا القياس شدة التألق في نقاط محددة عبر بئر الصفيحة الدقيقة. سيكشف ما إذا كان البروتين مرتبطا عبر البئر.
  8. تأكد من أن الإشارة موحدة (في حدود 5٪) في وسط البئر حيث يحدث قياس الفحص.

4. إعداد حبة مغناطيسية

  1. دوامة قارورة من 2.8 ميكرومتر حبات مغناطيسية مع البروتين المؤتلف أ (جدول المواد) لمدة 30 ثانية لإعادة تعليق الخرز.
  2. انقل الحجم المقابل ل 1 ملغ من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب 1.5 مل.
  3. ضع الأنبوب في عازل مغناطيسي (جدول المواد) ثم قم بإزالة المادة الطافية.
  4. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من PBS عن طريق سحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل.
  5. ضع الأنبوب في العازل المغناطيسي ثم قم بإزالة المادة الطافية.
  6. كرر خطوة الغسيل 3x.
  7. تمييع 10 ميكروغرام من الجسم المضاد لطلب تقديم العروض في 200 ميكرولتر من PBS.
  8. اعزل الخرزات في المعزل المغناطيسي ثم أعد تعليقها في محلول الجسم المضاد.
  9. قم بالتدوير عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على دوار على طاومة.
  10. ضع الأنبوب في العازل المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية.
  11. اغسل 3x في PBS.
  12. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  13. لتأكيد تجميد الأجسام المضادة على الخرزات ، قم باحتضان الخرزات المحملة بالأجسام المضادة بمحلول >1 ميكرومتر بروتين اندماج RFP.
    ملاحظة: تأكد بصريا مما إذا كان البروتين معزولا بواسطة الخرز.
  14. بدلا من ذلك ، قم بقياس شدة التألق للطافية (الإثارة 560 نانومتر والانبعاث 580-650 نانومتر) لطلب تقديم العروض في مطياف الفلورة.

5. إعداد العينة: مرفق حبة

  1. أضف 10 ميكروغرام من اندماج الأجسام المضادة للحبة المغناطيسية المخفف في مخزن الغسيل (200 ميكرولتر) إلى آبار الصفيحة الدقيقة المرتبطة بالبروتين.
  2. لا تضع الخرز في بئر تحكم واحد للتحقق من تأثير الخرز على إشارة الفلورسنت. قم بإعداد عينة تحكم بدون أجسام مضادة لتحديد أي تفاعلات غير محددة مع الخرز.
  3. احتضان الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  5. إذا كانت متوفرة محليا ، فتحقق من أن الخرزات مرتبطة بالسطح على مجهر المجال الساطع. إذا كان هناك نقص في الخرز ، فقم بزيادة التركيز في الخطوة 5.1 إلى 500 ميكروغرام / مل.

6. الحصول على البيانات

  1. ضع الصفيحة الدقيقة ، بدون غطاء ، في قارئ لوحة الفلورسنت عند 25 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد قارئ اللوحة لتسجيل أطياف التألق ل GFP (الإثارة 490 نانومتر والانبعاث 510-600 نانومتر) و RFP (الإثارة 560 نانومتر والانبعاث 580-650 نانومتر) لتأكيد وجود بروتينات الاندماج.
    ملاحظة: قم بقياس / تسجيل أطياف التألق من خلال الجزء السفلي من الصفيحة الدقيقة لوضع الغطاء في الأعلى. لذلك ، يجب اختيار قارئ دقيق مناسب.
  3. سجل طيف مضان FRET (إثارة 490 نانومتر وانبعاث 510-650 نانومتر) ، أو راقب التألق عند 510 نانومتر و 610 نانومتر مع الإثارة عند 490 نانومتر. يتم إعداد هذا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  4. قم بإزالة الصفيحة الدقيقة من القارئ وأضف الغطاء المغناطيسي.
  5. ارجع إلى قارئ اللوحة واترك العينة لمدة 2 دقيقة.
  6. كرر قياس FRET ، كما في الخطوة 6.3.

7. تحليل البيانات

  1. تصدير البيانات للاستيراد إلى جدول بيانات (على سبيل المثال، Excel).
  2. استخرج البيانات يدويا ل GFP للمتبرع عند 510 نانومتر وطلب تقديم العروض عند 610 نانومتر.
  3. احسب FRET النسبي باستخدام المعادلة 2 لكل شرط.
    المعادلة 2: figure-protocol-2
    أ: شدة المستقبل (RFP 610 نانومتر) ، د: شدة المتبرع (GFP 510 نانومتر).
    ملاحظة: استخدم طلب تقديم العروض المؤتلف في ظل نفس ظروف الإثارة والانبعاث للتحكم في إثارة الخلفية للمتقبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 2 مثالا على قياس المسح الضوئي جيدا حيث تم تسجيل شدة التألق ل GFP على فترات 1 مم عبر بئر الصفيحة الدقيقة. يتم إجراء قياسات التألق النموذجية في الموضع المركزي لبئر الصفيحة الدقيقة (الموضع 8,8 في الشكل 2) ؛ لذلك ، من المهم أن يكون هناك بروتين مرتبط في هذا الموقع. كما هو موضح في الشكل 2 ، تكون الشدة أعلى في وسط البئر داخل دائرة نصف قطرها بضعة ملليمترات. عادة ما يكون الشلل أفضل بعيدا عن حواف البئر ، وربما يرجع ذلك إلى ارتباط ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتيح هذا النهج تطبيق القياسات القائمة على القوة بسهولة في صفيحة دقيقة باستخدام قارئات الألواح الفلورية. الأهم من ذلك ، يفترض تنسيق الفحص هذا وجود بروتين وظيفي عندما يكون مرتبطا بسطح. لذلك ، هناك حاجة إلى معرفة مسبقة قبل الشروع في هذه القياسات للتأكد من وجود نشاط بروتيني. من المفيد أيضا التأكد من تحسين ارتباط الجزيئات بالخرز المغناطيسي والسطح لكل نظام.

يمكن تعديل هذا المفهوم ليعمل عبر جميع أنواع الصفائح الدقيقة. ومع ذلك ، يجب تكييف اختيار المغناطيس مع الصفائح ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

نشكر أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (A26206) ، و MRC (MR / M020606 / 1) ، والجمعية الملكية (RG150801) على التمويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 بئر صفيحة زجاجية قاعCellvisP24-1.5H-Nتتوفر مصادر متعددة. ما لم تكن هناك حاجة ، فمن الأفضل تجنب الأسطح المعالجة ونستخدم زجاج التصوير N1.5.
الأجسام المضادة لطلب تقديم العروضAbcamab290تتوفر مصادر متعددة ولكن يجب التأكد من وجود الحد الأدنى من التفاعل مع GFP.
مقعد أعلى المجهرالخفيف OptikaIM-3
مقعد أعلى الدواركول بالمر ستيوارتSB3
Biotin-BSASigma AldrichA8549
CAD البرمجيات - Sketch Up EducatorSketch Upيمكن استخدام برامج CAD البديلة. يجب على المستخدمين التأكد من أن تنسيقات الملفات متوافقة مع طابعتهم ثلاثية الأبعاد.
Dynabeads Protein Aفيشر Scientific107467132.8 & micro; م الخرز المغناطيسي مع البروتين المؤتلف لاصق
التلامسEVO-STIK
MagnaRack رف الفصل المغناطيسيThermoFisher ScientificCS15000المعزل
المغناطيسي NaClفيشر Scientific10316943
نيوديميوم N42 5 مم مكعب مغناطيسSupermagneteW-05-N
قارئ لوحة - ClarioStarBMG Labtechيمكن استخدام جميع أنظمة قارئ الألواح حيث تكون القياسات ممكنة من أسفل الصفيحة الدقيقة. يستثني غطاء المغناطيس القياسات القياسية من الأعلى
StreptavidinSigma Aldrich189730
Tris-HClFisher Scientific10142400
Ultimaker PETG FilamentUltimaker
Ultimaker S3 - طابعة ثلاثية الأبعادUltimaker

المراجع

  1. Jansen, K. A., et al. A guide to mechanobiology: Where biology and physics meet. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, 3043-3052 (2015).
  2. Dos Santos, A., Toseland, C. P. Regulation of nuclear mechanics and the impact on dna damage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3178(2021).
  3. Dos Santos, A., et al. DNA damage alters nuclear mechanics through chromatin reorganization. Nucleic Acids Research. 49 (1), 340-353 (2020).
  4. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171, 1397-1410 (2017).
  5. Lherbette, M., et al. Atomic force microscopy micro-rheology reveals large structural inhomogeneities in single cell-nuclei. Scientific Reports. 7, 8116(2017).
  6. Seo, D., et al. A mechanogenetic toolkit for interrogating cell signaling in space and time. Cell. 165, 1507-1518 (2016).
  7. Yao, M., et al. The mechanical response of talin. Nature Communications. 7, 11966(2016).
  8. Dos Santos, A., Fili, N., Pearson, D. S., Hari-Gupta, Y., Toseland, C. P. High-throughput mechanobiology: Force modulation of ensemble biochemical and cell-based assays. Biophysical Journal. 120, 631-641 (2021).
  9. Fili, N., Toseland, C. P. Unconventional myosins: How regulation meets function. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 67(2019).
  10. Fili, N., et al. Competition between two high- and low-affinity protein-binding sites in myosin VI controls its cellular function. Journal of Biological Chemistry. 295, 337-347 (2020).
  11. Fili, N., et al. NDP52 activates nuclear myosin VI to enhance RNA polymerase II transcription. Nature Communications. 8, 1871(2017).
  12. MagPlate at GitHub. , Available from: https://github.com/cptoseland/MagPlate (2021).
  13. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6, 85-95 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FRET
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة