يقدم هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية لإجراء فحص بصمة الالتصاق لتصوير أحداث التصاق أثناء التصاق سريع بالخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الالتصاق الجزيئي في الخلية المتداول بواسطة Adhesion بصمة المقايسة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التصاق المتداول ، الذي تسهله التفاعلات بوساطة selectin ، هو حركة ديناميكية وسلبية للغاية في تجنيد الكريات البيض إلى موقع الالتهاب. تحدث هذه الظاهرة في عدد الخلايا الجنوية بعد الشعيرات الدموية ، حيث يدفع تدفق الدم الكريات البيض في حركة متجددة على الخلايا البطانية. يتطلب المتداول المستقر توازنا دقيقا بين تكوين رابطة التصاق وانفصالها المدفوع ميكانيكيا ، مما يسمح للخلية بالبقاء ملتصقة بالسطح أثناء الدوران في اتجاه التدفق. وخلافا لعمليات الالتصاق الأخرى التي تحدث في بيئات ثابتة نسبيا، الالتصاق المتداول ديناميكية للغاية كما الخلايا المتداول السفر عبر الآلاف من ميكرون في عشرات ميكرون في الثانية الواحدة. وبالتالي، فإن أساليب علم الأحياء الميكانيكية التقليدية مثل المجهر قوة الجر غير مناسبة لقياس أحداث الالتصاق الفردية والقوى الجزيئية المرتبطة بها بسبب النطاق الزمني القصير والحساسية العالية المطلوبة. هنا، ونحن نصف لدينا أحدث تنفيذ قياس بصمة الالتصاق لتصوير P-selectin: PSGL-1 التفاعلات في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي. تستخدم هذه الطريقة الحبال مقياس التوتر المستندة إلى الحمض النووي لا رجعة فيه لإنتاج تاريخ دائم من أحداث الالتصاق الجزيئي في شكل مسارات مضان. يمكن تصوير هذه المسارات بطريقتين: (1) خياطة الآلاف من الصور المحدودة الحيود لإنتاج مجال رؤية كبير ، مما يتيح استخراج بصمة التصاق لكل خلية متجددة على آلاف الميكرونات في الطول ، (2) أداء DNA-PAINT لإعادة بناء صور فائقة الدقة للمسارات الفلورية داخل مجال صغير من الرؤية. في هذه الدراسة، تم استخدام فحص بصمة الالتصاق لدراسة خلايا HL-60 المتداول في ضغوط القص المختلفة. وبذلك، تمكنا من تصوير التوزيع المكاني ل P-selectin: تفاعل PSGL-1 واكتساب نظرة ثاقبة على قواهم الجزيئية من خلال كثافة الفلورسينس. وهكذا، توفر هذه الطريقة الأساس للتحقيق الكمي لمختلف التفاعلات بين الخلايا والسطح المشاركة في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي.
المقدمة
تصف سلسلة التصاق المتداول كيف ترتبط الخلايا المتداولة بحائط الأوعية الدموية ولفه على طوله1. يتم التوسط في المقام الأول المتداول السلبي من قبل selectins ، وهي فئة رئيسية من جزيئات الالتصاق الخلوي (CAMs)1. تحت تدفق القص من الدم، الكريات البيض التعبير عن P-selectin جليكبروتين ليغند-1 (PSGL-1) تشكل روابط عابرة للغاية مع P-selectin، والتي يمكن التعبير عنها على سطح الخلايا البطانية الملتهبة. هذه العملية حاسمة بالنسبة للخلايا البيض للهجرة إلى موقع الالتهاب2. وبالإضافة إلى ذلك، سان جيرمان-1 هو أيضا مستقبلات حساسة ميكانيكية قادرة على تحريك مرحلة الالتصاق الشركة اللاحقة من سلسلة التصاق المتداول عند مشاركتها....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الوسم Oligonucleotide والتهجين
- تخفيض الروابط ثنائي كبريتيد البروتين G
- حل 10 ملغ من البروتين G (ProtG) في 1 مل من المياه فائقة البور.
ملاحظة: يتم تعديل البروتين G هنا مع بقايا السيستين واحد في C-terminus وعلامة بولي هيستيدين N-terminus. - تبادل المخزن المؤقت ≥20 ميكرولتر من ProtG (10 ملغم / مل) إلى 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) مع عمود P6.
- قياس تركيز البروتين بعد تبادل العازلة.
ملاحظة: تركيز نموذجي من 7-8 ملغم / مل. - إعداد 120 mM تريس (2-carboxyethyl)فوسفين (TCEP) عن طريق حل 3 ملغ من TCEP إلى 90 ميكرولتر من 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) تليها 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
ملاحظة: يجب أن تكون TCEP معدة حد....
- حل 10 ملغ من البروتين G (ProtG) في 1 مل من المياه فائقة البور.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف البروتوكول أعلاه الإجراء التجريبي لمقايسة بصمة الالتصاق. يوضح سير عمل التجربة العامة في الشكل 1، بدءا من تجميع غرفة التدفق (الشكل 1A) إلى التشغيل السطحي (الشكل 1B) وخطوات التجربة والتصوير (الشكل 1C).
الشكل 2 هو نتيجة تمثيلية لتوصيف التكيف البيولوجي ProtG-ssDNA. تم جمع أطياف الأشعة فوق البنفسجية / الفيس المكونة من ثلاثة مكونات في المنتج النهائ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتيح فحص بصمة الالتصاق تصور أحداث التصاق الجزيئي بين PSGL-1 و P-selectin أثناء التصاق التدحرج الخلوي. يتم بدء هذه العملية عن طريق التقاط P-selectin بوساطة تليها المتداول تحت إجهاد القص السائل. عادة ما تنطوي المشكلات المحتملة أثناء التجربة على مسارات فلورية ضعيفة أو مفقودة حتى عندما تتدحرج الخلايا بشكل جيد. غالبا ما تنتج هذه المشاكل من عناصر تحكم الجودة في الخطوات الهامة في البروتوكول كما هو مذكور في جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1).
الجزيئات الحيوية والمخازن المؤقتة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الكندية للابتكار (CFI 35492)، ومجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا منحة ديسكفري (RGPIN-2017-04407)، وصندوق الحدود الجديدة في البحوث (NFRFE-2018-00969)، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (SCH-2020-0559)، وصندوق جامعة كولومبيا البريطانية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الحفر 4 قنوات | 3D مطبوع مع ABS خيوط | ||
| 4 ثقوب الشريحة | الحفر المجهر نظيفة الشريحة باستخدام Dremel مع لقم الثقب المطلي بالماس على دليل الحفر 4 قنوات الذي يحتوي على تخطيط يتطابق مع مراكز 8-32 ثقوب ملولبة على مشبك الألومنيوم. | ||
| أكريليك Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| مصنوع حسب الطلب | قطع كتلتين من صفائح الأكريليك بأبعاد 40 مم × 30 مم × 2.5 مم. في كل كتلة ، قم بحفر فتحتين مقاس 3 مم تتماشى بدقة مع 4-40 ثقبا على حامل الألومنيوم. | ||
| حامل رقاقة الألومنيوم | مصنوعة حسب الطلب | كتلة الألومنيوم المؤكسد في حامل على شكل حرف C بأبعاد خارجية تبلغ 640 مم × 500 مم × 65 مم وأبعاد الافتتاح 400 مم × 380 مم × 65 مم. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| محلول مضاد حيوي / مضاد للفطريات | Cytiva HyClone | SV3007901 | قلم / Strep / Fungiezone |
| الخرز ، البوليسترين المطلي | بProtG Spherotech | PGP-60-5 | |
| مصل الأبقار ألبومين | VWR | 332 | |
| Buffer ، DNA PAINT | 0.05٪ Tween-20 ، 5 ملي متر تريس ، 75 ملي مولار MgCl2< / فرعي > ، 1 ملي مولار EDTA | ||
| Buffer ، T50M5 | 10 ملي تريس ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار MgCl 2< / sub> | ||
| Buffer ، Rolling | HBSS مع 2 ملي مولار CaCl 2< / sub> ، 2 ملي مولار MgCl 2< / sub > ، 10 ملي هيبس ، 0.1٪ BSA | ||
| Buffer ، غسل | 10 ملي تريس ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار MgCl 2< / sub > و 2 ملي مولار CaCl 2< / sub> ، 0.05٪ Tween 20 | ||
| كلوريد الكالسيوم | VWR | BDH9224 | |
| قوارير ثقافة الخلايا | VWR | 10062-868 | |
| حامض الكبريتيك المركز | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98٪ |
| ملاقط محملة | Techni-Tool | 758TW150 | |
| مثقاب مطلي بالماس بت | تقنية جلخ | C5250510 | 0.75 مم الحمض النووي لحفر الماس |
| ، أمين ssDNA (حبلا علوي) | IDT DNA | مخصص oligo | CCGGGCGACGCAGGGGGG / 3AmMO / |
| DNA ، البيوتين - SSDNA (حبلا سفلي) | IDT DNA | مخصص oligo | / 5BiotinTEG / TTTTT CCCTCCTGCGTCGGCCGG |
| DNA ، حبلا تصوير ل DNA-PAINT | IDT DNA | مخصص oligo | GAGGGAAA TT / 3Cy3Sp / |
| الحمض النووي ، حبلا تصوير لوضع العلامات الدائمة | IDT DNA | مخصص oligo | CCGGGCGACGCAGG / 3Cy3Sp / |
| شريط على الوجهين | سكوتش | 237 | 3/4 بوصة عرض ، شريط دائم على الوجهين |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 |
| إيبوكسي | غوريلا | 42001 | 5 دقائق وقت المعالجة |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | أفانتور | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| حمض الخليك الجليدي | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass ، Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass ، شريحة المجهر | VWR | 48300-026 | 75 مم × 25 مم × 1 مم |
| زجاج ، جرة تلطيخ | VWR | 74830-150 | جرة تلطيخ ويتون (900620) |
| محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| مقياس الدم | سيجما ألدريتش | Z359629-1EA | |
| HL-60 خلايا | ATCC | CCL-240 | |
| شريحة غرفة الرطوبة | مخصص | 3D مطبوعة مع خيوط ABS | |
| بيروكسيد الهيدروجين | VWR | BDH7690-1 | 30٪ |
| إيميدازول | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| مداخل / منافذ حفر | مخصص | من خلال ثمانية مسامير 8-32 مجموعة باستخدام لقم الثقب الكوبالت. إدراج 1.5 سم أنابيب البولي إيثيلين (Tygon ، معرف 1/32 "OD 3/32") في كل مسمار جوفاء | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| كلوريد المغنيسيوم | VWR | BDH9244 | |
| حبات Ni-NTA المغناطيسية | Invitrogen | 10103D | |
| أنابيب البريد EMS | EMS71406-10 | ||
| ميثانول | VWR | أعمدة جل BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| هيدروكسيد البوتاسيوم | VWR | 470302-132 | |
| بروتين ، بروتين G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag و C-terminal |
| بروتين السيستين ، P-selectin-Fc | R & نظام D | 137-PS | المؤتلف البشري P-Selectin / CD62P Fc الوهم البروتين ، |
| CF البروتين ، Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| مضخة حقنة | هارفارد | 704801 | |
| بيكربونات الصوديوم | ' s Science | 470302-444 | |
| كلوريد الصوديوم | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| حقنة | هاميلتون | 81520 | محاقن مع قفل لوير PTFE ، 5 مل |
| إبر حقنة | BD | 305115 | Precision Glide 26 G ، 5/8 بوصة طول |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| ، محول | Tygon | ABW00001 | الصيغة 3350 ، معرف 1/32 بوصة ؛ OD 3/32 " |
| الأنابيب ، البولي إيثيلين | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) ID 0.38mm ؛ OD 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
المراجع
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Revie....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
