يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس التنفس عالي الدقة لتقييم الطاقة الحيوية في الخلايا والأنسجة باستخدام مقاييس التنفس القائمة على الغرفة والصفائح

5.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63000

⸱

أكتوبر 26, 2021

 , 
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

في هذه المقالة

ملخص

أصبح تقييم الفسفرة التأكسدية باستخدام مقاييس التنفس عالية الدقة جزءا لا يتجزأ من التحليل الوظيفي للميتوكوندريا واستقلاب الطاقة الخلوية. هنا ، نقدم بروتوكولات لتحليل استقلاب الطاقة الخلوية باستخدام مقاييس التنفس عالية الدقة القائمة على الغرفة والصفائح الدقيقة ونناقش الفوائد الرئيسية لكل جهاز.

الملخص

يسمح قياس التنفس عالي الدقة (HRR) بمراقبة الفسفرة التأكسدية في الوقت الفعلي لتحليل حالات الطاقة الخلوية الفردية وتقييم مجمعات الجهاز التنفسي باستخدام بروتوكولات المعايرة بالتحليل الحجمي المتنوعة بين الركيزة وفك الاقتران (SUIT). هنا ، يتم توضيح استخدام جهازين لقياس التنفس عالي الدقة ، ويتم تقديم مجموعة أساسية من البروتوكولات المطبقة لتحليل الخلايا المستزرعة وألياف الهيكل العظمي وعضلة القلب والأنسجة الرخوة مثل الدماغ والكبد. يتم توفير بروتوكولات للخلايا والأنسجة المستزرعة لمقياس التنفس القائم على الغرفة والخلايا المستزرعة لمقياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة ، وكلاهما يشمل بروتوكولات التنفس القياسية. لأغراض المقارنة، يتم استخدام خلايا HEK293 المصممة من قبل كريسبر والتي تعاني من نقص في ترجمة الميتوكوندريا مما يسبب نقصا في الجهاز التنفسي المتعدد مع كلا الجهازين لإثبات العيوب الخلوية في التنفس. يسمح كل من مقياس التنفس بقياس شامل للتنفس الخلوي مع مزاياه التقنية وملاءمته اعتمادا على سؤال البحث والنموذج قيد الدراسة.

المقدمة

تفي الميتوكوندريا بتوفير الطاقة الرئيسي وهي عضية مجزأة تساهم في عمليات الطاقة الحيوية والتمثيل الغذائي الخلوية الأساسية مثل ابتنائية النيوكليوتيدات والدهون والأحماض الأمينية والتكوين الحيوي لعنقود الحديد والكبريت وتتورط في إشارات مثل موت الخلايا المتحكم فيه1،2،3 . تساهم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا من خلال الفسفرة التأكسدية في جميع العمليات الخلوية داخل الخلية تقريبا ، وبالتالي ، ترتبط اختلالات الميتوكوندريا ذات الأصل الأولي أو الثانوي بمجموعة واسعة من الحالات المرضية 4,5. خلل الميتوكوندريا لا ينطوي فقط على تغييرات في البنية أو كثافة الميتوكوندريا ولكن أيضا في جودة وتنظيم الجهاز التنفسي6. يشمل هذا العنصر النوعي التحكم في الركيزة ، وخصائص الاقتران ، والتعديلات اللاحقة للترجمة ، وديناميكيات cristae ، والمجمعات الفائقة التنفسية 7,8. لذلك ، فإن التحليل الدقيق للطاقة الحيوية الميتوكوندريا للنهج التجريبية والتشخيصية لتقييم استقلاب الطاقة للخلية مهم في الصحة والمرض.

الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) هي سلسلة من التفاعلات داخل الجهاز التنفسي أو نظام نقل الإلكترون (ETS) لتوليد الطاقة الخلوية من خلال الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)9. تولد الخطوة متعددة الأنزيمات لتسخير الطاقة من تدفق الإلكترون عبر المجمعين الأول والثاني إلى المركب الرابع تدرج بروتون كهروكيميائي عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، يستخدم لاحقا لفسفرة ثنائي فوسفات الأدينوسين (ADP) إلى ATP عبر المركب V (F1FO ATP SYNTHASE) (الشكل 1A).

أولا ، يتم توليد حاملات ثنائية الإلكترونات خلال دورة ثلاثي الكربوكسيل (TCA) ، تحلل السكر ، وأكسدة البيروفات: نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) وثنائي هيدروفلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FADH2). يتأكسد NADH في المركب I (نازعة هيدروجيناز NADH) ، حيث يتم نقل إلكترونين إلى الإنزيم المساعد Q (يتم تقليل الكينون إلى الكينول) ، بينما يتم ضخ البروتونات في الفضاء بين الأغشية (IMS). ثانيا ، المركب II (نازعة هيدروجيناز سكسينات) يؤكسد FADH2 ويغذي الإلكترونات إلى الإنزيم المساعد Q دون ضخ البروتونات. ثالثا ، في المركب الثالث (السيتوكروم ج أوكسيدوريدوكتاز) ، يتم نقل الإلكترونات من الإنزيم المساعد Q إلى السيتوكروم c بينما يتم ضخ البروتونات في IMS. رابعا ، ينقل السيتوكروم c الإلكترونات إلى المركب IV (Cytochrome c oxidase) ، وهو المركب الأخير لضخ البروتونات ، وحيث يعمل الأكسجين كمستقبل للإلكترون لاستيعاب البروتونات ، مما يشكل الماء في النهاية. هذا هو الأكسجين الذي تستهلكه الميتوكوندريا والذي يمكن قياسه بواسطة oxygraph. وأخيرا ، يتم استخدام البروتونات المتولدة من المركب I والمركب III و IV المعقد لتدوير V المعقد ، وبالتالي توليد ATP9.

الأهم من ذلك ، أن نقل الإلكترون لا يحدث فقط بطريقة خطية ، ويشار إليه بخلاف ذلك باسم سلسلة نقل الإلكترون. بدلا من ذلك ، يمكن نقل الإلكترونات إلى تجمع الإنزيم المساعد Q من خلال مسارات تنفسية متعددة وتسهيل تدفق الإلكترونات المتقاربة. على سبيل المثال ، يمكن أن تدخل ركائز NADH و Uccinate عبر المركب I و II المعقد ، على التوالي. يمكن التبرع بالإلكترونات الناتجة عن أكسدة الأحماض الدهنية عبر مركب فلافوبروتين الناقل للإلكترون. والواقع أن التحليل الشامل ل OXPHOS يتطلب نهجا شاملا مع ركائز الوقود المناسبة (الشكل 1 ألف).

figure-introduction-1
الشكل 1: الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا وبروتوكولات الركيزة والمثبطات المحددة. (أ) الميتوكوندريا ومخطط نظام نقل الإلكترون (CI-CIV) والميتوكوندريا F1F0 ATP synthase (CV). جميع الهياكل من PDB. الأرقام تصور فقط الركائز والمثبطات الموصوفة في هذه الدراسة). (ب) تتبع عينة من تدفق الأكسجين في خلايا HEK293 سليمة باستخدام بروتوكول قياسي في جهاز mHRR. (ج) تتبع عينة من تدفق الأكسجين في خلايا HEK293 سليمة باستخدام بروتوكول قياسي في جهاز cHRR. (د) تتبع عينة من تدفق الأكسجين في الخلايا الليفية البشرية المتخلل من متبرع سليم مع بروتوكول SUIT المعني. الاختصارات: 1 = التنفس الروتيني للخلايا السليمة. 2 = الدولة 2; 3 = الدولة 3 (طاء)؛ 4 = الحالة 3 (I) مع cytC ؛ 5 = الدولة 3 (I+II)؛ 6 = تسرب (OM); 7 = قدرة ETS; 8 = S (ROT) ؛ 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = روتينون, AM = أنتيمايسين, ATP = أدينوسين ثلاثي الفوسفات, Az = أزيد, OM = أوليغومايسين, FCCP = سيانيد الكربونيل p-trifluoro-methoxyphenyl-hydrazone; Asc = أسكوربات، TMPD = N,N,N′,N′-رباعي ميثيل-P-فينيلينديامين، سوك = سكسينات، M = مالات، P = بيروفات، ADP = ثنائي فوسفات الأدينوزين، NAD = نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد، IMS = الفضاء بين الأغشية، FAD = فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أصبح تحليل قدرة الميتوكوندريا OXPHOS باستخدام HRR طريقة كيميائية حيوية مفيدة ذات قيمة تشخيصية ليس فقط لعيوب الميتوكوندريا الأولية 10,11 ولكن تمتد إلى جميع مجالات البيولوجيا الأخرى مثل السرطان والشيخوخة12. يسمح HRR بتحديد التنفس الخلوي عن طريق تحليل قدرة OXPHOS للميتوكوندريا ، والتي تعكس بشكل مباشر نقص مجمع الجهاز التنفسي الفردي أو المشترك للميتوكوندريا ، ويرتبط بشكل غير مباشر بالخلل الوظيفي الخلوي وتغيير استقلاب الطاقة9. من الناحية المنهجية ، يتم إجراء قياسات التنفس باستخدام الخلايا أو الأنسجة أو الميتوكوندريا المعزولة11،13،14 ، مع المواد المجمدة المناسبة جزئيا فقط15،16. يظهر أن الأنسجة المجمدة لديها ETS سليمة مع الحفاظ على استقرار فائق التعقيد15. وبالتالي ، على عكس وسيطات TCA التقليدية ، يتم تغذية الركائز المعنية مباشرة في ETS. ومع ذلك ، يتم فقدان الاقتران بين ETS و ATP التوليف حيث يتم اختراق سلامة الغشاء من خلال تلف التجميد (تكوين بلورة الجليد).

عادة ما تتم تجارب التنفس عند درجة حرارة فسيولوجية تبلغ 37 درجة مئوية للحرارة الداخلية في الخلايا أو الأنسجة غير المتخلل أو المتغلغل. في حين أن الأول يأخذ في الاعتبار السياق الأيضي الخلوي ، فإن الأخير يوفر المساهمة النشطة لمجمعات OXPHOS الفردية و ATPase من خلال إضافة ركائز محددة (ومثبطات). أدى تسلسل وتباين الركائز والمثبطات إلى تطوير مجموعة متنوعة من بروتوكولات SUIT17 والمقايسات 18 لمعالجة مختلف المسائل العلمية لوظيفة OXPHOS (تمت مراجعتها تحت12). يقيم البروتوكول الأساسي للتنفس الخلوي أربع حالات مختلفة: أ) التنفس الروتيني - التنفس في وسائط التنفس المعنية دون أي إضافة للركائز أو المثبطات التي تستهلك ركائز داخلية المنشأ. يمكن أن تكشف هذه الحالة عن عيوب OXPHOS العامة أو عيوب التنفس الناجمة عن الثانوية ، على سبيل المثال ، بسبب تغيير ملامح الأيض. بعد ذلك ، تكشف إضافة مثبط ATPase oligomycin عن نفاذية غشاء الميتوكوندريا الداخلي للبروتونات ، والتي تعرف بأنها ii) تنفس التسرب. يسمح المعايرة اللاحقة للبروتونوفور مثل سيانيد الكربونيل غير المقترن p-trifluoro-methoxyphenyl-hydrazone (FCCP) بتحديد الحالة التي تكون فيها قدرة ETS قصوى في وضع دائرة البروتون المفتوحة عبر الغشاء ، والتي تعرف بأنها iii) التنفس غير المقترن. الأهم من ذلك ، يمكن أن تحدث حالة غير مقترنة أيضا عن طريق التدخلات التجريبية من خلال الأضرار الميكانيكية المفرطة لأغشية الميتوكوندريا. على العكس من ذلك ، تشير الحالة غير المقترنة إلى فك الارتباط التنفسي بواسطة آلية جوهرية يتم التحكم فيها من الناحية الفسيولوجية. وأخيرا، فإن التثبيط الكامل ل ETS بإضافة مضاد المايسين المثبط الثالث المعقد ومثبط الروتينون المعقد I يحدد استهلاك الأكسجين المتبقي (ROX) من العمليات غير المستهلكة للأكسجين الميتوكوندريا (الشكل 1A-C).

تتكون الطاقة الحيوية للميتوكوندريا من خمس حالات تنفس متميزة19,20. الحالة 1 التنفس بدون أي ركائز إضافية أو ADP ، باستثناء ما هو متاح داخليا. بعد إضافة ADP ، ولكن لا يزال ، لا توجد ركائز ، يتم تحقيق التنفس الحالة 2. عند إضافة الركائز ، مما يسمح بنقل الإلكترون وتخليق ATP ، يتم الوصول إلى التنفس في الحالة 3. في هذه الحالة ، يمكن تحديد قدرة OXPHOS عند التركيزات المشبعة من ADP ، والفوسفات غير العضوي ، والأكسجين ، والركائز المرتبطة ب NADH والسكسينات. يمكن تعريف التنفس في الحالة 4 أو التنفس LEAK على أنه حالة بدون ADP أو سينثاز ATP مثبط كيميائيا مع وجود ركائز كافية. أخيرا ، عندما يتم استنفاد كل الأكسجين (نقص الأكسجين) في إعداد غرفة مغلقة ، يلاحظ تنفس الحالة 5.

توجد عدة طرق لتقييم حالات الطاقة الخلوية14 مع جهازين يهيمنان على التقييم الحالي في الوقت الفعلي ل OXPHOS من خلال تحليل استهلاك الأكسجين ، ويتم قياسه كوظيفة لانخفاض الأكسجين بمرور الوقت في نظام غرفة مغلقة مع قابلية تطبيق مختلفة تعتمد على النموذج التجريبي وسؤال البحث: مقياس التنفس عالي الدقة Oroboros 2k ومحلل التدفق خارج الخلية Seahorse XF. يسجل كلا الجهازين معدلات استهلاك الأكسجين كانخفاض في البيكومولات (pmol) من الأكسجين (O2) في الثانية كقيمة مطلقة داخل الغرفة أو بئر microplate. يتم الحصول على استهلاك الأكسجين المحدد لكل كتلة عن طريق تطبيع استهلاك الأكسجين المعني في وصفة عازلة محددة لكل عدد من الخلايا (الملايين) أو وزن الأنسجة (ملغ) أو كمية البروتين.

O2k (Oroboros Instruments) هو نظام مغلق من غرفتين مجهز بمستشعر أكسجين بولوغرافي (يختصر باسم مقياس التنفس عالي الدقة القائم على الغرفة: cHRR). تحتوي كل غرفة تجريبية على 2 مل من السائل الذي يتم الاحتفاظ به متجانسا بواسطة أجهزة التقليب المغناطيسية. يستخدم مستشعر الأكسجين القطبي نهجا أمبيرومتري لقياس الأكسجين: فهو يحتوي على كاثود الذهب ، وأنود كلوريد الفضة / الفضة ، وبين محلول KCI الذي يخلق خلية كهروكيميائية يتم تطبيق الجهد عليها (0.8 فولت). ينتشر الأكسجين من وسط الفحص من خلال غشاء بروبيلين الإيثيلين المفلور 25 ميكرومتر (O 2-permeable) ويخضع للتخفيض عند الكاثود ، مما ينتج بيروكسيد الهيدروجين. في الأنود ، تتأكسد الفضة بواسطة بيروكسيد الهيدروجين ، مما يولد تيارا كهربائيا. يرتبط هذا التيار الكهربائي (الأمبير) خطيا بضغط الأكسجين الجزئي. يتم استخدام الضغط الجزئي للأكسجين وعامل ذوبان الأكسجين في وسط الفحص لحساب تركيز الأكسجين. نظرا لأن الضغط الجزئي للأكسجين يعتمد على درجة الحرارة التجريبية والقياسات المستقطبة حساسة لدرجة الحرارة ، فإن التقلبات في درجة الحرارة تحتاج إلى تنظيم دقيق (±0.002 درجة مئوية) بواسطة كتلة تسخين بلتييه. يمكن التحكم في درجة الحرارة ضمن نطاق 4 درجات مئوية و 47 درجة مئوية.

محلل التدفق خارج الخلية Seahorse XF (Agilent) هو نظام قائم على الألواح بتنسيق صفيحة دقيقة من 24 أو 96 بئرا حيث تقوم ثلاثة أقطاب كهربائية فلورية بقياس استهلاك الأكسجين بمرور الوقت في كل بئر (يختصر باسم مقياس التنفس عالي الدقة القائم على الصفائح الدقيقة: mHRR). يتوفر أربعة منافذ كحد أقصى في خرطوشة الفحص للحقن التلقائي أثناء الفحص. يحتوي الفحص على دورات متعددة ، لكل منها ثلاث مراحل: 1) الخلط ، 2) الانتظار ، و 3) القياس. خلال مرحلة القياس ، يتم خفض مجسات الاستشعار في الصفيحة الدقيقة مما يخلق غرفة مغلقة مؤقتا تحتوي على حجم 7-10 ميكرولتر لقياس الضوء المنبعث. ينبعث هذا الضوء من الفلوروفورات المدمجة في البوليمر على طرف مجسات المستشعر ، والتي تستشعر O2 بناء على تبريد الفوسفور. تتناسب شدة إشارة التألق مع O2 وتتأثر بدرجة حرارة المستشعر ووسط الفحص. لذلك ، يتطلب تقدير الأكسجين الدقيق نهجا نسبيا مع خلفية جيدة دون أي عينة. تحدث استعادة تركيز الأكسجين أثناء مرحلة الخلط عندما يتحرك المستشعر لأعلى ولأسفل لخلط الحجم فوق الغرفة المؤقتة. تحسب كل دورة معدل استهلاك أكسجين واحد. يمكن التحكم في درجة الحرارة ضمن نطاق 16 درجة مئوية و 42 درجة مئوية.

HRR هو المعيار الذهبي لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الأمراض الأولية والمرتبطة بالميتوكوندريا والتمثيل الغذائي الخلوي العام. في هذه الدراسة ، يتم توفير البروتوكولات الأساسية ل HRR لتقييم وظيفة OXPHOS في الخلايا والأنسجة.

figure-introduction-2
الشكل 2: سير العمل لتحضير الخلايا والأنسجة ل cHRR ، وإعداد الخلايا لقياس التنفس mHRR . (أ) مخطط البروتوكولات المقدمة. (ب) خلايا الثدييات (الخطوة 1.2): حبيبة HEK293 تساوي 3 × 106 خلايا (اللوحة اليسرى). الأنسجة غير الليفية (الخطوة 1.3): تحضير محللات المخيخ الفئرانية في 2 مل من بوتر تفلون (اللوحة الوسطى). نفاذية العضلات الهيكلية التي يسببها الصابونين (الخطوة 1.4) اللوحة اليمنى) لقياس التنفس cHRR. (ج) تخطيط بذر الصفائح الدقيقة القياسي (الخطوة 2.4) وفحص الالتقاء لتحليل الخلايا حقيقية النواة (HEK293) لقياس التنفس mHRR. (دال، هاء) مخطط تحميل منفذ الحقن لقياس التنفس mHRR (الخطوة 2.4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمجلس الوطني لاستعراض التجارب على الحيوانات والوكالة الإدارية الإقليمية للدولة لجنوب فنلندا. تم استخدام ذكور الفئران C57BL/6JOlaHsd (4-6 أشهر) في هذه الدراسة. تم الحصول على الموافقة على استخدام خطوط الخلايا البشرية من لجنة الأخلاقيات المؤسسية بجامعة هلسنكي.

1. قياس التنفس عالي الدقة: مقياس التنفس القائم على الغرفة (cHRR)

ملاحظة: تم إجراء التجارب في هذا القسم من البروتوكول باستخدام Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (جدول المواد)

  1. معايرة أجهزة استشعار الأكسجين
    1. أجهزة قياس التنفس قبل التشغيل عند 37 درجة مئوية في 2.1 مل من وسط التنفس الميتوكوندريا (MiR05 ، الجدول 1 ، عامل الذوبان: 0.92) لمدة >45 دقيقة وإجراء معايرة الأكسجين كما هو موضح21. تابع إذا كان تباين خط الأساس في حدود ± 4 pmol / s.
      ملاحظة: يمكن أن تشير التقلبات الكبيرة في إشارة الخلفية إلى الصيانة المطلوبة لغشاء المستشعر أو آثار المثبطات المتبقية في الغرفة من التجارب السابقة. يوصى بتصحيح تدفق الأكسجين في الخلفية قبل مجموعة من التجارب25.
    2. سجل قيم معايرة الأكسجين لمراقبة أداء غشاء المستشعر بمرور الوقت.
      ملاحظة: يكشف هذا عن وظيفة المستشعر واستقرار الإشارة إلى الضوضاء ومتى تكون صيانة غشاء المستشعر مطلوبة. اعتمادا على الضغط المحيط ، يتم إذابة ما بين 180-200 ميكرومول من الأكسجين في MiR05.
    3. قم بإزالة كل السائل في الغرفة قبل إضافة أي عينة في وسط التنفس.
      ملاحظة: قم بتقييم حجم غرف التنفس ليكون بالضبط 2 مل بانتظام.
  2. إعداد الخلايا لقياس التنفس عالي الدقة
    1. استزرع خلايا HEK293 في أطباق قطرها 10 سم 2 في وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز مع استكمال مصل البقر الجنيني المعطل حراريا بنسبة 10٪ (FBS) ، و GlutaMax ، والأحماض الأمينية غير الأساسية ، و Na-Pyruvate22 و uridine23 لدعم التمثيل الغذائي المعيب OXPHOS في حاضنة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2.
      ملاحظة: يمكن زراعة أي نوع من الخلايا حقيقية النواة. بالنسبة لمعظم أنواع الخلايا ، يؤدي زراعة طبق 10 سم2 إلى خلايا كافية (عادة ما >3 × 106 خلايا). تحقق بشكل روتيني من عدوى الميكوبلازما لتجنب التأثيرات على التمثيل الغذائي الخلوي والتنفس.
    2. تنمو الخلايا دون تجاوز 90٪ من الالتقاء (الشكل 2C).
      ملاحظة: قد تظهر الخلايا ذات الالتقاء >90٪ تأثيرات مثبطة تعتمد على النمو على التنفس (إذا لم تكن متزامنة أو ما بعد الميتوتيك).
    3. اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS ، وافصلها ب 1 مل من التربسين الدافئ بنسبة 0.25٪ ، وقم بإلغاء تنشيط التربسين عن طريق إضافة DMEM الدافئ (لوحة 5 مل / 10 سم2 ) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    4. قم بالطرد المركزي بلطف لمحلول الخلية الذي يساوي 2.5 × 10 6 خلايا عند 300 × g لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة supernatant تماما ، وأعد التعليق في 2.5 مل من MiR05 الدافئ (1 × 106 خلايا / مل) (الشكل 2A).
    5. بالنسبة لخلايا التعليق ، قم بحساب وإزالة محلول يساوي 2.5 × 106 خلايا ، والكريات واستمر كما هو مذكور في الخطوة 1.2.4.
    6. قم بتشغيل بروتوكول SUIT لتحسين التخلل (الخطوة 1.6) أو الخلايا أو الأنسجة المتخلل (الخطوة 1.5) أو الخلايا السليمة (الخطوة 1.7)
      ملاحظة: للحصول على نتائج متسقة ، يوصى بالحفاظ على تركيز الخلية ثابتا (على سبيل المثال ، 1 × 106 خلايا / مل). على الرغم من أن التنفس مستقل عن كثافة الخلايا في مقياس التنفس24 ، إلا أن الركائز والمثبطات تكون في تركيز مماثل طوال التجارب إذا تم الحفاظ على أعداد الخلايا ثابتة.
  3. إعداد الأنسجة غير الليفية (مثل الدماغ والكبد) لقياس التنفس عالي الدقة
    1. استئصال قطعة متجانسة من الأنسجة ، 30-40 ملغ في الوزن ، أو استخدام العضو بأكمله (مخيخ الماوس في هذه الحالة).
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأنسجة على الفور، احتفظ بها في 2 مل من MiR05 البارد مما يسمح بحفظها لمدة تصل إلى 2 ساعة لمعظم الأنسجة. يجب تقييم أوقات تخزين الأنسجة الفردية في سلاسل زمنية.
    2. لطخة الأنسجة الجافة مع ورقة تصفية Whatman (حذر: مادة الأنسجة الرخوة تميل إلى الالتصاق).
    3. ضع قطعة الأنسجة 30-40 ملغ في مبرد بالثلج 2 مل من البولي تترافلورو إيثيلين بوتر Elvehjem المجانس.
    4. أضف كمية مناسبة من MiR05 للحصول على 20 ملغم / مل للحفاظ على نسبة الأنسجة إلى المخزن المؤقت. احتفظ بالكمية الإجمالية >1.5 مل و <2 مل لتجنب السوائل غير الكافية أو الزائدة للنفاذية الميكانيكية المناسبة.
    5. أدخل المدقة ، وقم بتحليل الأنسجة ببطء عن طريق سحب المدقة بعناية مع تجنب توليد فراغ يسبب تلفا مفرطا للأنسجة.
    6. قم بإجراء 7 سكتات دماغية في المجموع (1x تعرف بأنها سكتة دماغية واحدة لأعلى ولأسفل) حتى يتم تحليلها (على ما يبدو كسائل عكر بدون حطام كبير) (الشكل 2B).
      ملاحظة: يجب اختبار عدد السكتات الدماغية للتحلل المناسب لكل نسيج من خلال تقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا الخارجي عبر استجابة السيتوكروم C (الخطوة 1.5.11). قد يبقى النسيج الضام أو أجزاء الأوعية التي يصعب تحليلها.
    7. قم بصب الأنسجة المحللة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
    8. اغسل الجزء الداخلي من الفخار بكمية متساوية من MiR05 المستخدمة في خطوة التحلل (على سبيل المثال ، 1.5 مل) وأضف إلى أنبوب 15 مل الذي يحتوي الآن على 3-4 مل من MiR05 عند 10 مجم / مل من الأنسجة المحللة.
    9. أضف 2 مل من MiR05 العادي لكل غرفة لتسخينها إلى 37 درجة مئوية.
    10. قم بتدوير الأنبوب للتوزيع المتساوي قبل سحب 500 ميكرولتر (أي ما يعادل 5 ملغ) من كل ليسات لكل غرفة ببطء لتقليل الضغط من البرد إلى 37 درجة مئوية.
    11. انتظر >3 دقائق حتى تسخن محتويات الغرفة إلى 37 درجة مئوية قبل إغلاق الغرفة. إزالة السوائل الزائدة فوق سدادة (كمية لكل غرفة بعد إغلاق: 4 ملغ).
    12. قم بتشغيل بروتوكول SUIT للنفاذ القياسي (الخطوة 1.5).
  4. إعداد الأنسجة الليفية (العضلات الهيكلية ، عضلة القلب) لقياس التنفس عالي الدقة
    1. استخراج الأنسجة الصلبة ، وإزالة النسيج الضام والدهون من العضلات باستخدام ملقط حاد في 2 مل من BIOPS الجليد البارد (الجدول 2) تحت مجهر تشريح.
    2. افصل حزم الألياف (~ 4 ملغ) على طول المحور الطولي باستخدام ملقط حاد. قم بإخراج الألياف بما يكفي للحصول على بنية تشبه الشبكة (الشكل 2B).
      ملاحظة: يشار إلى فصل الألياف الميكانيكية المناسبة والنفاذية من خلال فقدان الميوغلوبين الصبغة الحمراء وزيادة الشفافية.
    3. اغسل حزمة الألياف وتغلغلها في الصابونين (50 ميكروغرام / مل في BIOPS ، أعدت طازجة) لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية (تصبح الألياف شفافة ، مما يشير إلى النفاذية الكاملة ، الشكل 2B).
    4. اغسل الألياف مرتين في MiR05 لمدة 5 دقائق لكل غسل عند 4 درجات مئوية.
    5. تجف اللطخة بورق الترشيح وتزن قبل إضافتها إلى الغرفة المملوءة ب 2.1 مل MiR05.
    6. أدخل سدادات دون إغلاق كامل ، ثم قم بأكسجة الغرف ب 2 مل من O2 النقي باستخدام حقنة 20 مل وأغلق الغرف عن طريق لف السدادات في حركة دوارة. حافظ على تركيز O2 بين 300-500 ميكرومتر أثناء التجربة لتجنب الحد من انتشار الأكسجين.
  5. بروتوكول لتقييم التنفس الروتيني في الخلايا أو الأنسجة
    1. أضف عينة إلى الغرفة كما هو مذكور في الخطوات 1-5-2 - 1-5-3.
    2. أضف 2.3 مل من تعليق الخلايا MiR05 الدافئ (الإدخال القياسي: 1 × 106 خلايا / مل كما في الخطوة 1.2 أو 2 ملغ من الأنسجة / مل كما في الخطوة 1.3)
    3. الهيكل العظمي وعضلة القلب (الخطوة 1.4): أضف ~ 4 ملغ من الألياف النفاذة للسابونين إلى 2.3 مل من MiR05 الدافئة مع مراعاة الخطوات 1.4.4-1.4.6
    4. تشغيل الغرف عند 37 درجة مئوية وسرعة تحريك تبلغ 700 دورة في الدقيقة. انتظر لمدة >3 دقيقة للسماح للوسائط بفك الغاز وإغلاق الغرف عن طريق لف السدادة في حركة دوارة. يشير تثبيت كتلة بلتييه إلى الوصول إلى درجة الحرارة المحددة.
    5. (اختياري) قم بتغيير سرعة التحريك إلى 300 دورة في الدقيقة للسماح للفقاعات المتبقية بالهروب عبر الشعيرات الدموية للسدادة.
    6. استنشاق أي سائل زائد فوق السدادة. انتظر لمدة 10 دقائق حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة مع أي نوع عينة لتسجيل التنفس الروتيني / الحالة 1 ، الشكل 1B).
    7. للحصول على قياسات التنفس في الخلايا والأنسجة المتخلل ، تابع الخطوة 1.6. للخلايا السليمة مع الخطوة 1.8.
  6. بروتوكول تحليل OXPHOS في الخلايا أو الأنسجة المتداخلة
    1. استخدم عينة الأنسجة المحللة (المتداخلة) أو الخلايا المتخلل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من الديجيتونين (8.1 مللي متر من مخزون الديجيتونين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)) للحصول على تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل لتخلل الخلايا. سوف ينخفض التدفق ويجب أن يستقر عند >5 دقيقة.
      تحذير: ديجيتونين سام بشكل حاد للجهاز التنفسي ، أو في اتصال مع الجلد ، أو عند ابتلاعه.
      ملاحظة: يتم حقن جميع المواد الكيميائية باستخدام محاقن زجاجية دقيقة. استخدم المحاقن فقط للمواد الكيميائية المشار إليها لتجنب التلوث المتبادل واغسلها جيدا بالماء و EtOH بعد الاستخدام. قد تتطلب المحاقن المسدودة الموجات فوق الصوتية في ddH2O الدافئ أو سلك تنظيف لإزاحة أي سدادات كيميائية. قم دائما بسحب فائض من محلول المخزون المعني في المحقنة لتجنب إدخال الهواء إلى الغرف. افحص داخل الغرف لإدخال الهواء بعد كل حقنة. سجل كل خطوة حتى هضاب التدفق.
    2. أضف في تتابع سريع: 5 ميكرولتر من 0.4 م مالات (م) لتركيز نهائي قدره 1 ملليمتر، 5 ميكرولتر من 2.0 م بيروفات (P؛ أعدت طازجة)، لتركيز نهائي قدره 5 ملليمتر، 4 ميكرولتر من 2.5 م غلوتامات (G) لتركيز نهائي قدره 5 ملليمتر.
    3. بعد استقرار التدفق السابق ، أضف 5 ميكرولتر (10 ميكرولتر للأنسجة العضلية) من 0.5 M أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP ، aliquots المخزنة عند -80 درجة مئوية) للحصول على تركيز نهائي قدره 1.25 mM.
      ملاحظة: قد تحتاج الأنسجة مثل العضلات إلى تركيز مختلف للوصول إلى التشبع.
    4. أضف 5 ميكرولتر من 4 mM السيتوكروم C (cytC) للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر.
      ملاحظة: اختياري للخلايا لتقييم جودة النفاذية.
    5. أضف 16 ميكرولتر من سكسينات (S) 1.25 م لتركيز نهائي قدره 10 مللي متر. (اختياري) أضف 3 ميكرولتر من 0.5 M ADP للحصول على تركيز نهائي قدره 2 mM للتحكم في تشبع تركيز ADP.
    6. بالنسبة للخلايا والأنسجة غير الليفية ، أضف 2 ميكرولتر من 1 ملغ / مل أوليغوميسين (OM) للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
      تنبيه: جميع مثبطات ETS المستخدمة شديدة السمية.
      ملاحظة: قد يتطلب Oligomycin المعايرة بالتحليل الحجمي للتركيز الأمثل لأنه يمكن أن يقمع قدرة ETS ويتم حذفه للأنسجة العضلية. أعد الأكسجين هنا عندما يتم فحص الأنسجة العضلية وإذا كان O2 أقل من 300 ميكرومتر.
    7. معايرة FCCP من مخزون 2 mM ، أضف 0.6 ميكرولتر مع خطوات 0.2 μL اللاحقة حتى لا تكون أي زيادة في التنفس والتنفس غير مقترنة إلى أقصى حد (نظري: غير مقترنة).
    8. أضف 1 ميكرولتر من 1 مللي متر روتينون (ROT) للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 ميكرومتر. أضف 2 ميكرولتر من مخزون مضاد للمايسين (AM) 1 ملغم / مل للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
    9. أعد أكسجة الغرف لتحقيق مستوى أكسجين مماثل (~ 150 ميكرومتر) في جميع الغرف عن طريق رفع المكبس ببطء في حركة ملتوية.
    10. أضف 5 ميكرولتر من 0.8 م أسكوربات لتركيز نهائي قدره 2 مللي متر متبوعا مباشرة ب 5 ميكرولتر من 0.2 م ن ، ن ، ن ، ن ، ن - رباعي ميثيل - ف - فينيلينديامين (TMPD) لتركيز نهائي قدره 0.5 مللي متر لتقييم النشاط الوريدي المعقد (اختياري).
    11. أضف 5 ميكرولتر من أزيد 4 M للحصول على تركيز نهائي قدره 10 mM على الفور عند الوصول إلى ذروة تدفق O2 باستخدام TMPD. استمر في الجري لمدة >5 دقيقة لفحص الأكسدة التلقائية ل TMPD لحساب المستوى الأساسي الوريدي المعقد.
    12. أعد حساب الخلايا لتأكيد التشغيل المسبق لعدد الخلايا وتابع مع الخطوة 1.9.
      ملاحظة: يجب معايرة الديجيتونين بيرميابيلية (للخلايا فقط) في التجارب التجريبية للوصول إلى أقصى تدفق وعدم التأثير على سلامة غشاء الميتوكوندريا (انظر الخطوة 1.7). يجب استبعاد العينات المتخلل (خاصة الأنسجة العضلية) مع زيادة بنسبة >10٪ في معدل التنفس بعد إضافة السيتوكروم c من مزيد من التحليل بسبب تلف غشاء الميتوكوندريا الخارجي. من المتوقع حدوث انخفاض قصير في التدفق بعد إضافة المواد الكيميائية الذائبة من EtOH.
  7. بروتوكول لتحديد ظروف النفاذية المثلى للخلايا
    1. أضف خلايا كما هو موضح في الخطوتين 1.2 و1.5.2.
    2. خذ 10 ميكرولتر من مخزون ديجيتونين 10 ملغم / مل وأضف 10 ميكرولتر من DMSO للتخفيف إلى 5 ملغ / مل.
    3. أضف 1 ميكرولتر من الروتينون (مخزون 1 ملليمتر). أضف 10 ميكرولتر من السكسينات (مخزون 2 ملليمتر) و 5 ميكرولتر من ADP (0.5 مليون سهم).
    4. معايرة 1 ميكرولتر من الديجيتونين (2.5 ملغ لكل خطوة) بشكل متكرر حتى التنفس لا يزيد أكثر من ذلك وهو الحد الأقصى.
      ملاحظة: يشير انخفاض التنفس إلى وجود تركيز مفرط للديجيتونين.
  8. بروتوكول تحليل OXPHOS في الخلايا السليمة
    1. بعد التنفس الروتيني (الخطوة 1.6.1-1.6.6) ، أضف 2 ميكرولتر من 0.01 mM oligomycin للحصول على تركيز نهائي قدره 10 نانومتر.
    2. معايرة FCCP من مخزون 2 mM ، أضف 0.6 ميكرولتر مع خطوات 0.2 μL اللاحقة حتى لا تكون هناك زيادة أخرى في التنفس والتنفس غير مقترنة إلى أقصى حد (نظري: غير مقترنة)
    3. أضف 1 ميكرولتر من 1 مللي متر روتينون لتركيز نهائي قدره 0.5 ميكرومتر. أضف 2 ميكرولتر من 1 ملغم / مل من مخزون مضاد للمايسين لتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
    4. أعد أكسجة الغرفة إلى نفس مستوى الأكسجين (~ 150 ميكرومتر) عن طريق رفع المكبس ببطء في حركة التواء.
    5. أضف 5 ميكرولتر من 0.8 م أسكوربات للتركيز النهائي البالغ 2 ملليمتر. أضف على الفور 5 ميكرولتر من 0.2 M TMPD للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 mM لتقييم النشاط الوريدي المعقد.
      ملاحظة: قم بإعداد دفعة جديدة قبل أي مجموعة أكبر من التجارب لأن TMPD عرضة للأكسدة التلقائية. قد ينخفض النشاط بمرور الوقت عند تخزينه عند -20 درجة مئوية.
    6. أضف 5 ميكرولتر من أزيد 4 M للحصول على تركيز نهائي قدره 10 mM على الفور عند الوصول إلى ذروة تدفق O2 باستخدام TMPD. استمر في التشغيل لمدة >5 دقيقة لفحص الأكسدة التلقائية ل TMPD لحساب مستوى الأساس الوريدي المعقد.
    7. أعد حساب الخلايا لتأكيد التشغيل المسبق لعدد الخلايا والمتابعة مع الخطوة 1.9.
  9. جمع العينات بعد التشغيل
    1. اجمع بالضبط 1 مل من نظام التعليق MiR05 من كل غرفة (مع تشغيل المقليب) في أنبوب 1.5 مل 1.5 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 1000 × g للخلايا المتخلل أو عند 20,000 x g لتحلل الأنسجة. قم بإزالة المادة الفائقة وتجميد الكريات عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (القسم 3).
  10. تحليل بروتوكولات SUIT
    1. تحليل تدفق الأكسجين (pmol / s ، تطبيع إلى المدخلات) في كل هضبة بعد إضافة ركيزة أو مثبط (الشكل 1C والشكل 3A). تصدير القيم إلى جدول بيانات.
    2. اطرح قيمة استهلاك الأكسجين المتبقي (ROX والشكل 1C والشكل 3C) من جميع قيم كل تشغيل تجريبي. اطرح التنفس المتبقي من TMPD للحصول على التنفس الوريدي المعقد.
    3. ارسم القيم المطلقة التي تم تطبيعها للخلية (الشكل 3A ، B) أو إدخال الأنسجة (الشكل 5A ، B). حساب نسب التحكم في التدفق (الخطوة 1.11) أو تطبيعها إلى مدخلات البروتين (الشكل 3C).
  11. حساب نسبة التحكم في التدفق
    1. الحصول على مؤشر لوظيفة الجهاز التنفسي والتحكم في الاقتران باستخدام نسب التحكم في التدفق (FCR) 9,26.
      ملاحظة: يسمح هذا بتقييم جودة الميتوكوندريا الجوهرية ، بغض النظر عن كمية الميتوكوندريا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسب التحكم في التدفق (FCR) قابلة للمقارنة داخل نفس خطوط الخلايا مما يسمح بمراقبة جودة الكواشف (يتم الحصول على تقارير الأداء الترددي ذات الصلة من خلال القيم المرجعية المرقمة المشار إليها في الشكل 1B-D والشكل 3C).
    2. احسب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي لاقتران OXPHOS ب LEAK باستخدام المعادلة 1.
      المعادلة 1: FCRADP = 5/6 = الحالة 3 / الحالة 4
    3. احسب FCR لتقييم التنفس المعتمد على NADH باستخدام المعادلة 2
      المعادلة 2: حالة FCR 3 (I) = 3/5 = الحالة 3 (I) / الحالة3 ( I+II)
    4. احسب FCR لتقييم التنفس المعتمد على السكسينات باستخدام المعادلة 3.
      المعادلة 3: حالة FCR3 (II) = 8/7 =سعة Srot / ETS
    5. احسب FCR لتقييم المقترن وغير المقترن باستخدام المعادلة 4.
      المعادلة 4: FCR مقترنة/غير مقترنة = 5/7 = الحالة 3 (I+II) /سعة ETS
    6. لاختبار سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا، استخدم المعادلة 5.
      المعادلة 5: ٪ تلف الغشاء الخارجي للميتوكوندريا = 3/4 = الحالة 3 (I) / الحالة 3 (I) مع cyt c

2. قياس التنفس عالي الدقة: مقياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة (mHRR)

ملاحظة: تم إجراء التجارب في هذا القسم من البروتوكول باستخدام محلل التدفق خارج الخلية Seahorse XFe96 (جدول المواد)

  1. زراعة الخلايا
    1. ثقافة أي نوع من الخلايا. يمكن استخدام الأتباع (مثل الكولاجين واللامينين) لتسهيل ربط الخلايا. هنا ، يتم زراعة خلايا HEK293 كما كان من قبل (الخطوة 1.3).
    2. في اليوم السابق للتجربة، افصل الخلايا وانقلها إلى صفيحة دقيقة معينة من نوع mHRR 96-well للحصول على التقاء مثالي في يوم التجربة (80٪ -100٪) (الشكل 2C).
      ملاحظة: بالنسبة ل mHRR ، تعد كثافات الخلايا الدقيقة أمرا بالغ الأهمية. يجب حساب خصائص النمو الفردية لخطوط الخلايا أو العلاجات التي تؤثر على النمو لضمان التقاء مماثل في يوم التجربة.
  2. إعداد الخلايا لقياس التنفس عالي الدقة
    1. حصاد وإعادة تعليق الخلايا بما فيه الكفاية قبل البذر
      ملاحظة: يوصى بزرع الخلايا من نفس التخفيف للنسخ المتماثلة.
    2. زرع الخلايا وفقا لمعدلات نمو خطوط الخلايا الفردية أو خصائص النمو قيد العلاج.
      ملاحظة: قم بالتحسين على صفيحة صغيرة قياسية من 96 بئرا واستقراء كثافة الخلية إلى صفيحة دقيقة خاصة ب 96 بئرا. في هذا الإعداد ، تم زرع خلايا 7 × 104 HEK293 WT لكل بئر من 96 بئرا. يتم استخدام العمودين الأول والأخير من لوحة 96 بئرا لتحديد البروتين (الشكل 2C). يجب ألا تحتوي الآبار الأربعة الزاوية على أي خلايا وتستخدم لتصحيح الخلفية التجريبية. من الناحية المثالية ، تكون الآبار القريبة من الحواف فارغة لتقليل تأثير الحافة (على سبيل المثال ، تظهر الخلايا معدلات نمو متغيرة ناجمة عن تأثيرات درجة الحرارة) (الشكل 2C ، D).
  3. إعداد لوحات الاستشعار ، وتحميل المثبطات
    1. في يوم الفحص ، أكمل 38.8 مل من الوسط مع 0.4 مل من 1 م الجلوكوز ، و 0.4 مل من 200 مللي متر جلوتامين ، و 0.4 مل من 100 مللي متر من نان بيروفات.
      ملاحظة: يتطلب التنفس mHRR وسيطا متخصصا غير مخزن مؤقتا DMEM عند درجة الحموضة 7.4. بشكل عام ، يجب أن يكفي 40 مل لتجربة واحدة مع صفيحة صغيرة واحدة من 96 بئرا.
    2. قم بتسخين متوسط فحص التنفس إلى 37 درجة مئوية واستبدل وسط زراعة الخلايا بوسط فحص التنفس عن طريق الغسيل مرتين ب 80 ميكرولتر لكل بئر.
    3. اضبط اللوحة مع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 60 دقيقة قبل الفحص.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة الغاز من اللوحة لأن CO2 يمكن أن يؤثر على نتائج التنفس ، ويمكن أن ينتج المصل في الوسط فقاعات أثناء الفحص.
    4. مثبطات التسميد المسبق ل OM و FCCP و ROT و AM إلى 37 درجة مئوية وإخراج لوحة المستشعر من الحاضنة.
    5. تمييع OM و FCCP و ROT و AM في 3 مل من الفحص متوسط إلى تركيز بئر نهائي يبلغ 1.5 ميكرومتر و 1.125 ميكرومتر و 1 ميكرومتر على التوالي. املأ في منافذ منفصلة كما هو موضح في الشكل 2E.
      ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة متعددة القنوات لملء خرطوشة المستشعر. نظرا لاستخدام الهواء المضغوط لحقن المركبات ، يجب ملء جميع المنافذ بكمية متساوية من حجم السائل كلما تم ملء منفذ بمركب. يمكن دمج ROT و AM في منفذ واحد. يمكن إذابة المثبطات في EtOH أو DMSO.
    6. افحص منافذ الحقن وتحقق من حجم التحميل المتساوي لكل منفذ.
      ملاحظة: تحتوي جميع المنافذ على ثقب في الأسفل للحقن. يجب توخي الحذر عند تحريك لوحة الاستشعار. يمكن إزالة فقاعات الهواء باستخدام إبرة.
  4. بروتوكول لتقييم الأكسجين في الخلايا السليمة
    1. في اليوم السابق للفحص، قم بتنفيذ الخطوات 2.4.2-2.4.7.
    2. Aliquot 20 مل من محلول العيار في أنبوب مخروطي 50 مل.
    3. افتح مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية وقم بإزالة المحتويات.
    4. ضع خرطوشة المستشعر مقلوبة بجوار لوحة الأداة المساعدة. ماصة 200 ميكرولتر من محلول العيار في كل بئر من لوحة المرافق.
    5. قم بتوصيل خرطوشة المستشعر بلوحة الأداة المساعدة مع الانتباه إلى أن جميع أجهزة الاستشعار مغمورة.
    6. اضبط اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها أو ما لا يقل عن 12 ساعة. تحقق من أن الرطوبة داخل الحاضنة كافية لمنع تبخر المعايرة.
    7. قم بتشغيل النظام القائم على الصفائح الدقيقة والكمبيوتر ليكونا جاهزين للاستخدام في اليوم التالي (يتطلب الجهاز 3 ساعات على الأقل لتحقيق التوازن إلى 37 درجة مئوية قبل إجراء الفحص).
      ملاحظة: لاستقرار الإشارة، قم بزيادة نقاط القياس إلى 6 بدلا من 3 دورات قياس لكل حالة تنفسية. تتكون كل دورة من 3 دقائق من الخلط و 3 دقائق من القياس.
    8. في يوم فحص XF، قم بتنفيذ الخطوات 2.4.9-2.4.20.
    9. تحقق من التقاء لوحة زراعة الخلايا ، ومورفولوجيا الخلايا ، وأن آبار الخلفية فارغة.
    10. اغسل الخلايا بوسط التنفس المحضر كما هو مذكور في الخطوات 2.4.11-2.4.12.
    11. قم بإزالة جميع الوسائط الثقافية باستثناء 20 ميكرولتر من كل بئر. أزل 55 ميكرولتر إذا كان وسط الاستزراع 80 ميكرولتر بسبب التبخر بين عشية وضحاها (حوالي 5 ميكرولتر).
    12. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 90 ميكرولتر من وسط الفحص. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من وسيط الفحص. يجب أن يكون حجم النهاية 120 ميكرولتر.
      ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة متعددة القنوات لهذه الخطوة لضمان تطبيق نفس إجراء الغسيل على كل حالة تجريبية (يعتمد على إعداد اللوحة). عند الشفط ، قم بإمالة اللوحة إلى زاوية 45 درجة ووضع أطراف الماصة في زاوية الآبار لشفط وحقن السوائل. من الضروري توخي الحذر أثناء الغسيل لأن بعض الخلايا قد تنفصل بسهولة عن الجزء السفلي من لوحة زراعة الخلايا.
    13. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 60 دقيقة قبل الفحص.
    14. استرجع لوحة خرطوشة المستشعر المائي من الحاضنة الخالية من ثاني أكسيد الكربون2.
    15. تخلص من محلول العيار القديم واستبدله بمحلول عيار جديد ، تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
    16. قم بإعداد مثبطات ومتوسط مقايسة (3 مل لكل مثبط لما مجموعه 12 مل من وسط المقايسة) واستخدم خزان ماصة لتحميل المثبط في الموانئ.
    17. افتح البرنامج وقم بتشغيل قالب مصمم مسبقا أو جديد. املأ خريطة اللوحة، واضبط المعايرة بالتحليل الحجمي ودورات القياس، ثم اضغط على Start (ابدأ ) لبدء معايرة المستشعرات البصرية.
    18. قم بإزالة الغطاء من الخرطوشة المحملة وضعه في الفتحة التي تنزلق تلقائيا خارج الماكينة، للتحقق من أن العلامات الموجودة في الزاوية السفلية اليمنى من اللوحة تصطف مع المثلث الموجود في الزاوية اليمنى السفلى من الفتحة.
    19. انقر فوق متابعة لإجراء معايرة تلقائية ، تستمر لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    20. بعد المعايرة، قم بإزالة لوحة الأداة المساعدة التي تحتوي على المعايرة.
    21. قم بإزالة الغطاء من الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على الخلايا ووضع اللوحة في الفتحة عندما يطلب منك الجهاز ذلك. انقر فوق متابعة لبدء التشغيل.
  5. جمع العينات بعد التشغيل
    1. أخرج اللوحة من الماكينة ، وقم بإزالة وسائط الفحص المتبقية بعناية دون إزعاج الخلايا وقم بتجميد اللوحة بأكملها عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة (القسم 3).

3. تحديد البروتين باستخدام فحص حمض البيتشينكونينيك (فحص BCA)

  1. تحضير ألبومين مصل البقر المخفف (BSA) في المخزن المؤقت المستخدم لاستخراج البروتين والمتوافق مع BCA: 2 ملغ / مل ، 1.5 ملغ / مل ، 1 ملغ / مل ، 0.5 ملغ / مل ، 0.25 ملغ / مل و 0.25 ملغ / مل و 0 ملغ / مل للمنحنى القياسي في التكرارات.
  2. استخراج البروتينات عن طريق التعليق في مخزن مؤقت مناسب للتحلل (على سبيل المثال ، RIPA) مع 20 ميكرولتر لكل بئر ل mHRR أو 100 ميكرولتر لكل حبيبة موجودة داخل أنبوب 1.5 مل ل cHRR.
  3. احتضن صفيحة mHRR أو أنبوب 1.5 مل يحتوي على تحلل البروتين لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  4. قم بطرد مركزي لأنبوب 1.5 مل الذي يحتوي على تحلل البروتين عند 4 درجات مئوية عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة ونقل المادة الفائقة الناتجة إلى أنبوب نظيف جديد 1.5 مل.
  5. استخدم 10 ميكرولتر لكل عينة في نسختين ومعايير في لوحة ميكروتيتر. أضف 200 ميكرولتر من كاشف BCA العامل واحتضنه لمدة >15 دقيقة.
  6. اقرأ اللوحة في مقياس الطيف الضوئي القياسي عند طول موجي يبلغ 562 نانومتر واحسب تركيزات البروتين باستخدام منحنى قياسي BSA.
  7. تطبيع نتائج التنفس إلى تركيز البروتين.
    ملاحظة: يسمح التطبيع إلى كمية البروتين بتأكيد كثافات بذر الخلايا أو إدخال الوزن الرطب. البروتينات المستخرجة مناسبة للنشاف المناعي اللاحق ضد الوحدات الفرعية من ETS على سبيل المثال ولكنها لا تمثل العينة الأصلية بالكامل (على سبيل المثال ، فقدان مواقع الفسفرة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا ، نقدم بروتوكولات لتحديد الطاقة الحيوية الميتوكوندريا في الخلايا حقيقية النواة ، والأنسجة غير الليفية (على سبيل المثال ، المخيخ) ، والأنسجة الليفية (على سبيل المثال ، العضلات الهيكلية). بالنسبة للخلايا حقيقية النواة ، تم قياس HEK293 مع ضربة قاضية هندسية من كريسبر من بروتينين مختلفين مرتبطين بترجمة الميتوكوندريا مما أدى إلى نقص OXPHOS متعدد (CRISPR KO1) ونقص حاد / كامل في OXPHOS (CRISPR KO2) إما باستخدام cHRR (الشكل 3A-C) أو mHRR (الشكل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقليديا ، تمت دراسة الطاقة الحيوية الميتوكوندريا باستخدام أقطاب الأكسجين من نوع كلارك. غير أن الافتقار إلى القرار والإنتاجية يبرر التقدم التكنولوجي. حتى الآن ، تم اعتماد O2k (المشار إليه باسم cHRR) و Seahorse XF96 Flux Analyzer (المشار إليه باسم mHRR) على نطاق واسع في مجال الطاقة الحيوية الخلوية. هنا ، نقدم مجموعة مفهومة من البروتوكولات لتحليل استقلاب الطاقة الخلوية من خلال تقييم التنفس الميتوكوندريا باستخدام إما cHRR أو mHRR ، ومناقشة الفوائد الرئيسية لكل جهاز وتقديم إرشادات عملية. وتشمل البروتوكولات المقدمة هنا خلايا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بتمويل من أكاديمية فنلندا (C.B.J) ، ومؤسسة Magnus Ehrnroot (C.B.J) ، وزمالة الدكتوراه من كلية الدراسات العليا المتكاملة لعلوم الحياة (R.A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 مل Potter-Elvehjem Glass / PTFE طاحونة مناديل / خالطأومني إنترناشيونال07-358029
95٪ O2< / sub> ، 5٪ CO2< / sub> خليطبوتر لطحن الأنسجة
ADPSigmaA 4386
Antimycin ASigmaA 8674
Chemical AscorbateMerckPHR1279-1Gكيميائي ، يذوب في الإيثانول
BSA (خالي من الدهون acid)SigmaA 6003كيميائي
CaCO3< / sub>SigmaC 4830السيتوكروم الكيميائي
C SigmaC 7752Digitonin الكيميائي
SigmaD 5628الكيميائية
DithiothreitolSigmaD 0632الكيميائية ، يذوب في DMSO
D-SucroseRoth4621.1
Dulbecco الكيميائي s النسر المعدل s متوسط (نسبة عالية من الجلوكوز)فيشر سيانتيفك41965-039
Dulbecco الكيميائي s النسر المعدل s متوسط  (بدون جلوكوز)فيشر ساينتفيكA14430-01
EGTASigmaE 4378
EtomoxirSigmaE1905Chemical
Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيفيشر ScientificAM12500Chemical
Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر ScientificAM12501
FCCPSigmaC 2920
الجلوكوزسيجماG7021الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
الغلوتاماتSigmaG 1626الكيميائية
GlutaMax   ؛ ( 100x)  (200 نانومتر  L-alanyl-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد)فيشر 35050061كيميائي
خلايا HEK293ATTCCRL-1573
مقياس الدمفيشر Scientific0267151Bأداة لعد الخلايا
HepesSigmaH 7523الكيميائية
ImidazoleFluka56750الكيميائية
KClMerck1.04936كيميائي
L-carnitineSigmaC0283كيميائي
MalateSigmaM 1000كيميائي
MES هيدراتسيجماM8250كيميائي
MgCl2< / sub>سيجماM 9272كيميائي
Na2< / sub>ATPSigmaA 2383Chemical
Na2 فوسفوكرياتينسيجماP 7936كيميائي
Na-pyruvate ( 100 م)  (100 ضعف)فيشر 11360070
NEAA ( الأحماض الأمينية غير الأساسية) 100xفيشر 11140035
العادي FBS ( 10x)Fisher Scientific10500064
O2< / sub>k-Core: Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02أداة قياس التقييس عالية الدقة
O2< / sub>k-المعايرة بالتحليل الحجميOroboros Instruments20820-03محاقن هاميلتون للحقن الكيميائي
OligomycinSigmaO 4876الكيميائية ، تذوب في الإيثانول
PalmitoylcarnitineSigmaP 4509
البنسلين الستربتومايسينفيشر 15140122
بيرس BCA فحص البروتينكيت فيشر Scientific23227
PyruvateSigmaP 2256الكيميائية
RIPA-BufferFisher Scientific89900الكيميائية
RotenoneSigmaR 8875كيميائي ، يذوب في الإيثانول
SaponinSigmaS7900Chemical

Seahorse XF DMEM حزمة متوسطة ، درجة الحموضة 7.4
Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا		103680-100
Seahorse XFe96 محلل التدفق خارجالخلية
Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا		أداة قياس إعادة التدفق عالية الإنتاجية
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent، Santa Clara، CA		br/> يتضمن لوحات الفحص والخراطيش وأدلة التحميل لنقل المركبات إلى خرطوشة الفحص ومحلول العيار.
مقص صغيرفيشر ساينتيك08-951-20
أزيد الصوديومسيجماS2002كيميائي
سكسيناتسيجماS 2378التورين الكيميائي
سيجماT 8691الكيميائية
TMPDSigmaT 3134محلول كيميائي
تريبان أزرقميرك72-57-1كيميائي
التربسين 0.25٪ EDTAفيشر العلمي25200056
ملقطان رفيعانالحواف فيشر Scientific12-000-122
مخزون يوريدين (500x)SigmaU3750Chemical
الغاز الطبي العلمي العلمي الكيميائي علمية<

المراجع

  1. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  2. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
  3. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  4. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  5. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews Disease Primers. 2, 1-23 (2016).
  6. Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsøe, R., Dela, F. Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle. Diabetologia. 50 (4), 790-796 (2007).
  7. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  8. Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biology. 13, 1-11 (2015).
  9. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and Respiratory control. An introduction to OXPHOS analysis. Bioenergetics communications. 5th ed. , Steiger Druck GmbH. Axams, Austria. (2020).
  10. Jackson, C. B., et al. Mutations in SDHD lead to autosomal recessive encephalomyopathy and isolated mitochondrial complex II deficiency. Journal of Medical Genetics. 51 (3), 170-175 (2014).
  11. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, Clifton, N.J. 25-58 (2012).
  12. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  13. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and oxphos protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, Clifton, N.J. 31-70 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  15. García-Roche, M., Casal, A., Carriquiry, M., Radi, R., Quijano, C., Cassina, A. Respiratory analysis of coupled mitochondria in cryopreserved liver biopsies. Redox Biology. 17, 207-212 (2018).
  16. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 1-18 (2020).
  17. SUITBrowserWeb. , Available from: http://suitbrowser.oroboros.at/ (2021).
  18. Cell metabolism assay kits. Seahorse assay kits and media. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-lits-reagents-cell-assay-media (2021).
  19. Chance, B., Williams, G. R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature. 176 (4475), 250-254 (1955).
  20. Gnaiger, E., et al. Mitochondrial respiratory states and rates. MitoFit Preprint Arch. , (2019).
  21. Gnaiger, E. O2k-procedures: SOP O2k quality control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Section Page. Oroboros. 03 (18), http://wiki.oroboros.at/index.php/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP 1-21 (2020).
  22. Robinson, B. H., Petrova-Benedict, R., Buncic, J. R., Wallace, D. C. Nonviability of cells with oxidative defects in galactose medium: A screening test for affected patient fibroblasts. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 48 (2), 122-126 (1992).
  23. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  24. Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria. Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).
  25. Fasching, M., Gnaiger, E. O2k quality control 2: Instrumental oxygen background correction and accuracy of oxygen flux. Mitochondrial Physiology Network. 14 (06), 1-14 (2016).
  26. Gnaiger, E., Lassnig, B., Kuznetsov, A., Rieger, G., Margreiter, R. Excess capacity of cytochrome c oxidase. Journal of Experimental Biology. 1139, 1129-1139 (1998).
  27. Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. Life in the Cold. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).
  28. Fontana-Ayoub,, Fasching, M., Gnaiger, E. Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondrial Physiology Network. 02 (17), 1-9 (2014).
  29. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  30. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 163-181 (2014).
  31. Nászai, A., Terhes, E., Kaszaki, J., Boros, M., Juhász, L. Ca(2+)N it be measured? Detection of extramitochondrial calcium movement with high-resolution fluorespirometry. Scientific Reports. 9 (1), 1-13 (2019).
  32. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 234(2019).
  33. Mercier-Letondal, P., Marton, C., Godet, Y., Galaine, J. Validation of a method evaluating T cell metabolic potential in compliance with ICH Q2 (R1). Journal of Translational Medicine. 19 (1), 1-15 (2021).
  34. Sauerbeck, A., et al. Analysis of regional brain mitochondrial bioenergetics and susceptibility to mitochondrial inhibition utilizing a microplate based system. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 36-43 (2011).
  35. Jackman, M. R., Willis, W. T. Characteristics of mitochondria isolated from type I and type IIb skeletal muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 270 (2), 673-678 (1996).
  36. Ponsot, E., et al. Mitochondrial tissue specificity of substrates utilization in rat cardiac and skeletal muscles. Journal of Cellular Physiology. 203 (3), 479-486 (2005).
  37. Schönfeld, P., Reiser, G. Why does brain metabolism not favor burning of fatty acids to provide energy-Reflections on disadvantages of the use of free fatty acids as fuel for brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33 (10), 1493-1499 (2013).
  38. Calderon-Dominguez, M., Mir, J. F., Fucho, R., Weber, M., Serra, D., Herrero, L. Fatty acid metabolism and the basis of brown adipose tissue function. Adipocyte. 5 (2), 98-118 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 2014, 1-16 (2014).
  40. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  41. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), 21746(2011).
  42. Jordá, A., Zaragozá, R., Portolés, M., Báguena-Cervellera, R., Renau-Piqueras, J. Long-term high-protein diet induces biochemical and ultrastructural changes in rat liver mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 265 (2), 241-248 (1988).
  43. Jackson, C. B., Gallati, S., Schaller, A. QPCR-based mitochondrial DNA quantification: Influence of template DNA fragmentation on accuracy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (3), 441-447 (2012).
  44. Hirsch, H. M. Tissue autoxidation inhibitors: II. The presence of inhibitor in intact cells; Assay of liver and hepatoma effect on radio-oxidations. Cancer Research. 16 (11), 1076-1082 (1956).
  45. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), 18317(2011).
  46. Tanumihardja, E., Slaats, R. H., Van Der Meer, A. D., Passier, R., Olthuis, W., Van Den Berg, A. Measuring both pH and O2 with a single On-Chip sensor in cultures of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to track induced changes in cellular metabolism. ACS Sensors. 6 (1), 267-274 (2021).
  47. Harms, F., Stolker, R. J., Mik, E. Cutaneous respirometry as novel technique to monitor mitochondrial function: A feasibility study in healthy volunteers. PLoS ONE. 11 (7), 159544(2016).
  48. Levitsky, Y., et al. Micro-respirometry of whole cells and isolated mitochondria. RSC Advances. 9 (57), 33257-33267 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

HEK293 CRISPR
قياس التنفس عالي الدقة لتقييم الطاقة الحيوية في الخلايا والأنسجة باستخدام مقاييس التنفس القائمة على الغرفة والصفائح
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.