أصبح تقييم الفسفرة التأكسدية باستخدام مقاييس التنفس عالية الدقة جزءا لا يتجزأ من التحليل الوظيفي للميتوكوندريا واستقلاب الطاقة الخلوية. هنا ، نقدم بروتوكولات لتحليل استقلاب الطاقة الخلوية باستخدام مقاييس التنفس عالية الدقة القائمة على الغرفة والصفائح الدقيقة ونناقش الفوائد الرئيسية لكل جهاز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس التنفس عالي الدقة لتقييم الطاقة الحيوية في الخلايا والأنسجة باستخدام مقاييس التنفس القائمة على الغرفة والصفائح
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسمح قياس التنفس عالي الدقة (HRR) بمراقبة الفسفرة التأكسدية في الوقت الفعلي لتحليل حالات الطاقة الخلوية الفردية وتقييم مجمعات الجهاز التنفسي باستخدام بروتوكولات المعايرة بالتحليل الحجمي المتنوعة بين الركيزة وفك الاقتران (SUIT). هنا ، يتم توضيح استخدام جهازين لقياس التنفس عالي الدقة ، ويتم تقديم مجموعة أساسية من البروتوكولات المطبقة لتحليل الخلايا المستزرعة وألياف الهيكل العظمي وعضلة القلب والأنسجة الرخوة مثل الدماغ والكبد. يتم توفير بروتوكولات للخلايا والأنسجة المستزرعة لمقياس التنفس القائم على الغرفة والخلايا المستزرعة لمقياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة ، وكلاهما يشمل بروتوكولات التنفس القياسية. لأغراض المقارنة، يتم استخدام خلايا HEK293 المصممة من قبل كريسبر والتي تعاني من نقص في ترجمة الميتوكوندريا مما يسبب نقصا في الجهاز التنفسي المتعدد مع كلا الجهازين لإثبات العيوب الخلوية في التنفس. يسمح كل من مقياس التنفس بقياس شامل للتنفس الخلوي مع مزاياه التقنية وملاءمته اعتمادا على سؤال البحث والنموذج قيد الدراسة.
المقدمة
تفي الميتوكوندريا بتوفير الطاقة الرئيسي وهي عضية مجزأة تساهم في عمليات الطاقة الحيوية والتمثيل الغذائي الخلوية الأساسية مثل ابتنائية النيوكليوتيدات والدهون والأحماض الأمينية والتكوين الحيوي لعنقود الحديد والكبريت وتتورط في إشارات مثل موت الخلايا المتحكم فيه1،2،3 . تساهم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا من خلال الفسفرة التأكسدية في جميع العمليات الخلوية داخل الخلية تقريبا ، وبالتالي ، ترتبط اختلالات الميتوكوندريا ذات الأصل الأولي أو الثانوي بمجموعة واسعة من الحالات المرضية 4,5. خلل الميتوكوندريا لا ينطوي فقط على تغييرات في....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمجلس الوطني لاستعراض التجارب على الحيوانات والوكالة الإدارية الإقليمية للدولة لجنوب فنلندا. تم استخدام ذكور الفئران C57BL/6JOlaHsd (4-6 أشهر) في هذه الدراسة. تم الحصول على الموافقة على استخدام خطوط الخلايا البشرية من لجنة الأخلاقيات المؤسسية بجامعة هلسنكي.
1. قياس التنفس عالي الدقة: مقياس التنفس القائم على الغرفة (cHRR)
ملاحظة: تم إجراء التجارب في هذا القسم من البروتوكول باستخدام Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (جدول المواد)
- معايرة أجهزة استشعار الأكسجين
- أجهزة قياس التنفس قبل التشغيل عند 37 درجة مئوية في 2.1 مل من وسط ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، نقدم بروتوكولات لتحديد الطاقة الحيوية الميتوكوندريا في الخلايا حقيقية النواة ، والأنسجة غير الليفية (على سبيل المثال ، المخيخ) ، والأنسجة الليفية (على سبيل المثال ، العضلات الهيكلية). بالنسبة للخلايا حقيقية النواة ، تم قياس HEK293 مع ضربة قاضية هندسية من كريسبر من بروتينين مختلفين مرتبطين بترجمة الميتوكوندريا مما أدى إلى نقص OXPHOS متعدد (CRISPR KO1) ونقص حاد / كامل في OXPHOS (CRISPR KO2) إما باستخدام cHRR (الشكل 3A-C) أو mHRR (الشكل
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقليديا ، تمت دراسة الطاقة الحيوية الميتوكوندريا باستخدام أقطاب الأكسجين من نوع كلارك. غير أن الافتقار إلى القرار والإنتاجية يبرر التقدم التكنولوجي. حتى الآن ، تم اعتماد O2k (المشار إليه باسم cHRR) و Seahorse XF96 Flux Analyzer (المشار إليه باسم mHRR) على نطاق واسع في مجال الطاقة الحيوية الخلوية. هنا ، نقدم مجموعة مفهومة من البروتوكولات لتحليل استقلاب الطاقة الخلوية من خلال تقييم التنفس الميتوكوندريا باستخدام إما cHRR أو mHRR ، ومناقشة الفوائد الرئيسية لكل جهاز وتقديم إرشادات عملية. وتشمل البروتوكولات المقدمة هنا خلايا ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بتمويل من أكاديمية فنلندا (C.B.J) ، ومؤسسة Magnus Ehrnroot (C.B.J) ، وزمالة الدكتوراه من كلية الدراسات العليا المتكاملة لعلوم الحياة (R.A).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2 مل Potter-Elvehjem Glass / PTFE طاحونة مناديل / خالط | أومني إنترناشيونال | 07-358029 | |
| 95٪ O2< / sub> ، 5٪ CO2< / sub> خليط | بوتر لطحن الأنسجة | ||
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | |
| Chemical Ascorbate | Merck | PHR1279-1G | كيميائي ، يذوب في الإيثانول |
| BSA (خالي من الدهون acid) | Sigma | A 6003 | كيميائي |
| CaCO3< / sub> | Sigma | C 4830 | السيتوكروم الكيميائي |
| C Sigma | C 7752 | Digitonin الكيميائي | |
| Sigma | D 5628 | الكيميائية | |
| Dithiothreitol | Sigma | D 0632 | الكيميائية ، يذوب في DMSO |
| D-Sucrose | Roth | 4621.1 | |
| Dulbecco الكيميائي s النسر المعدل s متوسط (نسبة عالية من الجلوكوز) | فيشر سيانتيفك | 41965-039 | |
| Dulbecco الكيميائي s النسر المعدل s متوسط (بدون جلوكوز) | فيشر ساينتفيك | A14430-01 | |
| EGTA | Sigma | E 4378 | |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | Chemical |
| Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي | فيشر Scientific | AM12500 | Chemical |
| Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | فيشر Scientific | AM12501 | |
| FCCP | Sigma | C 2920 | |
| الجلوكوز | سيجما | G7021 | الكيميائية ، تذوب في الإيثانول |
| الغلوتامات | Sigma | G 1626 | الكيميائية |
| GlutaMax ؛ ( 100x) (200 نانومتر L-alanyl-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد) | فيشر 35050061 | كيميائي | |
| خلايا HEK293 | ATTC | CRL-1573 | |
| مقياس الدم | فيشر Scientific | 0267151B | أداة لعد الخلايا |
| Hepes | Sigma | H 7523 | الكيميائية |
| Imidazole | Fluka | 56750 | الكيميائية |
| KCl | Merck | 1.04936 | كيميائي |
| L-carnitine | Sigma | C0283 | كيميائي |
| Malate | Sigma | M 1000 | كيميائي |
| MES هيدرات | سيجما | M8250 | كيميائي |
| MgCl2< / sub> | سيجما | M 9272 | كيميائي |
| Na2< / sub>ATP | Sigma | A 2383 | Chemical |
| Na2 فوسفوكرياتين | سيجما | P 7936 | كيميائي |
| Na-pyruvate ( 100 م) (100 ضعف) | فيشر 11360070 | ||
| NEAA ( الأحماض الأمينية غير الأساسية) 100x | فيشر 11140035 | ||
| العادي FBS ( 10x) | Fisher Scientific | 10500064 | |
| O2< / sub>k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | أداة قياس التقييس عالية الدقة |
| O2< / sub>k-المعايرة بالتحليل الحجمي | Oroboros Instruments | 20820-03 | محاقن هاميلتون للحقن الكيميائي |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | الكيميائية ، تذوب في الإيثانول |
| Palmitoylcarnitine | Sigma | P 4509 | |
| البنسلين الستربتومايسين | فيشر 15140122 | ||
| بيرس BCA فحص البروتين | كيت فيشر Scientific | 23227 | |
| Pyruvate | Sigma | P 2256 | الكيميائية |
| RIPA-Buffer | Fisher Scientific | 89900 | الكيميائية |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | كيميائي ، يذوب في الإيثانول |
| Saponin | Sigma | S7900 | Chemical |
Seahorse XF DMEM حزمة متوسطة ، درجة الحموضة 7.4 | Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا | 103680-100 | |
| Seahorse XFe96 محلل التدفق خارج | الخلية Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا | أداة قياس إعادة التدفق عالية الإنتاجية | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent، Santa Clara، CA | br/> يتضمن لوحات الفحص والخراطيش وأدلة التحميل لنقل المركبات إلى خرطوشة الفحص ومحلول العيار. | |
| مقص صغير | فيشر ساينتيك | 08-951-20 | |
| أزيد الصوديوم | سيجما | S2002 | كيميائي |
| سكسينات | سيجما | S 2378 | التورين الكيميائي |
| سيجما | T 8691 | الكيميائية | |
| TMPD | Sigma | T 3134 | محلول كيميائي |
| تريبان أزرق | ميرك | 72-57-1 | كيميائي |
| التربسين 0.25٪ EDTA | فيشر العلمي | 25200056 | |
| ملقطان رفيعان | الحواف فيشر Scientific | 12-000-122 | |
| مخزون يوريدين (500x) | Sigma | U3750 | Chemical |
المراجع
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
- Spi....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
