Method Article

طريقة بسيطة معدلة لتحريض احتشاء عضلة القلب في الفئران

DOI:

10.3791/63042

⸱

December 3rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحت التخدير الكافي ، تم إخراج قلب الفأر من خلال الفضاء الوربي ، وتم إحداث احتشاء عضلة القلب بنجاح عن طريق ربط الشريان النازل الأمامي الأيسر (LAD) باستخدام مواد متاحة بسهولة في معظم المختبرات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل احتشاء عضلة القلب (MI) أحد الأسباب الرئيسية للوفاة. تستخدم نماذج MI على نطاق واسع للتحقيق في الآليات المرضية لإعادة عرض ما بعد MI وتقييم العلاجات الجديدة. تم استخدام طرق مختلفة (على سبيل المثال ، علاج الأيزوبروتيرينول ، والإصابة بالتبريد ، وربط الشريان التاجي ، وما إلى ذلك) للحث على MI. بالمقارنة مع علاج الأيزوبروتيرينول والإصابة بالتبريد ، قد يعكس ربط الشريان التاجي بشكل أفضل الاستجابة الإقفارية وإعادة التشكيل المزمن بعد MI. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية لربط الشريان التاجي في الفئران تمثل تحديا تقنيا. تصف الدراسة الحالية عملية بسيطة وفعالة لتحريض MI في الفئران بمواد متاحة بسهولة. تم قطع جلد صدر الفأر تحت التخدير المستقر. تم إخراج القلب على الفور من خلال الفضاء الوربي بعد الفصل الحاد بين الصدرية الكبرى والصدرية الصغرى. تم ربط الفرع الهابط الأمامي الأيسر (LAD) بخياطة 6-0 3 مم من أصله. بعد ربط LAD ، أشار التلوين بكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل تترازوليوم (TTC) إلى تحريض ناجح ل MI والتغيرات الزمنية لحجم ندبة ما بعد MI. وفي الوقت نفسه ، أظهرت نتائج تحليل البقاء على قيد الحياة وفيات علنية في غضون 7 أيام بعد MI ، ويرجع ذلك أساسا إلى تمزق القلب. علاوة على ذلك ، أظهر تقييم تخطيط صدى القلب بعد MI تحريضا ناجحا لضعف الانقباض وإعادة تشكيل البطين. بمجرد إتقانه ، يمكن إنشاء نموذج MI في الفئران في غضون 2-3 دقائق بمواد متاحة بسهولة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل احتشاء عضلة القلب (MI) أحد الأسباب المهمة للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم1،2،3،4،5. على الرغم من إعادة التروية في الوقت المناسب ، يوجد حاليا نقص في العلاجات الفعالة لعلاج إعادة تشكيل القلب بعد MI. في المقابل ، بذلت جهود كبيرة للاستكشاف الميكانيكي واستغلال العلاج ل MI6،7،8. وتجدر الإشارة إلى أن إنشاء نماذج MI هو شرط أساسي لتحقيق هذه الغايات.

تم اقتراح عدة طرق (على سبيل المثال ، علاج الأيزوبروتيرينول ، والإصابة بالتبريد ، وربط الشريان التاجي ، وما إلى ذلك) للحث على نماذج MI في الحيوانات الصغيرة. علاج الأيزوبروتيرينول هو طريقة بسيطة لتحريض MI ، لكنه لا يمكن أن يحفز احتشاء المنطقة المستهدفة9. تؤدي الإصابة بالتبريد إلى نخر عضلة القلب عن طريق توليد بلورات الثلج وتعطيل غشاء الخلية بدلا من نقص التروية المباشر10. على النقيض من ذلك ، يسمح ربط الشريان التاجي بالتحكم الدقيق في موقع الانسداد ومدى منطقة الاحتشاء ويلخص بأمانة استجابة إعادة البناء بعد الاحتشاء11,12. عادة ما يتم إجراء ربط الشريان التاجي بعد التنبيب والتهوية الميكانيكية وبضع الصدر ، وهو أمر يمثل تحديا تقنيا13,14. تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات المعدلة لربط الشريان التاجي (على سبيل المثال ، التهوية الحرة) وعززت تحريض MI ، ولكن لا توجد عروض بصرية مفصلة15،16،17. تشكل هذه القضايا حاجزا ماليا وتقنيا كبيرا أمام المجموعات الراغبة في المشاركة في البحث باستخدام نماذج MI. يقدم هذا التقرير نهجا لتحريض MI في الفئران. الطريقة الحالية سهلة وموفرة للوقت وتستخدم الأدوات والمعدات الجراحية الموجودة بسهولة في معظم المختبرات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء التجارب التي تنطوي على عمل حيواني مع جميع الموافقات اللازمة من لجنة أخلاقيات رعاية المختبر في مستشفى رينجي ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، كلية الطب (R52021-0506). تم استخدام إناث وذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع في الدراسة.

1. إعداد معدات التخدير المبسطة (اختياري)

ملاحظة: هذا إعداد اختياري قبل الجراحة ويمكن استبداله بتخدير قابل للمعايرة كما هو مذكور في القسم 2. يجب استشارة لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية والطبيب البيطري (الأطباء البيطريين) قبل تكييف هذا الإعداد في الإجراءات الحيوانية.

  1. خذ أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وقم بعمل قطع عمودي على المحور الطويل للأنبوب على بعد حوالي 3 سم من الفتحة.
    ملاحظة: تأكد من أن القطع أكبر من نصف المحيط الدائري لتجويف الأنبوب بحيث يمكن إدخال الصمام بنجاح.
  2. حفر ثقوب (قطرها 2 مم) في جدار أنبوب الطرد المركزي بين القطع وفتحة الأنبوب.
  3. اقطع قطعة مناسبة الحجم من الصمام من صفيحة بلاستيكية وأدخل الصمام في القطع الموجود على جدار الأنبوب.
    ملاحظة: يمكن استخدام الصمام للتحكم في معدل إطلاق الأيزوفلوران عن طريق تغيير عمق الإدخال.
  4. داخل غطاء الدخان ، قم بقطع الجزء السفلي من الأنبوب وتوصيله بإمدادات الأكسجين. ضع كرة قطنية بالقرب من الطرف السفلي للأنبوب ، وأضف حمولة 0.5 مل إيزوفلوران (كما تم الحصول عليها ، انظر جدول المواد) على كرة القطن ، وأغلق الصمام.
  5. اختبر فعالية التخدير عن طريق إخفاء الفئران بأنابيب معدة كما هو موضح أعلاه. راقب معدل التنفس وعمق التخدير عن طريق استجابة قرصة إصبع القدم.
    ملاحظة: يشير معدل التنفس الأقل من 10 مرات / 10 ثوان إلى التخدير المفرط ، ويجب تعديل عمق إدخال الصمام. بالنسبة لجميع الإجراءات التي تنطوي على التخدير ، يجب استخدام مرشح غاز مملوء بألواح الفحم المنشط (الشكل 1A-i) ، ويجب إجراء الجراحة داخل غطاء.

2. التحضير الجراحي والتخدير

  1. قم بإعداد وتعقيم جميع الأدوات المطلوبة في يوم الجراحة ، بما في ذلك زوج من الملقط ، ومرقئ البعوض الصغير ، ومقص جراحي ، وزوجان من حاملات الإبر ، وخياطة جراحية من الحرير 4-0 ، وخياطة جراحية من الحرير 6-0 ، وفلتر غاز ، ومصدر ضوء (انظر جدول المواد) (الشكل 1 أ).
  2. ارتد قناعا جراحيا وقفازات معقمة.
  3. ضع كريم مزيل الشعر على صندوق الماوس وانتظر لمدة 1 دقيقة. امسح بلطف كريم مزيل الشعر والشعر بشاش مبلل.
  4. امسك الماوس باليد المهيمنة بعد إزالة الشعر. تحفيز التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران المتبخر (4٪) مع إمداد الأكسجين (1 لتر / دقيقة) والحفاظ على 2-3٪ إيزوفلوران.
  5. تأكد من التخدير الكافي بسبب عدم استجابة قرصة إصبع القدم.
  6. ضع كريم العين المعقم على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
  7. تأمين الفئران على منصة الجراحة في موقف ضعيف. ضع مسحات البوفيدون واليود (انظر جدول المواد) على الصدر ثلاث مرات وقم بتغطية الصدر المطهر بستارة معقمة.

3. تحريض احتشاء عضلة القلب

  1. تغيير القفازات الملوثة لضمان العقم.
  2. اصنع قطعا جلديا بطول 0.5 سم على طول الخط الذي يربط الخنجري والإبط بعد الكتلة المحلية مع يدوكائين.
  3. افصل بصراحة بين العضلات الصدرية الكبرى والصدرية الصغيرة باستخدام ملقط ومرقئ البعوض الصغير لفضح الفضاء الوربي الرابع.
  4. افتح المساحة الوربية الرابعة باستخدام مرقئ البعوض الصغير.
  5. قم بإخراج القلب عن طريق دفع القلب نحو الفضاء الوربي الرابع بإصبع السبابة في اليد اليسرى.
  6. تأمين القلب باليد اليسرى ، وربط الفرع الأمامي الأيسر النازل مع خياطة 6-0 3 ملم من أصله.
  7. ضع القلب مرة أخرى في التجويف الصدري بسرعة.
    ملاحظة: من الآمن إخراج القلب من الخارج لمدة تقل عن 30 ثانية.
  8. قم بإخلاء الهواء من التجويف الصدري بضغطة لطيفة على تجويف الصدر يدويا.
  9. أغلق طبقة العضلات فوق الأضلاع بخياطة حريرية 6-0.
  10. أغلق الجلد بخياطة حرير 4-0.
  11. ضع الفئران على وسادة (37 درجة مئوية) مباشرة بعد العملية.
  12. حقن البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغ / كغ) تحت الجلد كل 4-6 ساعات للحد من آلام ما بعد الجراحة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  13. أعد الفئران التي تم تشغيلها إلى أقفاص عند الشفاء التام.
    ملاحظة: سيتم استرداد الفئران بالكامل في غضون 3-5 دقائق بعد الجراحة.
  14. راقب الفئران بعناية وقدم الطعام الرطب لمدة تصل إلى 7 أيام.

4. حصاد الأنسجة

  1. التضحية بالفئران في نقاط زمنية مختلفة بعد إنشاء MI عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. تأمين الفئران التي تم التضحية بها على منصة الجراحة في وضع ضعيف.
  3. قم بعمل شق بطني (~ 3-4 سم) في الجزء العلوي من البطن. قطع الأضلاع من كلا جانبي تجويف الصدر ، وإزالة الحجاب الحاجز.
  4. قم بتغذية القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد سعة 10 مل (1x PBS ، 4 درجات مئوية) من خلال الحقن داخل البطيني.
  5. اجمع القلب عن طريق قطع جذر الأبهر وخزن القلب على الفور عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: وفقا لتجربة المؤلفين ، من الممكن إجراء تلطيخ TTC في غضون أسبوعين من التخزين.
  6. صبغ القلب بكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم (TTC).
    1. قطعي القلب المتجمد إلى أقسام بسمك 1 مم على الثلج باستخدام شفرات الحلاقة.
    2. احتضان شرائح القلب المحضرة في محلول TTC 1٪ (مذاب في 1x PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: بعد 15 دقيقة من الحضانة ، تخلص من محلول TTC واغمر شرائح القلب الملطخة في 1x PBS.
  7. صور الشرائح باستخدام كاميرا رقمية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 البروتوكول التجريبي وبعض الخطوات الحاسمة. معدات التخدير المبسطة تسبب التخدير. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، كان التخدير المستحث مستقرا ، كما ينعكس في معدلات التنفس العادية (تراوحت من 90-107 أنفاس / دقيقة في الفئران المختبرة). بعد ربط الشريان التاجي ، أشار تحليل تلطيخ TTC إلى تحريض ناجح لاحتشاء عضلة القلب والتغيرات الزمنية لحجم ندبة ما بعد MI (الشكل 2B). وفي الوقت نفسه ، أظهرت نتائج تحليل البقاء على قيد الحياة وفيات علنية ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأظهر هذا التقرير بروتوكولا سهلا لتحريض MI في الفئران ذات المواد المتاحة بسهولة، والذي تم تعديله من طريقة أبلغ عنهاGAO 16. لا غنى عن نماذج Murine MI للاستكشاف الميكانيكي وشاشة الأدوية لخلل وظيفي بعد MI وإعادة عرض12. من بين التقنيات الحالية لتحريض MI ، يمثل ربط الشريان التاجي الأكثر شيوعا. يلخص ربط الشريان التاجي بأمانة طبيعة نقص تروية احتشاء عضلة القلب ويؤدي إلى شفاء الندبة واستجابة إعادة تشكيلها على غرار السيناريو السريري18,19

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81930007 ، 81625002 ، 81800307 ، 81470389 ، 81500221 ، 81770238) ، وبرنامج شنغهاي للقادة الأكاديميين المتميزين (18XD1402400) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (201409005200) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ للمواهب (2020PJD030) ، ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (2020M671161 ، BX20190216).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2،3،5-Triphenyltetrazolium كلوريدSIGMAT8877-25GTTC تلطيخ
4-0 خياطة الحريرYUANKANG4-0أداة جراحية
الأوتوكلافHIRAYAMAHVE-50التعقيم للبوبرينورفين الصلبة
Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co.، Ltd.H10940181يقلل من آلام ما بعد الجراحة
أنبوب الطرد المركزيالأمل البيولوجي1850-K15ML
كريم مزيل الشعرZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701عامل إزالة الشعر لحيوانات المختبر
ForcepRWDF12028أداة جراحية
فلتر الغازZHAOXINSA-493حماية المشغل
IsofluraneRWD20071302تستخدم للتخدير
مصدر الضوءBeijing PDVLG-150Bمصباح التشغيل
إرقاء البعوض الصغيرFST13011-12إبرة أداة جراحية
BINXIONG42180104أداة جراحية
وخياطة الحرير 6-0إبرة أداة جراحيةJIAHESC086
ShangHaiJZJ32030أداة جراحية
حامل إبرةShangHaiJZJ32010أداة جراحية
مسحات بوفيدون اليودSingleLadyGB26368-2010مقص تطهير الجلد
CNSTRONGJYJ1030أداة جراحية
كريم العين المعقمShenyang Xingqi Pharmaceutical Co.، Ltd.H10940177يمنع جفاف القرنية
نظام تصوير بالموجات فوق الصوتية فائق الدقة للحيوانات الصغيرةVisualSonicsVevo 2100تحليل تخطيط صدى القلب
إبرة حامل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074(2018).
  2. Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
  3. Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
  4. Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
  5. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  6. Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
  7. Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
  8. Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
  9. Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
  10. vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
  11. Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
  12. Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
  13. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  14. Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
  15. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  16. Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
  17. Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
  18. Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
  19. Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myocardial InfarctionCoronary Artery LigationMouse MI ModelVentricular RemodelingTTC StainingPost MI RemodelingContractile DysfunctionEchocardiographic AssessmentCardiac RuptureIntramyocardial Injection

Related Articles