إعادة بناء وتحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل العصبية الرقيقة تحت الخلوية باستخدام بيانات الفحص المجهري الإلكتروني لشعاع الأيونات المركز

ملخص

خط أنابيب منهجي مرن لتحديد العمليات العصبية الرقيقة تحت الخلوية وتصورها وتحديدها ضمن أحجام صور الفحص المجهري الإلكتروني للأشعة الأيونية المركزة باستخدام حزم برامج مفتوحة المصدر سهلة الاستخدام.

الملخص

تسمح التطورات الحديثة في تقنيات المجهر الإلكتروني الماسح الآن بالتحليل السريع ثلاثي الأبعاد (3D) للعمليات تحت الخلوية فائقة النحافة. هنا ، يتم تقديم خط أنابيب منهجي لتحديد العمليات العصبية الرقيقة وتصورها وتحليلها ، مثل تلك التي تسقط في العروات قبل المشبكية للخلايا العصبية الأخرى (تسمى "العمود الفقري"). باستخدام حزم البرامج المتاحة مجانا ، يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام شجرة القرار لتحديد الهياكل الخلوية الفرعية العصبية الشائعة باستخدام المعايير المورفولوجية داخل أحجام صور المجهر الإلكتروني لمسح الحزمة الأيونية المركزة (FIB-SEM) ، مع إيلاء اهتمام خاص لتحديد مجموعة متنوعة من العمود الفقري التي تسقط في أعمدة ما قبل المشبكي. على وجه الخصوص ، يصف هذا البروتوكول كيفية تتبع المشابك داخل نقاط الاشتباك العصبي لإنتاج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لهذه الإسقاطات الفرعية الرقيقة ، وعصباتها الأم ، وشركائها بعد المشبكي. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن البروتوكول قائمة بالبرامج مفتوحة المصدر المتاحة مجانا لتحليل بيانات FIB-SEM ويقدم نصائح (على سبيل المثال ، التنعيم ، الإضاءة) نحو تحسين عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للتصور والنشر. يوفر هذا البروتوكول القابل للتكيف نقطة دخول إلى التحليل النانوي السريع للهياكل الخلوية داخل أحجام صور FIB-SEM.

المقدمة

غالبا ما تستفيد التحقيقات في علاقات البنية والوظيفة للمكونات الخلوية الفرعية الرقيقة بالنانومتر من التصور والتحليل ثلاثي الأبعاد¹. ومع ذلك ، فقد تم تقييد دراسات الفحص المجهري الإلكتروني للمقطع التسلسلي زمنيا ومكانيا بسبب ضرورة استخدام سكين ماسي لقطع ومحاذاة مئات إلى آلاف المقاطع التسلسلية فائقة النحافة ≥40 نانومتر. حدت هذه القيود من القدرة على أخذ عينات وتحليل فعال للهياكل الفرعية الخلوية الرقيقة (قطرها <40 نانومتر) ، وقد أعاقت ضرورة أن تصبح بارعا في التقسيم التسلسلي فائق النحافة تطبيق التحليلات الهيكلية ثلاثية الأبعاد^2،3. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة....

البروتوكول

1. بيانات حجم الصورة وحجم الكائن تحت الخلوي: الاعتبارات والتسجيل

1. احصل على حجم صورة FIB-SEM عالي الجودة لمنطقة الاهتمام التي تحتوي على الكائنات الخلوية الفرعية ذات الاهتمام.
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول أجزاء من حجم صورة FIB-SEM من القشرة البصرية الأولية للنمس المراهق المتأخر (24.2 × 16.2 × 2.4 ميكرومتر ، 4 نانومتر فوكسيل متناحية) ، وحجم FIB-SEM يمكن الوصول إليه مجانا من الحصين CA1 للفئران البالغة (10.2 × 7.7 × 5.3 ميكرومتر ؛ فوكسل متناحية) 5 نانومتر) الذي يوفره مختبر نوت (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). من الأهمية بمكان تحضير كتل الأنسجة ل FIB-SEM باستخدام بروتوكول يحافظ على تفاصيل البنية التحتية وينتج ت....

النتائج

تحديد النسبة المئوية للسبينول المشبكي داخل مجموعة العروة قبل المشبكية المثيرة في القشرة البصرية الأولية للنمس
على الرغم من أن النتوءات الشبيهة بالعمود الفقري من الخلايا العصبية إلى العروات قبل المشبكية المثيرة قد لوحظت لعقود^19،26 ، إلا أن أهميتها المحتملة للوظيفة المشبكية ظلت غامضة. تم تصميم هذه التجارب لتحديد نسبة العروات المثيرة قبل المشبكي التي تحتوي على شوط أثناء تطور ما بعد الولادة في القشرة البصرية الأولية للنمس (V1) للتأكد من الأهمية ال.......

المناقشة

يمكن أن ينتج خط أنابيب تحليل حجم الصورة FIB-SEM عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد موثوقة وقياسات كمية للهياكل الخلوية الفرعية الرقيقة. في حين أن التقنيات شبه الآلية الحالية التي تستخدم الشبكة العصبية العميقة وخوارزميات التجزئة يمكن أن تزيد من السرعة والكفاءة في إعادة بناء الهياكل الخلوية التي تمتلك تباينا غشائيا عاليا نسبيا داخل أحجام كبيرة للصور³³ ، فإن العديد من الهياكل الخلوية الفرعية (على سبيل المثال ، العمود الفقري ، الشبكة الإندوبلازمية الملساء ، الجسيمات الد.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
فيجي (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
إعادة بناء			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
مؤسسة		خلاط الخلاط	https:/www.blender.org