تتضمن مجموعة الأدوات الجينومية الوظيفية للديدان الخيطية الطفيلية Strongyloides stercoralis و Strongyloides ratti التحول ، والطفرات بوساطة CRISPR / Cas9 ، و RNAi. سيوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية لإدخال الجينات المحورة ومكونات كريسبر في S. stercoralis و S. ratti.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توليد الجينات والضربة القاضية في أنواع Strongyloides عن طريق الحقن المجهري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتكون جنس Strongyloides من أنواع متعددة من الديدان الخيطية المخترقة للجلد مع نطاقات مضيفة مختلفة ، بما في ذلك Strongyloides stercoralis و Strongyloides ratti. S. stercoralis هو نيماتودا بشرية طفيلية تخترق الجلد تصيب ما يقرب من 610 ملايين شخص ، في حين أن طفيلي الفئران S. ratti يرتبط ارتباطا وثيقا ب S. stercoralis وغالبا ما يستخدم كنموذج مختبري ل S. stercoralis. كل من S. stercoralis و S. ratti قابلان بسهولة لتوليد الديدان المحورة والتناسلية والضربة القاضية من خلال تقنية توصيل الحمض النووي الخارجي للحقن المجهري داخل الغدد التناسلية ، وعلى هذا النحو ، ظهرت كأنظمة نموذجية للديدان الطفيلية الأخرى التي لم تكن قابلة بعد لهذه التقنية.
يعيش البالغون الطفيليون Strongyloides في الأمعاء الدقيقة لمضيفهم ويطلقون ذرية في البيئة عبر البراز. بمجرد وصولها إلى البيئة ، تتطور اليرقات إلى بالغين يعيشون بحرية ، ويعيشون في البراز وينتجون ذرية يجب أن تجد وتغزو مضيف جديد. هذا الجيل البيئي فريد من نوعه لأنواع Strongyloides ومشابه بما فيه الكفاية في مورفولوجيا لنموذج الديدان الخيطية الحية الحرة Caenorhabditis elegans بحيث يمكن تكييف التقنيات التي تم تطويرها ل C. elegans للاستخدام مع هذه الديدان الخيطية الطفيلية ، بما في ذلك الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية. باستخدام الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية ، يمكن إدخال مجموعة واسعة من الجينات المحورة في Strongyloides. يمكن أيضا حقن مكونات كريسبر / كاس9 الدقيقة لإنشاء يرقات Strongyloides المتحولة. هنا ، يتم وصف تقنية الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية في Strongyloides ، بما في ذلك إعداد البالغين الذين يعيشون بحرية ، وإجراء الحقن ، واختيار النسل المعدل وراثيا. يتم تضمين صور يرقات Strongyloides المعدلة وراثيا التي تم إنشاؤها باستخدام طفرات CRISPR / Cas9. الهدف من هذه الورقة هو تمكين الباحثين الآخرين من استخدام الحقن المجهري لإنشاء Strongyloides المعدلة وراثيا والمتحولة.
المقدمة
منذ فترة طويلة تم التغاضي عن Strongyloides stercoralis كممرض بشري مهم مقارنة بالديدان الخطافية المعترف بها على نطاق واسع والدودة المستديرة Ascaris lumbricoides1. غالبا ما قللت الدراسات السابقة لعبء الدودة بشدة من انتشار S. stercoralis بسبب الحساسية المنخفضة لطرق التشخيص الشائعة ل S. stercoralis2. في السنوات الأخيرة ، قدرت الدراسات الوبائية القائمة على أدوات التشخيص المحسنة أن الانتشار الحقيقي لعدوى S. stercoralis أعلى بكثير مما تم الإبلاغ عنه سابقا ، أي ما يقرب من 610 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم2.
كل من S. stercoralis وأنواع Strongyloides الأخرى ، بما في ذلك طفيلي الفئران المرتبط ارتباطا وثيقا ونموذج المختبر المشترك S. ratti ، لديهم دورة حياة غير عادية مفيدة للدراسات الجينومية التجريبية لأنها تتكون من أجيال طفيلية وحرة (بيئية)3 (الشكل 1). على وجه التحديد ، يمكن لكل من S. stercoralis و S. ratti التنقل عبر جيل واحد من العيش الحر. يتكون جيل العيش الحر من يرقات ما بعد الطفيلية التي تتطور إلى ذكور وإناث بالغين يعيشون بحرية. تتطور جميع ذرية البالغين الذين يعيشون بحرية إلى يرقات معدية ، والتي يجب أن تصيب المضيف لمواصلة دورة الحياة. علاوة على ذلك ، يمكن التلاعب بهذا الجيل البيئي أو الحي الحر تجريبيا في المختبر. نظرا لأن البالغين الذين يعيشون بحرية في Strongyloides و C. elegans البالغين يشتركون في مورفولوجيا مماثلة ، يمكن تكييف تقنيات مثل الحقن المجهري داخل الغدد التناسلية التي تم تطويرها في الأصل ل C. elegans للاستخدام مع Strongyloides 4,5 البالغين الذين يعيشون بحرية. في حين يتم إدخال الحمض النووي بشكل عام في الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية ، يمكن حقن كل من الذكور والإناث من Strongyloides 6. وبالتالي ، تتوفر أدوات الجينوم الوظيفية لاستجواب العديد من جوانب بيولوجيا Strongyloides. تفتقر الديدان الخيطية الطفيلية الأخرى إلى جيل يعيش بحرية ، ونتيجة لذلك ، فهي ليست قابلة بسهولة للتقنيات الجينومية الوظيفية3.
الشكل 1: دورة حياة سترونغيلويدات ستيركوراليس. تعيش الإناث الطفيلية S. stercoralis في الأمعاء الدقيقة لمضيفيها من الثدييات (البشر ، الرئيسيات غير البشرية ، الكلاب). تتكاثر الإناث الطفيلية عن طريق التوالد العذري وتضع البيض داخل الأمعاء الدقيقة. يفقس البيض بينما لا يزال داخل المضيف إلى يرقات ما بعد الطفيلية ، والتي يتم تمريرها بعد ذلك إلى البيئة مع البراز. إذا كانت يرقات ما بعد الطفيليات من الذكور ، فإنها تتطور إلى ذكور بالغين يعيشون بحرية. إذا كانت يرقات ما بعد الطفيلية أنثى ، فيمكنها إما أن تتطور إلى إناث بالغات يعشن بحرية (تطور غير مباشر) أو يرقات معدية في المرحلة الثالثة (iL3s ؛ تطور مباشر). الذكور والإناث الذين يعيشون بحرية يتكاثرون جنسيا لخلق ذرية مقيدة لتصبح iL3s. في ظل ظروف معينة ، يمكن أن يخضع S. stercoralis أيضا للعدوى الذاتية ، حيث تبقى بعض يرقات ما بعد الطفيلية داخل الأمعاء المضيفة بدلا من المرور إلى البيئة في البراز. يمكن أن تتطور هذه اليرقات إلى يرقات ذاتية العدوى (L3a) داخل المضيف ، وتخترق جدار الأمعاء ، وتهاجر عبر الجسم ، وتعود في النهاية إلى الأمعاء لتصبح بالغين تناسليين. دورة حياة S. ratti متشابهة ، باستثناء أن S. ratti يصيب الفئران وليس لديه دورة عدوى ذاتية. الجيل البيئي هو المفتاح لاستخدام أنواع Strongyloides للدراسات الوراثية. يمكن حقن الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية (P0) بشكل مجهري ؛ ذريتهم ، والتي ستصبح جميعها iL3s ، هي المعدلة وراثيا F1 المحتملة. وقد عدل هذا الرقم من كاستيليتو وآخرين. 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تشترك S. stercoralis في العديد من جوانب بيولوجيتها مع الديدان الخيطية الطفيلية البشرية المعدية المعوية الأخرى ، بما في ذلك غزو المضيف وتعديل المناعة المضيفة. على سبيل المثال ، تصيب الديدان الخطافية البشرية الطفيلية في الأجناس Necator و Ancylostoma أيضا عن طريق اختراق الجلد ، وتتنقل بالمثل عبر الجسم ، وتقيم في النهاية كبالغين طفيليين في الأمعاء الدقيقة7. وبالتالي ، من المحتمل أن تستخدم العديد من الديدان الخيطية المعدية المعوية السلوكيات الحسية الشائعة وتقنيات التهرب المناعي. ونتيجة لذلك ، فإن المعرفة المستقاة من Strongyloides ستكمل النتائج في الديدان الخيطية الأخرى الأقل قابلية للسحب وراثيا وتؤدي إلى فهم أكثر اكتمالا لهذه الطفيليات المعقدة والمهمة.
يحدد بروتوكول الحقن المجهري هذا طريقة إدخال الحمض النووي في الإناث البالغات اللواتي يعشن بحرية في Strongyloides لصنع ذرية معدلة وراثيا ومتحولة. يتم وصف متطلبات صيانة السلالة ، بما في ذلك التوقيت التنموي للديدان البالغة للحقن المجهري وجمع النسل المعدل وراثيا. يتم تضمين البروتوكولات وعرض توضيحي لتقنية الحقن المجهري الكاملة ، إلى جانب بروتوكولات زراعة وفحص النسل المعدل وراثيا ، إلى جانب قائمة بجميع المعدات والمواد الاستهلاكية اللازمة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم استخدام الجربلات لمرور S. stercoralis ، واستخدمت الفئران لتمرير S. ratti. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل مكتب الإشراف على البحوث الحيوانية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (البروتوكول رقم 2011-060-21A) ، الذي يلتزم بمعايير AAALAC ودليل رعاية واستخدام المختبر. يجب إكمال المهام التالية قبل يوم واحد على الأقل من الحقن المجهري: زراعة الديدان ، وإعداد منصات الحقن المجهري ، وإنشاء تركيبات لمزيج الحقن المجهري ، ونشر البكتيريا (E. coli HB101) على ألواح وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) مقاس 6 سم8. تحتاج الإناث اللواتي يعشن بحرية إلى جمع ما لا يقل عن 24 ساعة بعد البراز عند 25 درجة مئوية ليتطورن إلى شباب بالغين قبل أن يتم حقنهن بالميكرو. يجب أن تكون منصات الحقن المجهري جافة تماما. يجب أن تجف الألواح البكتيرية وتنشئ حديقة صغيرة.
1. إعداد شرائح الحقن المجهري: قبل يوم واحد على الأقل من الحقن
ملاحظة: يتم تركيب الديدان على أغطية الحقن المجهري مع منصات أجار جافة للحقن.
- اضبط كتلة الحرارة على 90 درجة مئوية.
- أضف 5 مل من ddH2O ، ثم 100 ملغ من الأغاروز إلى أنبوب زجاجي من البورسليكات.
- سخني مزيج الأغاروز في الأنبوب فوق اللهب حتى يذوب الأغاروز.
- ضع الأنبوب في كتلة حرارية محددة عند 90 درجة مئوية للحفاظ على الأغاروز في الحالة السائلة.
- أسقط ~ 180 ميكرولتر من محلول الأغاروز على غطاء باستخدام ماصة باستور زجاجية أو ماصة ذات طرف بلاستيكي. قم على الفور بإسقاط غطاء ثان في الأعلى لتسطيح الأغاروز في وسادة رقيقة.
- بعد 5-10 ثوان ، قم بإزالة الغطاء العلوي عن طريق تحريك الاثنين بعيدا. حدد الشريحة التي توجد عليها لوحة الأجار وضعها وجها لوجه.
- حدد قطعة صغيرة من شظايا الزجاج من غطاء مكسور واضغط عليها برفق في الأجار بالقرب من الحافة العلوية للوسادة باستخدام ملقط (الشكل التكميلي S1).
- استمر في صنع منصات الحقن المجهري بمحلول الأغاروز.
- جفف وسادات الأغاروز طوال الليل على المقعد أو في الفرن. يخزن في صندوق الغطاء.
ملاحظة: يمكن استخدام منصات الأغاروز لمدة تصل إلى 2 أشهر ولكنها تستخدم فقط لتشغيل حقن واحد.
2. زراعة Strongyloides للحصول على الديدان للحقن المجهري: 1-2 أيام قبل الحقن
ملاحظة: يمكن العثور على بروتوكول صيانة الإجهاد في المادة التكميلية ، والذي يتضمن وصفا مفصلا لكيفية إصابة الجربلات والجرذان بالديدان الخيطية وحصاد الديدان الخيطية من براز الحيوانات المصابة.
- قبل يومين من يوم الحقن ، ضع الحيوانات المصابة 9,10 في أقفاص التجميع بين عشية وضحاها.
- في صباح اليوم التالي ، جمع البراز الموبوء وجعل لوحات الفحم البرازي 9,10.
- ضع صفيحة على درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح للديدان الحية الحرة بالتطور إلى شباب.
- في الليلة السابقة ليوم الحقن ، ضع الحيوانات المضيفة غير المصابة في أقفاص التجميع.
- في يوم الحقن ، اجمع البراز غير المصاب لزراعة ما بعد الحقن.
3. جعل مزيج الحقن المجهري: قبل أو في يوم الحقن
ملاحظة: يتكون مزيج الحقن المجهري من البلازميدات ذات الأهمية المخففة إلى التركيز المطلوب في محلول ملحي مخزن مؤقتا بالديدان (BU) (50 mM Na 2 HPO4 ، 22 mM KH2PO4 ، 70 mM NaCl)11.
- تحديد تركيز مخزون البلازميد والتركيز المطلوب في مزيج الحقن المجهري (الجدول 1).
| مزيج الحقن المجهري: بناء المراسل | |||
| مكون | تركيز المخزون | مبلغ | التركيز النهائي |
| pMLC30 غبا - 3::غف ف | 300 نانوغرام/ميكرولتر | 1.7 ميكرولتر | 50 نانوغرام/ميكرولتر |
| بو | غير متوفر | 8.3 ميكرولتر | غير متوفر |
| مجموع | 10 ميكرولتر | 50 نانوغرام/ميكرولتر | |
| مزيج الحقن المجهري: طفرات كريسبر/كاس9 | |||
| مكون | تركيز المخزون | مبلغ | التركيز النهائي |
| pMLC47 الضريبة-4 sgRNA | 300 نانوغرام/ميكرولتر | 2.7 ميكرولتر | 80 نانوغرام/ميكرولتر |
| pEY11 Ss-tax-4 HDR بلازميد | 400 نانوغرام/ميكرولتر | 2.0 ميكرولتر | 80 نانوغرام/ميكرولتر |
| pPV540 strCas9 بلازميد | 350 نانوغرام/ميكرولتر | 1.1 ميكرولتر | 40 نانوغرام/ميكرولتر |
| بو | غير متوفر | 4.2 ميكرولتر | غير متوفر |
| مجموع | 10 ميكرولتر | 200 نانوغرام/ميكرولتر | |
| مزيج الحقن المجهري: تكامل piggyBac | |||
| مكون | تركيز المخزون | مبلغ | التركيز النهائي |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 نانوغرام/ميكرولتر | 2.0 ميكرولتر | 60 نانوغرام/ميكرولتر |
| pPV402 بلازميد الترانسبوساز | 450 نانوغرام/ميكرولتر | 0.9 ميكرولتر | 40 نانوغرام/ميكرولتر |
| بو | غير متوفر | 7.1 ميكرولتر | غير متوفر |
| مجموع | 10 ميكرولتر | 100 نانوغرام/ميكرولتر | |
الجدول 1: أمثلة على خلطات الحقن المجهري. البلازميدات والتركيزات لثلاثة أمثلة على مزيج الحقن المجهري: واحد لمراسل GPA-3::GFP بناء 10 ، واحد لتعطيل كريسبر / Cas9 بوساطة موضع Ss-tax-4 14,15 ، وواحد للتكامل بوساطة أصبع Bac لبناء Ss-gpa-3::GFP 13,17,18. strCas9 يدل على جين Cas9 المحسن للكودون Strongyloides. تستخدم التركيزات النهائية المدرجة بشكل شائع في خلطات الحقن المجهري Strongyloides.
- تمييع البلازميدات في BU إلى حجم إجمالي من 10-20 ميكرولتر.
- قم بتدوير المزيج من خلال عمود مرشح على مساحة 5000 × جم لمدة 1-2 دقيقة.
- استخدم مزيج الحقن المجهري على الفور أو قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
4. جمع الشباب البالغين Strongyloides للحقن المجهري: صباح يوم الحقن
- قم بإعداد جهاز Baermann مع 1 صفيحة فحم برازي من Strongyloides الشباب البالغين (الشكل 2).
ملاحظة: قد تحتوي صفيحة الفحم البرازي على بعض اليرقات المعدية. تتكون معدات الحماية الشخصية من معطف المختبر والقفازات وحماية العين. لا ينبغي أن يتعرض أي جلد بين القفاز وكم معطف المختبر.
الشكل 2: جهاز بيرمان المستخدم لجمع الديدان الطفيلية من الثقافات10. يتم وضع محتويات صفيحة الفحم البرازي في الجزء العلوي من عمود من الماء الدافئ. تهاجر الديدان إلى الماء وتتجمع في قاع القمع. (أ) لإعداد جهاز Baermann ، يتم تثبيت حامل قمع Baermann على المقعد بمشبك C. يتم إغلاق أنبوب مطاطي متصل بنهاية القمع بمشابك قرصة ، ويتم وضع دلو صيد أسفل الأنبوب للتنقيط. يضاف الماء الدافئ إلى القمع الزجاجي. (ب) ثم يتم تبطين حامل الحلقة البلاستيكية لمزيج البراز والفحم ب 3 قطع من أنسجة المختبر (يسار). يتم استخدام عصا خشبية أو مثبط لسان (وسط) لنقل محتويات صفيحة الفحم البرازي (يمين) إلى حامل الحلقة البلاستيكية. (ج) صورة مقربة لأسفل حامل الحلقة البلاستيكية لمزيج البراز والفحم، تظهر الطبقة المزدوجة من تول النايلون المبطن لأسفل الحامل. (د) ثم يوضع حامل الفحم البرازي في الجزء العلوي من القمع الزجاجي. (ه) يتم ترطيب الأنسجة المختبرية بالماء وإغلاقها فوق مزيج البراز والفحم. يضاف المزيد من الماء الدافئ لغمر الفحم البرازي في الغالب. (و) إعداد بيرمان الكامل، مع غمر ثقافة البراز والفحم تحت الماء الدافئ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بتثبيت قمع زجاجي مع أنابيب جمع مطاطية على حامل دائري باستخدام حلقة O وقم بتأمينه بمشبك. أغلق أنبوب المجموعة بمشابك قرصة 2 (الشكل 2A).
- ضع دلو صيد أسفل القمع لالتقاط التنقيط.
- أضف ماء دافئا (حوالي 40 درجة مئوية) إلى القمع إلى 5 سم أسفل الحافة. تحقق من عدم تسرب النظام.
- خط حامل بيرمان ، وهو غربال مصنوع من 2 حلقات بلاستيكية مع طبقتين من معاوضة تول النايلون المؤمنة بينهما ، مع 3 قطع متداخلة من أنسجة المختبر. أضف خليط البراز والفحم إلى حامل بيرمان (الشكل 2B ، C).
- ضع حامل Baermann مع خليط البراز والفحم في القمع. قم بطي الأنسجة حول مزيج البراز والفحم وأضف ما يكفي من الماء لغمر معظم الفحم البرازي. لا تملأ أكثر من 2 سم من حافة القمع (الشكل 2D ، E).
- ضعي فوق القمع غطاء طبق بتري بلاستيكي بطول 15 سم لاحتواء الرائحة. قم بتسمية القمع حسب الحاجة (الشكل 2F).
- انتظر 30 دقيقة إلى 1 ساعة لجمع الديدان من جهاز بيرمان.
- امسك أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل تحت الأنابيب المطاطية في الجزء السفلي من القمع. افتح المشابك بعناية في الجزء السفلي لتوزيع 30-40 مل من الماء الذي يحتوي على الديدان في أنبوب 50 مل.
- نقل 15 مل من مياه بيرمان التي تحتوي على الديدان إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل لمدة 1 دقيقة عند ~ 750 × جم (بطيء). بدلا من ذلك ، اسمح للديدان بالجاذبية لمدة 10-15 دقيقة.
- إزالة supernatant إلى ~ 2 مل والتخلص من supernatant في حاوية سائلة النفايات مع اليود لقتل أي ديدان.
- أضف المزيد من ماء بيرمان إلى أنبوب التجميع سعة 15 مل وكرر الدوران. قم بإزالة supernatant إلى ~ 2 مل وتجاهل كما في الخطوة 4.11.
- كرر الخطوتين 4.11 و4.12 حتى يتم جمع جميع الديدان في أنبوب جهاز الطرد المركزي سعة 15 مل. بعد الدوران النهائي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء.
- افحص حبيبات الديدان (40-100 ميكرولتر) في أسفل الأنبوب. إذا لم تكن هناك ديدان مرئية ، فانتظر 1-2 ساعة أخرى وحاول جمع المزيد من الديدان من جهاز بيرمان.
- انقل الديدان في أقل قدر ممكن من الماء إلى صفيحة NGM بحجم 6 سم 2٪ مع حديقة من E. coli HB101. استخدم هذه اللوحة كلوحة مصدر للحقن المجهري.
- تخلص من مزيج الفحم البرازي عن طريق معالجته باليود المخفف (تخفيف بنسبة 50٪ من يود Lugol في الماء) ، ولفه في فيلم بلاستيكي لالتقاط قطرات ، ووضعه في حاوية نفايات خطرة بيولوجيا.
- أضف 10 مل من اليود المخفف إلى دلو الصيد واستنزاف الماء الزائد من بيرمان فيه.
- اغسل المكونات القابلة لإعادة الاستخدام (القمع ، دلو الصيد ، حامل البلاستيك مع تول ، الغطاء البلاستيكي ، والمشابك) مع 10٪ من المبيض وشطفها جيدا.
5. سحب وتحميل إبر الحقن المجهري: قبل الحقن مباشرة
- تحضير إبر الحقن المجهري عن طريق سحب الأنابيب الشعرية الزجاجية باستخدام مجتذب الإبرة.
ملاحظة: من الأمثلة على الإعدادات الخاصة بمجتذب إبرة تجاري مزود بخيوط بلاتينية/إيريديوم مقاس 3 مم الحرارة = 810-820، السحب = 800-820، الميكرومتر = 2.5. - عرض النصائح تحت المجهر تشريح. إذا كانت الإبر لها الشكل المطلوب (الشكل 3A-F) ، فاسحب 4-6 إبر (2-3 أنابيب شعرية). لتحقيق شكل الإبرة المناسب ، قم بتغيير الإعدادات حسب الحاجة: اضبط إعدادات الحرارة أو السحب بمقدار 10 وسحب إبر جديدة حتى يصبح شكل المستدق والعمود أكثر ملاءمة.
الشكل 3: إبر الحقن المجهري وأنثى Strongyloides stercoralis البالغة مع تحديد المواقع المثلى للحقن المجهري. (A-F) صور إبر الحقن المجهري. (أ-ب) تفتق العمود (A) وطرف (B) من إبرة التي تم تشكيلها بشكل صحيح للحقن المجهري. الطرف حاد بما يكفي لاختراق البشرة وضيق بما يكفي لعدم التسبب في ضرر مفرط. (C-D) تفتق العمود (C) وطرف (D) لإبرة الحقن المجهري التي تم تشكيلها بشكل غير صحيح للحقن المجهري. الطرف حاد جدا وواسع ، وسوف يسبب أضرارا مفرطة للدودة. (E-F) تفتق العمود (E) وطرف (F) من إبرة من المرجح أن تكون طويلة جدا ونحيلة للعمل للحقن المجهري. الطرف في F يشبه إلى حد كبير الطرف الموجود في D. ومع ذلك ، فإن العمود أضيق ومرن للغاية بحيث لا يمكنه اختراق البشرة بشكل فعال. بالإضافة إلى ذلك ، تسد الإبر النحيلة جدا بسهولة. (ز) صورة للدودة بأكملها موضوعة بشكل صحيح للحقن المجهري، على افتراض أن الإبرة قادمة من اليمين. الأمامي هو أسفل وإلى اليسار. يشار إلى الفرج بواسطة رأس السهم. الغدد التناسلية مرئية على طول الجانب الأيمن من الأنثى. هذه الأنثى لديها بويضة واحدة فقط في رحمها (المشار إليها بالعلامة النجمية). (ح، ط) طرق عرض مكبرة لمواقع الحقن المجهري. زاوية السهم تقترب من زاوية إبرة الحقن. يمكن استخدام الفرج كمعلم. إنه على الجانب الآخر من الدودة من ذراعي الغدد التناسلية. أذرع منحنى الغدد التناسلية حول الأمعاء ، والنهايات مع النوى المنقسمة هي مقابل الفرج. (ح) الذراع الخلفي للغدد التناسلية؛ (I) الذراع الأمامية. يمكن حقن أي من الذراعين أو كليهما. بالنسبة ل H و I ، تكون الاتفاقيات كما في G. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (B ، D ، F ، H ، I) ؛ 100 ميكرومتر (A، C، E، G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بتخزين الإبر المسحوبة في طبق بتري بلاستيكي مقاس 15 سم مع قطعة من الشريط المدلفن لتأمين الإبر وتجنب تراكم الغبار على الأطراف.
- ضع قطرة 0.7 ميكرولتر من مزيج الحقن المجهري على الطرف المفتوح من العمود. قم بتعليق الإبرة عموديا على الرف باستخدام قطعة ملفوفة من الشريط لملء العمود المدبب بالمزيج في غضون 10 دقائق. إعداد 2 إبر في وقت واحد في حالة عدم عمل الأول.
6. تحضير المجهر وكسر الإبرة
ملاحظة: يستخدم الحقن المجهري مجهرا مقلوبا بأهداف 5x و 40x مجهزة بإعداد حاقن دقيق للتحكم في حركة الإبرة. يجب وضع المجهر المقلوب على طاولة ثقيلة أو طاولة هواء مضادة للاهتزاز لتقليل الضوضاء الاهتزازية. يتم توصيل حامل إبرة الحاقن الدقيق بغاز النيتروجين الذي يطبق الضغط اللازم لتوصيل مزيج الحقن المجهري. يتم استخدام مجهر تشريح أصغر في مكان قريب لنقل الديدان.
- اضبط ضغط خزان الغاز على ~ 40-60 رطل لكل بوصة مربعة لكسر الإبرة وعلى ~ 30-50 رطل لكل بوصة مربعة للحقن الدقيق ، اعتمادا على تدفق السائل.
- على المجهر التشريحي ، قم بتغطية شظايا الزجاج على غطاء وسادة الحقن المجهري بزيت الهالوكربون باستخدام اختيار دودة البلاتين القياسية.
- ضع غطاء وسادة الحقن المجهري على منظار الحقن المجهري وحدد موقع شظية الزجاج المغطى بالزيت. قم بمحاذاة شظية الزجاج بحيث تكون الحافة عمودية على اتجاه الإبرة لتكون بمثابة السطح المستخدم لكسر الإبرة.
- تحقق من أن الإبرة لا تحتوي على فقاعات أو حطام في العمود المدبب باستخدام مجهر التشريح. ثم ، قم بتثبيت الإبرة 1-1.5 سم في الحامل المضغوط.
- ضع طرف الإبرة في وسط مجال رؤية المجهر بالعين. ثم تحت التكبير المنخفض ، ضع طرف الإبرة في مجال الرؤية ، عموديا على جانب شظية الزجاج.
- قم بالتبديل إلى طاقة عالية وقم بمحاذاة طرف الإبرة مع حافة الزجاج ، بالقرب منه ولكن دون لمسه.
ملاحظة: عند سحبها، يتم دمج الإبر مغلقة. - لكسر طرف الإبرة للسماح بتدفق السائل، اضغط عليه برفق على جانب قطعة الزجاج مع تطبيق ضغط مستمر من الغاز (الشكل التكميلي S1). بمجرد أن يبدأ السائل في التدفق ، تحقق من شكل الطرف وتأكد من أنه حاد مع سائل سهل التدفق.
ملاحظة: إذا كان السائل يتدفق بسرعة كبيرة أو كانت النهاية حادة جدا ، فسوف تتلف الديدان أثناء الحقن المجهري (الفيديو 1 والشكل 3A-F). - عندما يتدفق السائل جيدا من الإبرة ، حرك شريحة الحقن المجهري إلى نطاق التشريح وضع قطرات من زيت الهالوكربون 1-2 ميكرولتر على وسادة الأجار لوضع الديدان.
- انقل 20-30 شابا بالغا من Strongyloides إلى صفيحة NGM بنسبة 2٪ بدون بكتيريا لمدة 5 دقائق على الأقل لإزالة البكتيريا السطحية الزائدة واختيار الديدان المفردة للحقن المجهري. أضف المزيد من الديدان إلى لوحة NGM حسب الحاجة أثناء الحقن.
7. الحقن الدقيق Strongyloides
- استخدم كمية صغيرة من زيت الهالوكربون على اختيار دودة لاختيار أنثى شابة بالغة من Strongyloides مع 1-4 بيضات في الغدد التناسلية من صفيحة NGM 2٪ بدون بكتيريا.
- انقل الدودة إلى قطرة صغيرة من الزيت على وسادة الأجار. باستخدام اختيار الدودة ، ضع الدودة بلطف حتى لا يتم لفها وتكون الغدد التناسلية مرئية ويسهل الوصول إليها. لاحظ اتجاه الغدد التناسلية (الشكل 3G).
- ضع الدودة في مجال رؤية مجهر الحقن المجهري. تأكد من أن الغدد التناسلية على نفس جانب الإبرة ووضعها بحيث تتصل الإبرة بالغدد التناسلية بزاوية طفيفة (الشكل 3H ، I).
- أحضر طرف الإبرة إلى جانب الدودة في نفس المستوى البؤري. استهدف ذراع الغدد التناسلية بالقرب من منتصف الدودة. استخدم الحاقن الدقيق لإدخال الإبرة بلطف في الغدد التناسلية (فيديو 2).
- اضغط على الفور على الإبرة لملء ذراع الغدد التناسلية بالكامل بمحلول الحمض النووي. حدد بالعين متى تم حقن كمية كافية من السوائل (فيديو 2).
ملاحظة: قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 2 ثانية لملء الغدد التناسلية. - قم بإزالة الإبرة وتحقق لتحديد أن الجرح يغلق.
ملاحظة: الدودة تالفة جدا لإنتاج ذرية إذا برزت الغدد التناسلية من خلال جدار الجسم (الفيديو التكميلي S1). - كرر ذلك مع الذراع الأخرى من الغدد التناسلية إذا كان مرئيا.
- عند الانتهاء من الحقن ، تحقق بسرعة من عدم انسداد الإبرة عن طريق الضغط بطرف الإبرة على وسادة أجار. انقل الشريحة مع الدودة المحقونة إلى المجهر التشريحي.
- لاستعادة الدودة المحقونة ، ضع أولا بضع قطرات من BU على الدودة لتعويمها من وسادة الأجار.
- جمع كمية صغيرة من البكتيريا HB101 على اختيار دودة. المس الدودة مع البكتيريا الملتصقة على الدودة لإزالتها من السائل.
- انقل الدودة بلطف إلى لوحة الاسترداد ، وهي لوحة NGM بنسبة 2٪ تحتوي على حديقة HB101.
ملاحظة: يجب أن تبدأ الدودة في الزحف في غضون دقائق. - بعد حقن عدد قليل من الإناث ، أضف بعض الذكور غير المحقونين من لوحة المصدر.
ملاحظة: ما لا يقل عن ذكر واحد لكل خمس إناث هو خط أساس جيد؛ يفضل وجود فائض من الذكور. - كرر جميع الخطوات حتى يتم حقن عدد كاف من الإناث للتجربة.
- اترك البالغين على لوحة الاسترداد لمدة 1 ساعة على الأقل بعد الحقن للسماح للديدان بالتعافي والتزاوج.
8. استعادة وزراعة Strongyloides حقن
- جمع البراز بين عشية وضحاها من الحيوانات المضيفة غير المصابة ، باستخدام نفس البروتوكول كما هو الحال بالنسبة للحيوانات المصابة.
- امزج البراز غير الموبوء بكمية صغيرة من الفحم (نسبة البراز إلى الفحم من حوالي 2 إلى 1 لهذه اللوحات).
- صب كمية صغيرة من مزيج البراز والفحم في طبق بتري 6 سم مبطن بورق ترشيح رطب. تأكد من أن المزيج لا يلمس غطاء الطبق.
- قم بإغراق لوحة الاسترداد ب BU. باستخدام ماصة محددة في 3 ميكرولتر ، انقل الديدان إلى البراز في صفيحة الفحم البرازي. ضع الديدان مباشرة على البراز ، وليس على الفحم.
- تحقق من أن البالغين على صفيحة الفحم البرازي باستخدام منظار تشريح.
- لزراعة الديدان ، ضع اللوحة في غرفة رطبة ، أي صندوق بلاستيكي بغطاء محكم مبطن بمناشف ورقية رطبة.
ملاحظة: بعد 2 أيام ، سيكون هناك مزيج من مراحل اليرقات. بعد 5 أيام ، ستكون معظم اليرقات قد تطورت إلى iL3s. ستبقى بعض اليرقات الأصغر سنا. بعد 7 أيام ، يجب أن تكون جميع اليرقات iL3s.
9. جمع وفحص يرقات F 1 لاستعادة الجينات / الضربات القاضية
- باستخدام إعداد بيرمان ، اجمع اليرقات من ألواح زراعة البراز والفحم الصغيرة بعد الحقن. للحصول على أكبر عدد ممكن من اليرقات ، انتظر لمدة 2 ساعة على الأقل قبل استعادة الديدان من جهاز بيرمان.
- ركز اليرقات في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل كما هو الحال في الخطوات 4.10-4.14 وانقل اليرقات إلى زجاج ساعة صغير باستخدام BU.
- إذا تم استخدام اليرقات في التجارب السلوكية ، فاستخدم ألواح NGM بنسبة 2٪ مع حديقة سميكة من HB101 للفحص.
- نقل 20-30 يرقات إلى العشب HB101.
ملاحظة: سوف تبطئ البكتيريا حركة اليرقات. - تحت مجهر تشريح التألق ، حدد اليرقات التي تعبر عن الجين المتحول محل الاهتمام. استخدم اختيار دودة لتحديد اليرقات المعدلة وراثيا ونقلها إلى زجاج ساعة صغير مع BU.
- استخدم لوحة HB101 جديدة لفحص مجموعة صغيرة أخرى من اليرقات. عندما يتم جمع ما يكفي من اليرقات للاستخدام التجريبي ، عالج ألواح HB101 والديدان الزائدة باليود المخفف (50٪ من يود Lugol المخفف في الماء) وتخلص منها كنفايات بيولوجية. بدلا من ذلك ، اقتل الديدان الزائدة باستخدام منظف بيت الكلب المركز الذي يحتوي على كلوريد الأمونيوم ألكيل بنزيل.
- استخدم الديدان على الفور أو اتركها في زجاج ساعة ضحل في كمية صغيرة من BU بين عشية وضحاها.
ملاحظة: قد تصبح الديدان ناقصة الأكسجة إذا كان السائل عميقا جدا. من الممكن أن يؤثر ترك اليرقات في BU بين عشية وضحاها على بعض السلوكيات ؛ لذلك ، استخدم اليرقات للتجارب السلوكية في غضون 6 ساعات.
- نقل 20-30 يرقات إلى العشب HB101.
- إذا تم استخدام اليرقات للفحص المجهري وليس للفحوصات السلوكية ، فقم بشل حركة الديدان عن طريق شلل النيكوتين بشكل عكسي للفحص.
- باستخدام شفرة حلاقة ، قم بتسجيل شبكة على الجزء السفلي البلاستيكي للوحة 10 سم من التاكسي الكيميائي12 لتسهيل تتبع موقع الديدان على اللوحة.
- إسقاط ~ 3 ميكرولتر من اليرقات في BU في مربع على الشبكة. املأ أكبر عدد ممكن من المربعات حسب الحاجة. لا تستخدم تلك الموجودة بالقرب من حواف اللوحة ، لأن اليرقات قد تزحف إلى جانبي اللوحة.
- أضف قطرات 15-20 ميكرولتر من 1٪ من النيكوتين في الماء إلى قطرات الدودة.
ملاحظة: بعد 4 دقائق ، ستصاب الديدان بالشلل. - فحص الديدان باستخدام مجهر تشريح التألق.
- استخدم اختيار دودة لنقل اليرقات المعدلة وراثيا إلى زجاج ساعة صغير مع 1-2 مل من BU.
ملاحظة: سوف تصاب اليرقات بالشلل لعدة ساعات ويمكن تركيبها بسهولة على شرائح المجهر للفحص المجهري. إذا تركت بين عشية وضحاها في BU ، فسوف يتعافى iL3s ويمكن استخدامه لبعض الفحوصات أو عدوى مضيف الثدييات. ومع ذلك ، قد يؤثر شلل النيكوتين والحضانة بين عشية وضحاها في BU على بعض السلوكيات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إذا نجحت التجربة ، فإن يرقات F1 ستعبر عن النمط الظاهري للجين و / أو المتحور (الشكل 4). ومع ذلك ، فإن معدلات التحول متغيرة للغاية وتعتمد على التركيبات ، وصحة الديدان ، وظروف زراعة ما بعد الحقن ، ومهارة المجرب. بشكل عام ، ستنتج التجربة الناجحة يرقات F1 >15 لكل أنثى محقونة ومعدل تحول يبلغ >3٪ لعلامات الفلورسنت. إذا كان العدد الإجمالي للذرية الحية في المتوسط أقل من 10 يرقات / أنثى ، فمن الممكن أن يكون البناء ساما ، وأن اليرقات المتحولة لا تبقى على قيد الحياة. العثور ع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يفصل بروتوكول الحقن المجهري هذا طرق إدخال تركيبات للطفرات العابرة و CRISPR / Cas9 بوساطة في S. stercoralis و S . ratti. بالنسبة لكل من S. stercoralis و S . ratti ، يخضع البقاء على قيد الحياة بعد الحقن ومعدل التحول أو الطفرات لعدة متغيرات يمكن ضبطها بدقة.
أول اعتبار حاسم للتحول الناجح هو كيفية بناء الجينات المحورة البلازميدية. وقد وجدت الدراسات السابقة أن التعبير عن الجينات المحورة الخارجية في Strongyloides يتطلب استخدام مروجي Strongyloides 5 'و 3' ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
كانت pPV540 و pPV402 هدايا طيبة من الدكتور جيمس لوك في جامعة بنسلفانيا. نشكر أسترا براينت على تعليقاتها المفيدة على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل باحثي صندوق بوروز ويلكوم في جائزة التسبب في الأمراض ، وجائزة الباحث في معهد هوارد هيوز الطبي ، والمعاهد الوطنية للصحة R01 DC017959 (E.A.H).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (&ناقص;)-النيكوتين ، & ge ؛ 99٪ (GC) ، سائل | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | نيكوتين للديدان المشلولة |
| 3 "مشبك C حديدي ، 3 "× 2" (السعة × العمق) | VWR | 470121-790 | C-clamp لتأمين الإعداد لأعلى مقاعد البدلاء |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose للشرائح |
| فحم العظام ، سطل 4 أرطال ، 10 × 28 شبكة | Ebonex | n / a | الفحم لمزارع |
| الفحم البرازيفحم العظام ، حبيبات ، 10 × 28 شبكة | فحم Reade | bonechar10x28 | للمزارع البرازية (بديل لما سبق) |
| مناور دقيق خشن | Narishige | MMN-1 | مناور دقيق خشن |
| Corning Costar Spin-X مرشحات أنبوب الطرد المركزي | فيشر | 07-200-385 | الفلتر الدقيق |
| غطاء زجاجي ، 48 × 60 مم ، سمك رقم 1 | مختبر أبحاث الدماغ | 4860-1 | أغطية (48 × 60 مم) |
| أطباق بتري عميقة ، نسخة ثقيلة مع 6 فتحات تهوية ، قطر 100 مم | VWR | 82050-918 | أطباق بتري 10 سم (لمزارع الفحم البرازية) |
| قاعدة معوجة إيسكو مع قضيب | فيشر | 12-000-101 | حامل لجهاز بيرمان |
| الحاقن الدقيق Eppendorf FemtoJet | VWR | 89009-310 | لملء إبر الحقن |
| Fisherbrand hypopads ماصة | فيشر | 14-206-62 | ورق مقاعد البدلاء (للتحضير) |
| الحديد الزهر Fisherbrand | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand أكواب البولي بروبلين ثلاثية الزوايا | فيشر | 14-955-111F | دورق بلاستيكي (للخلط) |
| أكواب البولي بروبلين ثلاثية الزوايا من Fisherbrand | Fisher | 14-955-111F | دورق بلاستيكي (لدلو الصيد / دلو الماء) |
| أكواب البولي بروبلين ثلاثية الزوايا من فيشربراند | فيشر 14-955-111F | دورق بلاستيكي (x2) (لصنع حامل) | |
| إيبوكسي غوريلا في حقنة | غراء McMaster-Carr | 7541A51 | (لإرفاق الأنابيب) |
| زيت الهالوكربون 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | زيت الهالوكربون |
| أنابيب مطاطية من السيليكون بدرجة حرارة عالية للأغذية والمشروبات ، 1/2 "معرف ، 5/8" OD | McMaster-Carr | أنابيب 3038K24 | (للقمع) |
| قمع KIMAX ، جذع طويل ، 60 درجة ؛ الزاوية ، Kimble Chase | VWR | 89001-414 | قمع Baermann |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Benchtop | Pressup Fisher | 15-235-101 | ورق مقاعد البدلاء (للتحضير) |
| مجهر مجسم Leica مع مضان | Leica | M165 FC | GFP مجهر مجسم لتحديد وفرز الديدان المعدلة وراثيا |
| حاقن دقيق حامل إبرة الذراع مستقيم | النحاس Tritech | MINJ-4 | حامل إبرة الحقن المجهري |
| نظام الحاقن | الدقيق Tritech | MINJ-1 | نظام الحقن المجهري |
| المنغولية | مختبرات نهر تشارلز | 213-الجربوع المنغولية | لصيانة S. stercoralis ، الذكور 4-6 أسابيع |
| Nasco Whirl-Pak سهلة الإغلاق ، 18 أوقية | VWR | 11216-776 | أكياس عينة Whirl-Pak |
| تول نايلون (شبكة) | أقمشة Jo-Ann | zprd_14061949a | شبكة نايلون لحامل Baermann |
| سلك بلاتيني ، مقياس 36 ، لكل بوصة | سلك بلاتيني / إيريديوم من Thomas Scientific | 1233S72 | لاختيارات الدودة |
| خافضات اللسان البيوريتانية ، 152 مم (طول) × 17.5 مم (عرض) | VWR | 62505-007 | عصي خشبية (لخلط العينات) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep |
| Kitالفئران الطويلة إيفانز | Envigo | 140 HsdBlu: LE فئران إيفانز الطويلة | لصيانة S. ratti ، أنثى 4-6 أسابيع |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd: فئران Sprague Dawley SD | لصيانة S. ratti ، أنثى 4-6 أسابيع |
| صناديق تخزين شفافة مع أغطية ، سعة 1.6 لتر ، 7-5 / 8 بوصة × 5-5 / 16 بوصة × 4-5 / 16 بوصة | 452369 | لمستودع المكتب للغرفة | |
| المرطبةلوحة الراعي ، 8 × 16.5 بوصة | Newco | 999589 | techboard |
| أرضية سلكية مرتفعة من الفولاذ المقاوم | للصدأ Ancare | R20SSRWF | قيعان قفص سلكية |
| StalkMarket ملاعق أدوات مائدة قابلة للتحلل ، 6 بوصات ، بيضاء ، عبوة من 1,000 | ملعقة من مستودع Office | Depot 9587303 | طبق |
| Stender ، نوع التراص ، 37 × 25 مم | كارولينا (علوم) | 741012 | نظارات الساعة (صغيرة ، مستديرة) |
| مجهر | مجسم Motic | K-400 LED | تشريح نطاق الإعدادية |
| حمل التخزين ، لون واضح / أبيض ، ارتفاع خارجي 4-7 / 8 بوصة ، الطول الخارجي 13-5 / 8 بوصة ، | 53GN16 | للغرفة المرطبة | |
| مجتذب الماصات الدقيقة Sutter | P-30 / P | مجتذب إبرة مع خيوط البلاتين / الإيريديوم | |
| نظارات ساعة سيراكيوز | فيشر | S34826 | نظارات الساعة (كبيرة ، مستديرة) |
| المشابك ذات الزاوية الثابتة Thermo Scientific Castaloy مشابك | فيشر | 05-769-2Q | (2x) |
| ثلاثي المحاور معلقة زيت عصا التحكم المائية المائية micromanipulator | Narishige | MM0-4 | دقيقة micromanipulator |
| United Mohr pinchcock المشابك | فيشر | S99422 | مشابك قرصة (2x) |
| أطباق بتري ذات تهوية حادة الحواف (قطر 60 مم) | Tritech أطباق بتري بحثية | T3308P | 6 سم (لمزارع الفحم البرازي على نطاق صغير) |
| المناديل الخفيفة VWR | VWR | 82003-820 | بطانة لزجاج ساعة حامل Baermann |
| ، مربع ، 1-5 / 8 في | كارولينا (العلوم) | نظارات الساعة 742300 | (صغيرة ، مربعة)دوائر |
| عادية من الدرجة النوعية Whatman ، الدرجة 1 ، قطر 5.5 سم | ورق ترشيح فيشر | 09-805B | (لبتري 6 سم أطباق) |
| دوائر عادية من الدرجة النوعية Whatman ، من الدرجة 1 ، قطر 9 سم | ورق ترشيح فيشر | 09-805D | (لأطباق بتري مقاس 10 سم) |
| الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات العالمية للأداة الدقيقة ، 1.2 مم × 4 في | Fisher | 50-821-813 | لإبر الحقن المجهري |
| سكاكين X-Acto ، سكين رقم 1 مع رقم 11 شفرة | Depot | 238816 | سكاكين X-Acto بدون شفرات لحمل أعواد الدودة |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n / A | مجهر مقلوب |
المراجع
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468(2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482(2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675(2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871(2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417(2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192(2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483(2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118(2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587(2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370(2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709(2021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
