طريقة استخراج غير متحللة لتوصيف التركيب الجزيئي لجزيئات الجليكوجين البكتيرية

Jun-Jiao Wang; Meng-Meng Wang; You-Wei He; Zhang-Wen Ma; Zi-Yi Wang; Rui Qiao; Xin-Le Tan; Qing-Hua Liu; Liang Wang

doi:10.3791/63016

Method Article

طريقة استخراج غير متحللة لتوصيف التركيب الجزيئي لجزيئات الجليكوجين البكتيرية

DOI:

10.3791/63016

⸱

February 18th, 2022

Jun-Jiao Wang*¹ , Meng-Meng Wang*²^,³ , You-Wei He⁴ , Zhang-Wen Ma²^,³ , Zi-Yi Wang⁵^,⁶^,⁷ , Rui Qiao²^,³ , Xin-Le Tan⁵^,⁶ , Qing-Hua Liu⁸ , Liang Wang¹^,²

¹Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, ²Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, ³Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, ⁴Department of Biological Sciences, School of Life Sciences, Xuzhou Medical University, ⁵School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, ⁶Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, ⁷Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, ⁸State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicines, Macau University of Science and Technology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتأثر هيكل الجليكوجين البكتيري بشكل كبير بطرق الاستخراج التي قد تؤدي إلى التحلل الجزيئي و / أو أخذ العينات المتحيزة. من الضروري تطوير طرق لتقليل هذه المشاكل. هنا ، تمت مقارنة أربع طرق استخراج باستخدام توزيع الحجم وتوزيع طول السلسلة كمعايير رئيسية لتقليل القطع الأثرية الاستخراج.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاليا ، توجد مجموعة متنوعة من طرق استخراج الجليكوجين ، والتي إما تلحق الضرر بالبنية المكانية للجليكوجين أو تستخرج الجليكوجين جزئيا فقط ، مما يؤدي إلى التوصيف المتحيز للبنية الجزيئية الدقيقة للجليكوجين. لفهم التغيرات الديناميكية لهياكل الجليكوجين والوظائف المتنوعة لجزيئات الجليكوجين في البكتيريا ، من الضروري عزل الجليكوجين بأقل قدر من التدهور. في هذه الدراسة ، تم عرض طريقة عزل الجليكوجين الخفيفة باستخدام ترسيب الماء البارد (CW) عبر الطرد المركزي الفائق لتدرج كثافة السكر (SDGU-CW). كما تم إجراء طريقة حمض ثلاثي كلورو أسيتيك التقليدية (TCA) وطريقة هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) للمقارنة. تم استخدام سلالة معملية شائعة الاستخدام ، الإشريكية القولونية BL21 (DE3) ، ككائن حي نموذجي في هذه الدراسة لأغراض العرض التوضيحي. بعد استخراج جزيئات الجليكوجين باستخدام طرق مختلفة ، تم تحليل هياكلها ومقارنتها من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لتوزيع حجم الجسيمات والرحلان الكهربائي الشعري بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتوزيعات طول السلسلة الخطية. وأكد التحليل أن الجليكوجين المستخرج عن طريق SDGU-CW كان له تحلل ضئيل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجليكوجين عبارة عن عديد السكاريد شديد التفرع يتكون من بقايا الجلوكوزيل وأيضا كمية صغيرة ولكنها كبيرة من البروتينات ، حيث ترتبط جميع بقايا الجلوكوزيل معا عبر روابط α-1،4-جليكوسيدية في سلاسل خطية وروابط α-1،6-جليكوسيدية عند نقاط التفرع¹. ينقسم هيكل جزيئات الجليكوجين بشكل عام إلى ثلاثة تسلسلات هرمية: 1) قلة قليلة السلسلة قصيرة السلسلة ، 2) جزيئات β كروية (قطرها ~ 20 نانومتر) ، و 3) جزيئات α كبيرة على شكل وردة مجمعة معا بواسطة β جسيمات ، يتراوح قطرها تقريبا حتى 300 نانومتر. في الآونة الأخيرة ، وجد أن جزيئات الجليكوجين α لها حالتان هيكليتان في حقيقيات النوى ، أي حالة هشة وحالة مستقرة. هنا ، تعني الهشاشة تفكك جسيمات α الأكبر إلى جزيئات β أصغر في وجود عامل فوضوي مثل DMSO². وجدت تحليلات أخرى أن جزيئات الجليكوجين α في الكبد السكري هشة^{باستمرار 3} وأن جزيئات α الهشة تتحلل بشكل أسرع بكثير من جزيئات α^{المستقرة 4}. وبالتالي ، فإن الهشاشة الهيكلية للجليكوجين قد تؤدي إلى تفاقم حالات ارتفاع السكر في الدم في مرض السكري²^،⁴ ، مما يجعل الجسيمات α الهشة مؤشرا حيويا مرضيا محتملا لمرض السكري على المستوى الجزيئي. ومع ذلك ، يتم الإبلاغ عن وجود جزيئات الجليكوجين α في بدائيات النوى بشكل متقطع^{فقط 5} ، ولا يوجد تقرير عن حالتين هيكليتين مختلفتين لجزيئات الجليكوجين α في البكتيريا.

من أجل فهم الوظائف الفسيولوجية لجزيئات الجليكوجين البكتيرية ، من الضروري تحديد البنية الدقيقة لجزيئات الجليكوجين ، الأمر الذي يتطلب عزل الجليكوجين مع أقصى عائد والحد الأدنى من التحلل¹. حتى الآن ، تم تطوير تقنيات مختلفة لاستخراج الجليكوجين ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر استخراج الماء الساخن ، واستخراج حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) ، واستخراج القلويات الساخنة (هيدروكسيد البوتاسيوم ، KOH)⁶. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن طريقة أخرى شائعة الاستخدام لعزل الجليكوجين حقيقيات النواة ، وهي طريقة الطرد المركزي الفائق لتدرج كثافة السكر (SDGU) ، لعزل الجليكوجين البكتيري في Selenomonas ruminantium و Fibrobacter succinogenes⁷^،⁸. على الرغم من أن إيجابيات وسلبيات هذه الطرق قد تمت مناقشتها على نطاق واسع في دراسات حقيقية النواة⁹^،¹⁰ ، إلا أنه نادرا ما تكون هناك دراسات مقارنة للهياكل الدقيقة للجليكوجين المعزولة عبر طرق استخراج مختلفة في البكتيريا من منظور هياكل جزيئات الجليكوجين.

في هذه الدراسة ، تمت معالجة هذه المشكلة باستخدام الإشريكية القولونية BL21 (DE3) ككائن حي نموذجي. تمت مقارنة ما مجموعه أربع طرق لاستخراج الجليكوجين ، وهي استخراج الماء الساخن المترسب ب TCA (TCA-HW) ، واستخراج الماء البارد المترسب ب TCA (TCA-CW) ، واستخراج محلول KOH الساخن بنسبة 30٪ (KOH-HW) ، واستخراج الماء البارد باستخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج بكثافة السكروز (SDGU-CW). ثم تم قياس توزيع حجم جسيمات الجليكوجين عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) بينما تم الكشف عن توزيع طول السلسلة عن طريق الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) ، وكلاهما تم استخدامه لتقييم جودة طرق الاستخراج. بالإضافة إلى ذلك ، تمت أيضا مقارنة استقرار وهشاشة جزيئات الجليكوجين البكتيرية α بين طرق الاستخراج المختلفة من خلال مقارنة توزيع حجم الجسيمات قبل وبعد المعالجة بعامل الفوضوة شائع الاستخدام ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يتم عرض الإجراءات التفصيلية لاستخراج الجليكوجين والتوصيف الهيكلي أدناه. باختصار ، فإن طريقة SDGU-CW لها أفضل تأثير عام من حيث السلامة الهيكلية للجليكوجين ، وبالتالي يوصى بها لاستخراج الجليكوجين البكتيري في الدراسات المستقبلية ذات الصلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة البكتيريا وجمعها

إنعاش الإشريكية القولونية BL21 (DE3) من مخزون الجلسرين البكتيري (-80 درجة مئوية) عن طريق تلقيح صفيحة أجار LB المعقمة (10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر مستخلص الخميرة ، 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، و 15 جم / لتر أجار). ضع الطبق في حاضنة قياسية وازرعه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
التقط مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في وسط سائل معقم 10 مل (10 جم / لتر من التربتون ، و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم). تخلط جيدا عن طريق الدوامة والثقافة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 220 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: ما لم ينص على خلاف ذلك ، كانت جميع ظروف الاستزراع السائل 37 درجة مئوية بمعدل اهتزاز 220 دورة في الدقيقة.
انقل 1 مل من ثقافة الإشريكية القولونية طوال الليل إلى 100 مل من وسط السائل المعقم LB وزراعته لمدة 5 ساعات. نقل 50 مل إلى 1 لتر من 1 × M9 الحد الأدنى من الوسط (3 جم / لتر KH₂PO₄ ، 0.5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 6.78 جم / لتر Na₂HPO₄ ، و 1 جم / لتر NH₄Cl) تحتوي على 0.8٪ D- (+) - جلوكوز. تخلط جيدا وتزرع لمدة 20 ساعة.
ملاحظة: تم تعقيم 1x M9 الحد الأدنى من الوسط والجلوكوز بشكل منفصل ثم خلطها عند التبريد إلى درجة حرارة الغرفة بشكل معقم.
بعد الزراعة لمدة 20 ساعة ، محلول بكتيري بجهاز الطرد المركزي عند 6,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. قم بتخزين حبيبات الخلية عند -80 درجة مئوية طوال الليل ثم جفف الحبيبات بالتجميد.
قم بإغلاق وتخزين المسحوق البكتيري المجفف بالتجميد في الثلاجة (-20 درجة مئوية) لاستخدامه لاحقا.

2. استخراج الجليكوجين

استخراج الماء الساخن المترسب بحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA-HW)
1. قم بوزن 500 مجم بدقة من مسحوق الإشريكية القولونية BL21 (DE3) المجفف بالتجميد وأعد تعليقه في 20 مل من محلول ثلاثي الإيثانول أمين (TEA) المثلج 0.05 M. استخدم كسارة الخلايا بالموجات فوق الصوتية (25٪ طاقة ، 4 درجات مئوية) لتعطيل الخلايا البكتيرية لمدة 3 دقائق (دورات عمل 30 ثانية وفواصل زمنية 2 ثانية). تأكد من عدم وجود كريات واضحة في المحلول.
  ملاحظة: تم تعطيل الخلية على الجليد. اضبط درجة الحموضة في المخزن المؤقت TEA على الرقم الهيدروجيني 7 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
2. انقل كل التجانس البكتيري إلى أنبوبين فائق الطرد المركزي سعة 10.4 مل (10 مل / أنبوب). املأ الأنابيب بالماء منزوع الأيونات إلى الأعلى ، وجهاز الطرد المركزي عند 104,000 × جم في جهاز طرد مركزي فائق عند 4 درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. تخلص من المادة الطافية.
3. أضف 2 مل من الماء منزوع الأيونات لإعادة تعليق الحبيبات في كل أنبوب. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وأضف الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي البالغ 20 مل. يسخن ويغلى لمدة 5 دقائق لتغيير طبيعة جميع البروتينات.
4. جهاز الطرد المركزي للتعليق لمدة 10 دقائق عند 18,000 × جم واحتفظ بالمادة الطافية (S1). تعامل مع الراسب بنفس الطريقة كما في الخطوة 2.1.3. اجمع المادة الطافية الجديدة (S2) مع S1.
5. أضف 50٪ TCA (0.1 حجم) إلى المادة الطافية (S1 + S2) وضع الخليط على الجليد لمدة 10 دقائق لترسيب الجزيئات الكبيرة مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات وما إلى ذلك. قم بالطرد المركزي للخليط عند 18,000 × جم لمدة 10 دقائق واخلط المادة الطافية مع 1.5 حجم من الإيثانول المطلق.
  ملاحظة: تركيز TCA هو 50٪ v / v. للتخزين ، احتفظ به بعيدا عن الضوء.
6. قم بترسيب الجليكوجين على الجليد لمدة 20 دقيقة وجهاز الطرد المركزي عند 18,000 × جم لمدة 10 دقائق. اسكب المادة الطافية.
7. قم بإذابة الحبيبات في 5 مل من ddH₂O ، ثم أضف 5 مل من الإيثانول المطلق المثلج. احتضان المحلول طوال الليل عند 4 درجات مئوية وجهاز الطرد المركزي عند 18,000 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات.
8. كرر خطوات "الغسيل وهطول الأمطار" كما في الخطوة 2.1.7 مرتين أخريين.
9. أخيرا ، قم بإذابة الجليكوجين المترسب في 400 ميكرولتر من ddH₂O في أنبوب سعة 2 مل ، وقم بالتجميد مسبقا عند -80 درجة مئوية ، وجففه بالتجميد للحصول على مسحوق الجليكوجين الجاف.
استخراج الماء البارد المترسب بحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA-CW)
ملاحظة: طريقة TCA-CW هي نفس طريقة TCA-HW باستثناء أنه بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بمعالجة الحبيبات بدون غليان (انظر الخطوة 2.1.3) وأعد تعليقها في 20 مل من ddH₂O تحتوي على 1 مجم / مل كوكتيل مثبط للبروتياز.
1. لتحضير محلول كوكتيل مثبط للبروتياز 1 مجم / مل ، قم بإذابة 50 مجم من كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني في 1 مل من الماء منزوع الأيونات وتخفيفه بنسبة 50: 1 (ماء منزوع الأيونات: محلول كوكتيل مثبط للبروتين).
استخراج الماء البارد باستخدام الطرد المركزي الفائق المتدرج بكثافة السكروز (SDGU-CW)
1. قم بإذابة وتجانس 1 جم من مسحوق الإشريكية القولونية المجففة بالتجميد في 4 مل من محلول استخلاص الجليكوجين (GEB) مع كوكتيل مثبط للبروتاز 1 مجم / مل.
  ملاحظة: يتكون GEB من 50 ملي مولار تريس ، و 150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2 ملي مولار EDTA ، و 50 ملي مولار من NaF ، و 5 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم. يجب تعديل GEB إلى درجة الحموضة 8 مع حمض الهيدروكلوريك.
2. استخدم كسارة الخلايا بالموجات فوق الصوتية (25٪ طاقة ، 4 درجات مئوية) لتعطيل الخلايا البكتيرية لمدة 3 دقائق (دورات عمل 8 ثوان وفواصل زمنية 9 ثوان). تأكد من تنفيذ العملية برمتها على الجليد. بعد الصوتنة ، انقل التجانس البكتيري إلى أنبوب الطرد المركزي ، واملأه ب GEB إلى حجم نهائي يبلغ 10 مل ، وقم بتدوير الأنبوب للخلط.
  ملاحظة: لا تتجانس لفترة طويلة لأن الحرارة المتولدة قد تتحلل الجليكوجين.
3. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي فائق سعة 10.4 مل ، واملأ الأنبوب إلى الأعلى باستخدام GEB ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 360.000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
  ملاحظة: تأكد من ملء الأنبوب وعدم وجود فقاعات هواء.
4. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي وأعد تعليق الراسب ب 2 مل من الماء منزوع الأيونات.
5. في أنبوب جديد للطرد المركزي ، ضع طبقة ببطء 4 مل من محلول السكروز بنسبة 75٪ مع 4 مل من محلول السكروز بنسبة 37.5٪. بعد ذلك ، ضع طبقة من التعليق الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2.3.4 فوق محلول السكروز ، وقم بتغطيتها بالماء منزوع الأيونات (انظر الشكل 1).
  ملاحظة: تركيز السكروز هو 75٪ [v / v] و 37.5٪ [v / v]. كن حذرا عند جعل تدرج كثافة السكروز وتأكد من وجود طبقات يمكن ملاحظتها بين محلولي السكروز. تأكد أيضا من عدم وجود فقاعات هواء في أنبوب الطرد المركزي الفائق.
6. جهاز الطرد المركزي عند 360,000 × جم لمدة 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. قم بإذابة الحبيبات في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول المطلق لترسيب الجليكوجين.
7. ترسيب الجليكوجين عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
8. قم بإذابة الحبيبات الناتجة في 400 ميكرولتر من ddH₂O في أنبوب 2 مل ، وقم بالتجميد المسبق عند -80 درجة مئوية ، وجففها بالتجميد للحصول على مسحوق الجليكوجين الجاف. الحفاظ على مسحوق الجليكوجين الجاف عند 4 درجات مئوية للتحليل الهيكلي.
  ملاحظة: الإجراء التفصيلي موضح في الشكل 1.
استخراج محلول هيدروكسيد البوتاسيوم الساخن 30٪ (KOH-HW)
1. قم بغلي مسحوق الإشريكية القولونية المجففة بالتجميد (50 مجم) في 1 مل من 30٪ [وزن / حجم] KOH لمدة 1 ساعة.
2. أضف 67٪ [v / v] الإيثانول الذي يحتوي على 15 ملي مولار LiCl لهطول الأمطار عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. جهاز الطرد المركزي للعينات عند 16,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  ملاحظة: يحتوي 67٪ [v / v] من الإيثانول مع 15 ملي مولار LiCl على 0.6358 جم LiCl و 67 مل من الإيثانول المطلق و 33 مل من الماء منزوع الأيونات.
3. أعد إذابة الكريات في 1 مل من ddH₂O وسخنيها لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية مع التحريك المتقطع.
4. كرر خطوة ترسيب الإيثانول ثلاث مرات أخرى كما هو موضح في الخطوة 2.4.2. أعد إذابة الحبيبات النهائية في 400 ميكرولتر من ddH₂O في أنبوب 2 مل ، وقم بالتجميد مسبقا عند -80 درجة مئوية ، وجففها بالتجميد للحصول على مسحوق الجليكوجين الجاف.

3. تحديد هيكل الجليكوجين

الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM)
1. أعد تعليق مسحوق الجليكوجين في محلول ملحي مخزن بمقدار 50 ملي مولار (درجة الحموضة 7) بتركيز نهائي يبلغ 1 مجم / مل.
2. قم بعمل تخفيف 10 أضعاف للتعليق وقم بتطبيق التعليق المخفف على الشبكة النحاسية ذات التفريغ المتوهج 400 شبكة.
3. بعد دقيقتين ، اسحب العينة الزائدة من الشبكة باستخدام ورق ترشيح وصمة عار على الشبكة ب 2-3 قطرات من أسيتات اليورانيل بنسبة 1٪.
4. استخدم مجهر إلكتروني ناقل حركة يعمل عند 75 كيلو فولت لفحص المستحضرات.
كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)
1. تحضير المرحلة المتنقلة: تحضير محاليل أزيد الصوديوم 0.02٪ (وزن / وزن) و 50 ملي مولار نترات الصوديوم في الماء منزوع الأيونات ، والترشيح من خلال غشاء مرشح 0.45 ميكرومتر. استخدم الحمام المائي المتذبذب بالموجات فوق الصوتية لصوتنة المحلول لأكثر من 15 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
2. تحضير العينة: استخدم المرحلة المتنقلة لإذابة مسحوق الجليكوجين بحيث يكون التركيز النهائي 1 مجم / مل. احتضان المحلول عند 80 درجة مئوية طوال الليل في خلاط حراري. قم بالطرد المركزي للعينة الذائبة عند 6,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونقل المادة الطافية إلى قارورة SEC قياسية.
3. تحضير عينات الجليكوجين المعالجة ب DMSO
  1. قم بإذابة 1 مجم من مسحوق الجليكوجين في 300 ميكرولتر من DMSO واحتضانه عند 80 درجة مئوية طوال الليل في خلاط حراري. أضف 4 أضعاف حجم الإيثانول لترسيب الجليكوجين والطرد المركزي للمحلول عند 6,000 × جم.
  2. اغسل الحبيبات مرتين بالإيثانول ، وقم بإذابة الحبيبات في ddH₂O وقم بتجميدها.
  3. قم بتحليل مسحوق الجليكوجين المجفف بالتجميد عبر SEC عن طريق تحضير عينات كما هو موضح أعلاه.
4. استخدم نظام SEC مع الأعمدة المسبقة ، و 1000 و 10000 عمود لتحليل توزيع حجم جسيمات الجليكوجين. حافظ على الأعمدة عند 80 درجة مئوية ومعدل التدفق عند 0.3 مل / دقيقة.
الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE)
1. تفرع الجليكوجين
  ملاحظة: عند استخدام FACE للكشف عن توزيع طول السلسلة (CLD) ، يجب أن تخضع جميع العينات المراد اختبارها للمعالجة المسبقة لإزالة الفروع.
  1. أضف 0.5 مجم من مسحوق الجليكوجين ، و 90 ميكرولتر من الماء الساخن (90 درجة مئوية) ، و 1.5 ميكرولتر من محلول NaN₃ ، و 3.5 ميكرولتر من الأيزواميليز (200 وحدة / مل) ، و 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحمض الأسيتيك وخلات الصوديوم (درجة الحموضة 3.5) إلى أنبوب الاختبار.
    ملاحظة: يضاف إيزوأميليز لقطع السلسلة المتفرعة للعينة المراد اختبارها على وجه التحديد. إيزوأميليز هو إنزيم منفصل يمكنه تدمير الرابطة α-(1-6) على وجه التحديد دون تدمير الرابطة α-(1-4) ، لذلك يمكنه على وجه التحديد شق السلسلة الجانبية للجليكوجين دون تدمير بنية السلسلة الرئيسية.
  2. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في خلاط حراري. بعد جعل الأس الهيدروجيني محايدا مع 8 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M ، احتضن الخليط عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في خلاط حراري.
  3. أضف 4 أضعاف حجم الإيثانول المطلق إلى الخليط لترسيب الجليكوجين. ثم ، جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الحبيبات مرتين بالإيثانول ، وقم بإذابة الحبيبات في ddH₂O وقم بتجميدها.
2. تحضير محلول الفلورسنت
  1. جهاز طرد مركزي زجاجة كاشف APTS (ملح ثلاثي الصوديوم 8-أمينوبيرين -1،3،6-حمض ثلاثي السلفونيك) (تحتوي كل زجاجة على 5 مجم APTS) عند 4,000 × جم لمدة دقيقتين. أضف 50 ميكرولتر من محلول حمض الأسيتيك بنسبة 15٪ لإذابة المسحوق ، واخلطه جيدا ، وجهاز الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة للحصول على محلول حمض الخليك 0.2 M APTS.
    ملاحظة: احتفظ بمحلول APTS في الثلاجة عند -20 درجة C.It يجب استخدامه بالكامل في غضون أسبوعين بمجرد فتحه. خلاف ذلك ، سيتم تعطيله. APTS هي صبغة سالبة الشحنة شائعة الاستخدام ترتبط بالطرف المختزل لسلسلة الجليكوجين. نظرا لأن السلاسل ذات درجات مختلفة من البلمرة (DP) تحمل جميعها شحنة سالبة واحدة فقط ، يمكن ل FACE فصلها بناء على نسب الكتلة إلى الشحن المختلفة. بهذه الطريقة ، يتم الكشف عن إشارات ذات قيم DP مختلفة بواسطة كاشف التألق.
3. انقل الجليكوجين منزوع التفرع إلى أنبوب اختبار وأضف 1.5 ميكرولتر من محلول APTS و 1.5 ميكرولتر من محلول سيانوبوروهيدريد الصوديوم. احتضن عند 60 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة في الظلام. أضف 80 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، وجهاز الطرد المركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واحتفظ بالمادة الطافية.
4. أدخل العينة في نظام الرحلان الكهربائي الشعري عن طريق الحقن لمدة 3 ثوان عند 0.5 رطل لكل بوصة مربعة (3.4 كيلو باسكال فوق الضغط الجوي).
  ملاحظة: تم فصل الجلوكان الخطي المصنف بالفلورسنت من خلال الجهد المطبق البالغ 30 كيلو فولت وتيار تقريبي يبلغ 14 مللي أمبير عند 25 درجة مئوية. أعطت مناطق الذروة كميات نسبية من الجلوكان ذات الكتل المختلفة (درجة البلمرة (DP) من الجلوكان في القمم المجاورة اختلفت بمقدار 1 DP). تم الاحتفاظ بدرجة حرارة العينة عند 18 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توزيع حجم جزيئات الجليكوجين
أظهرت سلسلة من الدراسات أن جزيئات الجليكوجين α في الكبد السكري هشة ويمكن تفكيكها بسهولة في اضطراب الرابطة الهيدروجينية DMSO¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴. اختبرت الدراسة الحالية كيف تغير حجم الجسيمات والاستقرار الهيكلي للجليكوجين البكتيري المستخرج من خلال أربع طرق مختلفة. تمت معالجة جميع عينات الجليكوجين من الطرق الأربع بالماء (المنحنيات الزرقاء) و DMSO (المنحنيات ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجليكوجين هو احتياطي طاقة مهم تم تحديده في العديد من البكتيريا¹⁶. لتشريح الوظائف الفسيولوجية لجزيئات الجليكوجين ، من الضروري أن يكون لديك فهم أفضل للبنية الدقيقة لجزيئات الجليكوجين. حتى الآن ، تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لاستخراج الجليكوجين من الثقافة البكتيرية. ومع ذلك ، فقد لوحظت توزيعات مختلفة الحجم لجزيئات الجليكوجين من طرق الاستخراج المختلفة ، مما يشير إلى تلف بنية الجليكوجين. وبالتالي ، من الضروري مقارنة وتوحيد إجراءات الاستخراج للتأكد من أن هياكل الجلي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد تضارب في المصالح بين المؤلفين.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون للغاية للبروفيسور روبرت جي جيلبرت من جامعة كوينزلاند وجامعة يانغتشو الذي قدم رؤى وخبرات ساعدت بشكل كبير في إكمال هذه الدراسة. نعرب عن تقديرنا للدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31900022 ، رقم 32171281) ، مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (رقم . BK20180997) ، فريق الابتكار العلمي والتكنولوجي الشاب بجامعة Xuzhou الطبية (رقم. TD202001) ، ومشروع جيانغسو تشينغلان (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي>المعدات< القوية> Agilent
1260 نظام SEC اللانهائي	Agilent	1260 infinity II	توزيع حجم الجسيمات
العمود التحليلي	PSS	10-1000-جهاز
طرد مركزي	Eppendorf	5420-غشاء
مرشح	Cambio	Km-0220	-
نظام الرحلان الكهربائي الشعري بمساعدة التألق	بيكمان كولتر		توزيع طول السلسلة
مجفف التجميد	Xinzhi	SCIENTZ-10N	تجميد البكتيريا والجليكوجين
الفريزر	الحراري فيشر	فورما 900	حارس تخزين العينات
	PSS	SUPPERMA-حاضنة
	ثيرمو فيشر	PR505750R-CN	-
جهاز طرد مركزي منخفض السرعة ذو سعة	كبيرة Hexi	HR / T20MM	عينة الطرد المركزي
Multiskan FC قارئ صفيحة دقيقة	Thermo Fisher
1410101-Optima XPN جهاز طرد مركزي فائق	Beckman	XPN-100/90/80	الجليكوجين
	Xinbao	SHZ-82-PA-800
Plus System	Beckman Coulter	A66528-pH
meter	Mettler Toledo	FE28 -TRIS	-
كاشف معامل الانكسار	Wyatt	Optilab T-rEX	-
ثلاجة	Haier	BCD-406WDPD-Thermomixer
	Shanghai Jingxin	JXH-100	حضانة عينة
مجهر إلكتروني نقل	شركة هيتاشي	H-7000	مورفولوجيا جسيمات الجليكوجين
أنبوب الطرد المركزي الفائق	بيكمان		355651-كسارة
الخلايا بالموجات فوق الصوتية	نينغبو Xinzhi	Scientz-IID	& nbsp ؛ البكتيريا المعطلة
بالموجات فوق الصوتية تذبذب حمام مائي	Jietuo	JT-1027HTD-خلاط
دوامة	Tiangen	OSE-VX-01-نظام
المياه	Merck Millipore	H_{2< / sub>O-MM-UV-T}	ماء منزوع الأيونات
<قوي>المواد< / قوي>
8-أمينوبيرين-1،3،6-حمض تريسولفونيك ملح ثلاثي الصوديوم	سيجما ألدريتش	196504-57-1-مسحوق
الإيثانول	المطلق Guoyao	10009228-Agar
	Solarbio	A1890-Alpha-amylase
	Megazyme	E-BLAAM-40ML-Amyloglucosidase
	Megazyme	E-AMGDF-40ML-cOmplete
Mini	Roche	4693159001-D
- (+)مجموعة فحص الجلوكوز	Sigma-Aldrich	G8270-1kg-D-Glucose
(تنسيق GOPOD)	Megazyme	K-GLUC	Glycogen القياس
ميثيل سلفوكسيد	Vicmed	Vic147	عامل Chaotropic
E. قولوني< م > BL21 (DE3)	Tiangen	CB105-02-الإيثيلين
ديامين حمض الترا الخليك	Vicmed	Vicmed1488	-
حمض الخليك الجليدي	Guoyao		10000218-Glycerol
	Guoyao	10010618	التخزين البكتيري
حمض الهيدروكلوريك	Guoyao
10011008-Hydroxymethyl aminomethane	Sigma-Aldrich	V900483-500g-Isoamylase
	MegaZyme	9067-73-6	تفرع الجليكوجين
كلوريد الليثيوم	سيجما ألدريتش	62476-100 جم	-
M9 ، الحد الأدنى من الأملاح ، 5 & مرات ؛	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	الثقافة البكتيرية
هيدروكسيد البوتاسيوم	Guoyao
10017008-Pullulan المعيار	PSS	-
أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدرات	Guoyao	10018718-أزيد
الصوديوم	سيجما-ألدريتش	26628-22-8-كلوريد
الصوديوم	Guoyao	10019318	البكتيرية ثقافة
سيانوبوروهيدريد الصوديوم	Huaweiruike	hws001297-ثنائي
فوسفات الصوديوم	سيجما-ألدريتش	71515-250 جم	-
فلوريد الصوديوم	ماكلين	S817988-250	جم -
هيدروكسيد الصوديوم	Guoyao	10019762	نترات
الصوديوم	Guoyao	10019928
بيروفوسفات الصوديوم	سيجما ألدريتش	V900195-500 جم	-
السكروز	Guoyao		10021463-حمض
ثلاثي كلورو أسيتيك	Guoyao
40091961-Tryptone	Oxoid	LP0042	مستخلص الخميرة للثقافة البكتيرية
	Oxoid	LP0021	الثقافة البكتيرية

عمود لمذبذب الكمي ثنائي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in Escherichia coli. Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
Nawaz, A., Zhang, P., Li, E., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The importance of glycogen molecular structure for blood glucose control. iScience. 24 (1), 101953(2021).
Rashid, A. M., et al. Assembly of α-glucan by GlgE and GlgB in mycobacteria and streptomycetes. Biochemistry. 55 (23), 3270-3284 (2016).
Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).
Kamio, Y., Terawaki, Y., Nakajima, T., Matsuda, K. Structure of glycogen produced by Selenomonas ruminantium. Agricultural and Biological Chemistry. 45 (1), 209-216 (1981).
Gong, J., Forsberg, C. W. Separation of outer and cytoplasmic membranes of Fibrobacter succinogenes and membrane and glycogen granule locations of glycanases and cellobiase. Journal of Bacteriology. 175 (21), 6810-6821 (1993).
Mojibi, N. Comparison of methods to assay liver glycogen fractions: the effects of starvation. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (3), (2017).
Orrell, S. A., Bueding, E. A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen. The Journal of Biological Chemistry. 239, 4021-4026 (1964).
Tan, X., et al. Proteomic investigation of the binding agent between liver glycogen beta particles. ACS Omega. 3 (4), 3640-3645 (2018).
Hu, Z., et al. Diurnal changes of glycogen molecular structure in healthy and diabetic mice. Carbohydrate Polymers. 185, 145-152 (2018).
Sullivan, M. A., Harcourt, B. E., Xu, P., Forbes, J. M., Gilbert, R. G. Impairment of liver glycogen storage in the db/db animal model of type 2 diabetes: a potential target for future therapeutics. Current Drug Targets. 16 (10), 1088-1093 (2015).
Deng, B., et al. Molecular structure of glycogen in diabetic liver. Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).
Sullivan, M. A., et al. Molecular structural differences between type-2-diabetic and healthy glycogen. Biomacromolecules. 12 (6), 1983-1986 (2011).
Wang, L., et al. Systematic analysis of metabolic pathway distributions of bacterial energy reserves. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (8), 2489-2496 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

طريقة استخراج غير متحللة لتوصيف التركيب الجزيئي لجزيئات الجليكوجين البكتيرية

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles