يقدم هذا البروتوكول مقايسة امتصاص الأحماض الأمينية المشعة ، وهو مفيد لتقييم استهلاك الأحماض الأمينية إما في الخلايا الأولية أو في العظام المعزولة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعتمد نمو العظام والتوازن على تمايز ونشاط الخلايا العظمية المكونة للعظام. يتميز تمايز Osteoblast بالتتابع عن طريق الانتشار يليه تخليق البروتين وفي النهاية إفراز مصفوفة العظام. يتطلب الانتشار وتخليق البروتين إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. على الرغم من ذلك ، لا يعرف سوى القليل جدا عن استهلاك الأحماض الأمينية في الخلايا العظمية. هنا نصف بروتوكولا حساسا للغاية تم تصميمه لقياس استهلاك الأحماض الأمينية باستخدام الأحماض الأمينية المشعة. تم تحسين هذه الطريقة لتحديد التغيرات في امتصاص الأحماض الأمينية المرتبطة بانتشار الخلايا العظمية العظمية أو التمايز أو علاجات الأدوية أو عوامل النمو أو التلاعب الجيني المختلف. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة بالتبادل لتحديد استهلاك الأحماض الأمينية في خطوط الخلايا المستزرعة أو الخلايا الأولية في المختبر أو في أعمدة العظام المعزولة خارج الجسم الحي. أخيرا ، يمكن تكييف طريقتنا بسهولة لقياس نقل أي من الأحماض الأمينية وكذلك الجلوكوز والمواد المغذية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية.
المقدمة
الأحماض الأمينية هي مركبات عضوية تحتوي على مجموعات وظيفية أمينية (-NH2) وكربوكسيل (-COOH) مع سلسلة جانبية متغيرة خاصة بكل حمض أميني. بشكل عام ، تعرف الأحماض الأمينية بأنها المكون الأساسي للبروتين. في الآونة الأخيرة ، تم توضيح الاستخدامات الجديدة ووظائف الأحماض الأمينية. على سبيل المثال ، يمكن استقلاب الأحماض الأمينية الفردية لتوليد مستقلبات وسيطة تساهم في الطاقة الحيوية ، أو تعمل كعوامل مساعدة إنزيمية ، أو تنظم أنواع الأكسجين التفاعلية أو تستخدم لتوليف الأحماض الأمينية الأخرى1،2،3،4،5،6
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع إجراءات الفئران الموضحة هنا من قبل لجان الدراسات الحيوانية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس. تمت الموافقة على بروتوكول الإشعاع من قبل اللجنة الاستشارية للسلامة الإشعاعية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس.
1. امتصاص الأحماض الأمينية في الخلايا (البروتوكول الأول)
- لوحة 5 × 104 خلايا ST2 في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 12 بئرا. خلايا صفيحية في α-MEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / mL البنسلين و 0.1 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (القلم / العقدية). قم بلوحة آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلايا لكل شرط للتطبيع في الخطوة 1.12. احتضان الخلايا في حاضنة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم تنظيم نقل الأحماض الأمينية من قبل العديد من ناقلات الأحماض الأمينية المرتبطة بالأغشية والتي تم تصنيفها في أنظمة نقل متميزة بناء على العديد من الخصائص ، بما في ذلك خصوصية الركيزة ، والحركيات ، وكذلك الاعتماد على الأيونات والأس الهيدروجيني25. على سبيل المثال ، يمكن التوسط في امتصاص الجلوتامين بواسطة أنظمة النقل المعتمدة على Na + و ASC و γ + L و N أو النظام L المستقل عن Na +. تتميز الأنظمة المعتمدة على Na + بالقدرة على استبدال Li + ب Na + (النظام N.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا سريعا وحساسا لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية استجابة لمختلف التباديل التجريبية إما في المختبر أو خارج الجسم الحي. بالمقارنة مع المجموعات المتاحة تجاريا (على سبيل المثال ، مجموعة تحديد الجلوتامين والغلوتامات) ، فإن هذه الطريقة أكثر حساسية وأسرع وأقل كثافة في العمالة16،17،25. في بروتوكولنا ، نقوم بتقييم الامتصاص في المخزن المؤقت Krebs Ringers HEPES. نحن نستخدم هذه الوسائط لأنها ترك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.
شكر وتقدير
يتم دعم مختبر كارنر من خلال منح المعهد الوطني للصحة R01 (AR076325 و AR071967) إلى C.M.K.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ تريبسين | جيبكو | 25200 | |
| 12 بئر لوحة | Corning | 3513 | |
| 1 مل حقنة | BD الدقة | 309628 | |
| 30G إبرة | BD الدقة | 305106 | |
| الأرجينين أحادي هيدروكلوريد L- [2،3،4-3H]- ، 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 عداد التلألؤ | |||
| كلوريد الكالسيوم | سيجما | C1016 | |
| كلوريد الكولين | سيجما | C7077 | |
| D- (+) - محلول الجلوكوز | سيجما | G8769 | |
| أداة | الملقط ، مقص ، سكيبلز | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | سيجما | E9884 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630 | |
| L- [3،4-3H (N)] -Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| قوارير التلمع السائل | Sigma | Z190535 | |
| محلول كلوريد الليثيوم ، 8M | Sigma | L7026 | |
| كلوريد المغنيسيوم | Sigma | M8266 | |
| MEM & alpha ؛ | أنبوب جيبكو | 12561 | |
| جهاز طرد مركزي دقيق ، 15 مل | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Sigma | P3911 | |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma | S6014 | |
| كلوريد الصوديوم | Sigma | S9888 | |
| Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | سيجما | 436143 | |
| سونيكاتور | سونيك آند المواد | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (محلول الوميض) | PerkinElmer | 6013329 | |
| & alpha ؛ - (Methylamino) حمض الأيزوبوتيريك | Sigma | M2383 |
المراجع
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
