Method Article

طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران باستمرار

DOI:

10.3791/63056

⸱

November 11th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعيار الذهبي في أمراض القلب للتجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية هي خلايا عضلة القلب. توضح هذه المقالة التكيفات مع تقنية غير Langendorff لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن الحاجة إلى طرق قابلة للتكرار ولكنها بسيطة تقنيا تنتج خلايا عضلية قلبية عالية الجودة أمر ضروري للبحث في بيولوجيا القلب. التجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية (على سبيل المثال ، الانكماش ، الفيزيولوجيا الكهربية ، دورة الكالسيوم ، إلخ) على خلايا عضلة القلب هي المعيار الذهبي لإنشاء آلية (آليات) المرض. الفأر هو النوع المفضل للتجارب الوظيفية والتقنية الموصوفة مخصصة لعزل خلايا عضلة القلب في الفأر. تتطلب الطرق السابقة التي تتطلب جهاز Langendorff مستويات عالية من التدريب والدقة لقنية الأبهر ، مما يؤدي غالبا إلى نقص التروية. يتحول المجال نحو طرق عزل خالية من Langendorff بسيطة وقابلة للتكرار وتنتج خلايا عضلية قابلة للحياة للحصول على البيانات الفسيولوجية والثقافة. تقلل هذه الطرق بشكل كبير من وقت نقص التروية مقارنة بقنية الأبهر وتؤدي إلى خلايا عضلة القلب التي يتم الحصول عليها بشكل موثوق. يتضمن تكيفنا مع طريقة Langendorff-free التروية الأولية بمحلول إزالة الثلج البارد ، واستخدام منصة تثبيت تضمن إبرة ثابتة أثناء التروية ، وخطوات هضم إضافية لضمان الحصول على خلايا عضلة القلب بشكل موثوق لاستخدامها في القياسات الوظيفية والثقافة. هذه الطريقة بسيطة وسريعة الأداء وتتطلب القليل من المهارة الفنية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لعقود من الزمان ، كانت الفكرة الأساسية في أدبيات بيولوجيا القلب هي الآلية الجزيئية للعمل. يجب إنشاء آلية العمل من أجل نشر دراسات موثوقة. هناك استراتيجية راسخة لتحديد الآلية الجزيئية وهي دراسات خلايا عضلة القلب المعزولة ، والتي تتطلب خلايا عضلية قلبية عالية الجودة لتحقيق بيانات موثوقة. التجارب الخلوية والجزيئية التي أجريت على خلايا عضلة القلب لتحديد آلية العمل هي المعيار الذهبي للتحقيق في الانكماش1 ، الفيزيولوجيا الكهربية2 ، الكالسيوم (Ca 2+) ركوب الدراجات3 ، الشعيرات العضلية حساسية الكالسيوم2+ 4 ، الهيكل الخلوي5 ، التمثيل الغذائي6 ، تأثيرات الهرمونات7 ، جزيئات الإشارة8 ، دراسات الأدوية9 الخ. أصبح الفأر هو النوع المفضل لمعظم تجارب بيولوجيا القلب نظرا لسهولة التلاعب الجيني ، وصغر حجمه ، وعمره القصير نسبيا ، وتكلفته المنخفضة ، وما إلى ذلك10. ومع ذلك ، فإن العزلة الموثوقة لخلايا عضلة القلب عالية الجودة للفأر ليست تافهة مع التقنيات الحالية.

تقوم المختبرات بعزل خلايا عضلة القلب منذ ما يقرب من 70 عاما11. تعتمد جميع تقنيات عزل خلايا عضلة القلب تقريبا على هضم القلب عبر إنزيمات مختلفة (كولاجيناز ، بروتياز ، تربسين ، إلخ). في الفترات المبكرة (خمسينيات القرن العشرين-ستينيات القرن العشرين) ، تم استخدام طريقة قطعة ، والتي تضمنت إزالة القلب ، وقطع إلى قطع أصغر بكثير واحتضان في محلول مع كولاجيناز / بروتياز / تربسين12. في سبعينيات القرن العشرين نفذت مختبرات "Langendorff" المحسن طريقة13 ، والتي عزل خلايا عضلة القلب باستخدام تقنية العزل القائمة على نضح الشريان التاجي (التروية الرجعية مع الإنزيم عبر جهاز Langendorff) ؛ لا تزال هذه التقنية هي الطريقة السائدة لعزل الخلايا العضلية في الحقل اليوم ، ~ بعد 50 عاما14،15،16. تحول العمل الأخير إلى تقليب القلب في الجسم الحي للحد من وقت نقص الأكسجة والضرر الإقفاري مما أدى إلى عزلة فائقة لعضلة القلب (غلة أفضل وجودة أعلى)17. في الآونة الأخيرة ، تطور هذا إلى أداء في الجسم الحي ، نضح القلب الخالي من لانجيندورف18،19،20،21،22. لقد طورنا تقنية عزل خلايا عضلة القلب الخالية من Langendorff بناء على تقنية Ackers-Johnson et al.18 وقمنا بتكييف مكونات مختلفة من العديد من تقنيات العزل السابقة. تشمل هذه التعديلات الرئيسية حقن مخزن مؤقت لإزالة الجليد البارد ودمج منصة داعمة لتثبيت الإبرة ، مما يسمح بتقليل التلاعب بالقلب. كما تم تفصيل هذه التقنية التحكم في درجة حرارة المخازن المؤقتة المحقونة (37 درجة مئوية) ، مما قلل من الوقت بين الحقن في الجسم الحي والهضم بسبب قلة تروية EDTA كما تم نشرهسابقا 18. عن طريق تقليل التلاعب بالقلب وبالتالي تقليل حجم موقع البزل ، يتم الحصول على نضح شامل ومستمر للشرايين التاجية. قمنا أيضا بتحسين التقنية باستخدام طريقة هضم قطعة ثانوية ، وكمية EDTA في المخزن المؤقت للتطهير المحقون ، وتغيير درجة الحموضة. تقنيتنا الموصوفة أكثر موثوقية وأكثر كفاءة ولا تتطلب تدريبا / ممارسة مكثفة مقارنة باستخدام جهاز Langendorff (الجدول 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ولاية أوهايو وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد الحل

ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول 2 لمعرفة تركيزات المخزن المؤقت.

  1. قبل العزلة (تصل إلى 2 أسابيع قبل عزل myocyte)
    1. قاعدة عازلة للتروية: تحضير 1 لتر من قاعدة التروية العازلة (كلوريد الصوديوم ، KCl ، NaH 2 PO 4 ،HEPES ، الجلوكوز ، و BDM) في 1 لتر من 18.2 متر مكعب · سم H2O. اضبط على الرقم الهيدروجيني7.4 قبل الترشيح المعقم 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يوم العزل.
    2. المخزن المؤقت للمقاصة: قم بإعداد 1 لتر من محلول المقاصة (كلوريد الصوديوم ، KCl ،NaH 2 PO 4 ، HEPES ، الجلوكوز ، EDTA ، و BDM) في 1 لتر من 18.2 متر مكعب · سم H2O. اضبط على الرقم الهيدروجيني7.4 قبل الترشيح المعقم 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يوم العزل.
    3. 100 mM محلول مخزون CaCl 2: يزن 1.11 جم من CaCl 2 ويذوب في 100 مل من 18.2 متر مكعب · سم H2 O. يخزن في درجة حرارة الغرفة حتى يوم العزل.
    4. حصص الليبراز: قم بإذابة 5 ملغ من الإنزيمات الهاضمة في 5 مل من الماء المعقم الخالي من RNase. تحضير 0.8 مل من القسامات وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى يوم العزل.
    5. تصفيح الأطباق: ضع 100 ميكرولتر من 40 ميكروغرام / مل من لامينين الفأر على أطباق بتري المعقمة ذات القاع الزجاجي 30 مل. اتركيه لمدة 30 دقيقة وأزيلي اللامينين الزائد. ضع اللامينين على طبق بتري مع حضانة الأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يوم العزل (يمكن استخدام أطباق بتري المصفحة لمدة تصل إلى 2 أسابيع).
    6. وسائط DMEM: في خزانة السلامة الأحيائية ، أضف 2.5 مل من FBS ، و 0.5 مل من البنسلين - الستربتومايسين (50 وحدة / مل - 50 ميكروغرام) ، و 1 مل من 500 mM BDM إلى 46 مل من DMEM. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يوم العزل (يمكن استخدام الوسائط لمدة تصل إلى 2 أسابيع).
    7. وسائط M199: تحضير 1 لتر من وسائط M199 (NaHCO3 و HEPES و L-glutathione و M199 و BDM و BSA) في 1 لتر من 18.2 متر مكعب عالي النقاء H2O. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.4 قبل الترشيح المعقم (مرشح 0.22 ميكرومتر). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يوم العزل.
    8. مخزون 500 mM BDM: أضف 0.5 جم من BDM إلى 10 مل من 18.2 متر مكعب · سم H2O. يخزن في 4 درجات مئوية حتى يوم العزل.
    9. إنشاء منصة التثبيت: عجينة اللعب العفن حول قاعدة الإبرة مشدودة في محبس Luer. العفن إلى طبق بتري الذي سيحتوي على القلب والتأكد من أن الإبرة في الارتفاع المناسب لحقن البطين (~ 5 مم فوق قاع الطبق).
  2. يوم العزلة
    1. عازلة التروية: في يوم العزل ، أضف 9.5 مجم من MgCl2 إلى 100 مل من قاعدة التروية العازلة. اتركيه يمتزج تماما قبل إزالة 30 مل من محلول التروية الكامل وضعه في زجاجة زجاجية نظيفة وواسعة الفم سعة 100 مل مع غطاء لولبي (مخزن هضم).
      ملاحظة: يمكن إجراء هذه الإضافات في يوم العزل دون تعديلات إضافية على الأس الهيدروجيني لأن إضافتها تغير الأس الهيدروجيني بشكل لا يكاد يذكر.
      1. قم بإزالة 12 مل من المخزن المؤقت للتروية واضبطه على الجانب (إيقاف المخزن المؤقت). صب 58 مل المتبقية من محلول التروية في زجاجة زجاجية أخرى نظيفة وواسعة الفم سعة 100 مل مع غطاء لولبي. قم بتخزين مخزن التروية المتبقي على حرارة 37 درجة مئوية طوال فترة العزل.
    2. المخزن المؤقت للهضم: أضف 7.5 ميكرولتر من 100 مللي مول CaCl2 إلى 30 مل من محلول التروية للحصول على تركيز نهائي يبلغ 25 ميكرومتر. قبل العزل مباشرة ، أضف 770 ميكرولتر من الليبراز إلى محلول الهضم لتركيز نهائي قدره 26 ميكروغرام / مل.
    3. إيقاف المخزن المؤقت: قم بإذابة 240 مجم من BSA في 12 مل من محلول التروية. يحفظ في درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال فترة العزل.
    4. تنظيف المخزن المؤقت: قم بإعداد حقنة سعة 3 مل من المخزن المؤقت للتطهير ومسح إبرة الفقاعات. تخزينها على الجليد حتى العزل.

2. إعداد مشعب

  1. قم بتنظيف المشعب الذي يتم التحكم في درجة حرارته باستخدام مخزن التروية المحضر حديثا ، مع الحرص على ضمان عدم بقاء فقاعات. باستخدام موصل قفل Luer ، قم بربط إبرة 27 G ، وخالية من الفقاعات. يعد المشعب الذي تم تطهيره ضروريا لعزل ناجح.

3. إعداد الحيوان

  1. حقن الفأر داخل الصفاق مع 100 ملغ / كغ من الكيتامين و 20 ملغ / كغ من الزيلازين بوزن الجسم مباشرة قبل العزل. استخدم هذا الإجراء ماوس C57Bl / 6 يبلغ من العمر 4 أشهر.
  2. إذا لزم الأمر ، ضع الماوس على وسادة جراحية ساخنة لتشجيع التخدير. خيمة أذرع الفأر ، ولصق الأطراف وقاعدة الذيل على حفاضات مختبر زرقاء. تأكد من تخدير الحيوان بالكامل عن طريق سحب منعكس قرصة إصبع القدم. ضع ستارة معقمة حول منطقة الجراحة.

4. إجراء عزل عضلة القلب

  1. فضح عظم الفأر ، والجانب إلى خط الوسط ، وقطع بالقرب من الأضلاع والإبط. قطع بلطف كامل من خلال الحجاب الحاجز ، وضمان جروح ضحلة لتجنب القلب. المشبك القص مع مرقئ وطي الأضلاع للخلف لفضح التجويف الصدري.
  2. قم بإزالة التامور برفق من القلب واقطعه بالكامل من خلال الوريد الأجوف السفلي ، بعيدا عن القلب على الفور. استخدم حقنة 3 مل مع إبرة 27 جم لحقن 3 مل بسرعة من محلول إزالة الثلج البارد في البطين الأيمن للقلب على مدى 1 دقيقة.
  3. امسك القلب برفق باستخدام الملقط واسحبه بعيدا عن الجسم ، وكشف أكبر قدر ممكن من الشريان الأورطي. باستخدام مرقئ ، قم بتثبيت الشريان الأورطي الصاعد ، مع الحرص على عدم تثبيت الأذينين ، واستئصال القلب من الصدر.
  4. انقل القلب المثبت بسرعة إلى غطاء طبق بتري من مادة البولي بروبيلين مع حوالي 10 مل من محلول التروية الدافئ. ضع القلب المثبت في المنصة الداعمة واستخدم إبرة 27 جم مثبتة متصلة بالمشعب لحقن 10 مل من محلول التروية 37 درجة مئوية الذي يتم التحكم في درجة حرارته في البطين الأيسر على مدار 5 دقائق.
  5. انقل القلب المثبت والمنصة الداعمة إلى طبق بتري مع ما يقرب من 5 مل من محلول الهضم. تبادل محاقن الإدخال لمحقنة سعة 50 مل مع 25 مل من محلول الهضم.
  6. قم بإزالة المشعب من أي فقاعات ومخزن التروية المتبقي قبل الحقن. استبدل الإبرة بعناية في نفس موضع الإبرة في قمة البطين الأيسر.
  7. استخدم مضخة التروية لحقن محلول هضم يتم التحكم في درجة حرارته بدرجة حرارة 37 درجة مئوية في البطين الأيسر لمدة 15 دقيقة باستخدام حقنة سعة 50 مل. تحكم في درجة حرارة المحلول باستخدام سترة مائية تمت معايرتها مسبقا لإخراج محلول 37 درجة مئوية في نهاية الإبرة.
  8. أخرج البطينين من الأذينين وانقلهما إلى كأس زجاجية سعة 10 مل. أضف 3 مل من محلول الهضم إلى الدورق ، وباستخدام مقص حاد ، اقطع البطينين إلى قطع كبيرة. تغطى الدورق بورق الألمنيوم وتوضع في حمام مائي مسخن مسبقا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. تخلص من المادة الطافية ، مع الحرص على تجنب إزالة أي قطع من الأنسجة. أعد تعليق قطع الأنسجة في 3 مل من محلول الهضم وسحنها لمدة 4 دقائق تقريبا أو حتى يتم الحصول على خليط متجانس.
  10. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلايا نايلون 70 ميكرومتر في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل.
  11. أعد المرشح إلى أنبوب بولي بروبيلين مستدير القاع سعة 14 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 100 دورة في الدقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من المخزن المؤقت للتوقف.
  12. أضف 54 ميكرولتر من مخزون 100 mM CaCl2 إلى الخلايا المعاد تعليقها للحصول على تركيز CaCl2 النهائي البالغ 1.8 mM. يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوة خطوة تدريجية لزيادة إنتاجية الخلايا.
  13. اترك الخلايا الحية تستقر عن طريق الجاذبية لمدة 10 دقائق قبل إزالة المادة الطافية التي تحتوي على خلايا ميتة. أعد تعليق الحبيبات في محلول التخزين (محلول التروية ب 200 ميكرومتر CaCl2). يمكن الآن استخدام هذه الخلايا للتجارب الوظيفية (مثل تصوير / انكماش الكالسيوم ، ومشبك التصحيح ، وما إلى ذلك) ، والثقافة ، وما إلى ذلك.
    ملاحظة: يمكن أيضا إعادة تعليق الخلايا في محاليل تعتمد على المختبر أو التجربة.

5. ثقافة الخلية

  1. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عن طريق عرض الحقل باستخدام زلة غطاء شبكية. وبما أن الخلايا العضلية كبيرة جدا، فإن العد باستخدام مقياس الدم ليس دقيقا دائما. يستخدم هذا للحصول على فكرة عن عدد الخلايا التي تم الحصول عليها تقريبا من العزل.
  2. تمييع الخلايا إلى ~ 25000 خلية / مل مع وسائط DMEM. أضف 1 مل من محلول الخلية إلى كل بئر.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية ، 95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2 لمدة2 ساعة.
  4. قم بشفط وسائط DMEM برفق من كل بئر وأضف 2 مل من وسائط M199.
  5. احتضان في 37 درجة مئوية ، 95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO2 لمدة تصل إلى 24 ساعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك بعض العناصر التي يجب فحصها عند تحديد نجاح العزلة. أولا، يجب أن تكون الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب بدون فقاعات غشائية، مثل الخلايا المعزولة في الشكل 1. سينتج عن العزلة النموذجية ~ 80٪ من الخلايا العضلية على شكل قضيب. إذا كانت العزلة تنتج أي شيء أقل من 50٪ من الخلايا على شكل قضيب ، فإنها تعتبر عزلة غير ناجحة ولا يتم استخدام خلايا عضلة القلب. أخيرا ، يجب أن تكون الخلايا العضلية القلبية هادئة. تظهر الخلايا العضلية الانكماشية تلقائيا عدم تحمل Ca2 + وستنتج بيانات غير موثوقة. من بين جمي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميزة الرئيسية لتقنية عزل خلايا عضلة القلب الخالية من Langendorff هي أنها تحد من نقص الأكسجة ووقت نقص تروية الدم من خلال عدم الحاجة إلى قنية لجهاز Langendorff. بدلا من تقنيات Langendorff الكلاسيكية التي تستغرق عدة دقائق لإزالة القلب وتنظيفه وتعليقه ، مما يؤدي غالبا إلى تلف نقص تروية الخلية العضلية ، تتضمن طريقتنا تطهير الدم في الجسم الحي عبر محلول إزالة الجليد البارد. يحتوي المخزن المؤقت لإزالة الجليد البارد على حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، ويخلب الكاتيونات ثنائية التكافؤ بشكل لا رجعة فيه لإزا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لمنح الصحة R01 HL114940 (Biesiadecki) و R01 AG060542 (Ziolo) و T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 سم مكعب Bd Luer-Lok حقنةفيشر Sci14-827-52
10 مل Pyrex Low-Form BeakerCole-PalmerUX-34502-01
100 مل زجاجة تخزين وسائط زجاجية بغطاء من مادة البولي بروبيلينDWK Life SciencesUX-34523-00
14 مل أنابيب اختبار البولي بروبلين المستديرة القاع مع غطاءفيشر Sci14-959-11B
2،3-Butanedione MonoximeسيجماB0753>98٪
3 سم مكعب BD Luer-Lok حقنةفيشر العلوم14-823-435
35 مم أطباق قاع زجاجيMatTek CorporationP35G-1.0-20-C
50 مل حقنة BD بدون إبرةفيشر العلوم13-689-8
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةكول بالمرEW-22999-84
95٪ O2< / sub> 5٪ ثاني أكسيد الكربون2< / sub>
AIMS وسادة تسخين جل الفضاءفيشر العلوم14-370-223
BD PrecisionGlide 27 جم × 1/2 "إبر تحت الجلدبيكتون ديكنسون305109
مصل الأبقار الألبومينSigmaA3803جزء الصدمة الحرارية ، مسحوق مجفف بالتجميد ، خالي من الأحماض الدهنية بشكل أساسي ، >98٪
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتسيجماC7902>99٪
D- (+) -GlucoseSigmaG7021مناسب لزراعة الخلايا ، >99.5٪
DMEMFisher Sci11965092
EDTAFisher SciAAA1071336
Falcon 100 مم طبق ثقافة الخلايا المعالجTC Corning353003
FBSR & D Systems (Bio-techne)S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion CirculatorsFisher Sci13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic EngacpsWorld Precision Instruments15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting ChamberSet Fisher Sci02-671-11
HEPESSigmaH4034>99.5٪
شريط وضع العلاماتفيشر العلوم15-901-10R
Legato 100 مضخة حقنةkdScientific788100
L-glutathioneFisher SciICN19467980
Liberase TH Research GradeSigma5401135001تركيز حراري عالي
M199فيشر العلومMT10060CV
كلوريدالمغنيسيومInvitrogenAM9530G
ماوس LamininCorning354232
القلم / البكتيريا العقديةفيشر Sci
كلوريد البوتاسيومSigmaP5405>99٪
الدقة الرقمية الترددية حمام الماءThermoFisher ScientificTSCIR19
بيكربونات الصوديومSigmaS5761مناسبة للخلية ثقافة
كلوريد الصوديومSigmaS5886>99٪
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigmaS5011>99٪
مصفاة خلية معقمة 70 & ميكرو ؛ مفيشر العلوم22-363-548
مقص الطالبأدوات العلوم الدقيقة91460-11
VWR الوسادات السفلية الماصةفيشرالعلوم NC9481815

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
  2. Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
  3. Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005(2012).
  4. Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
  5. Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
  6. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  7. Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
  8. Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
  9. Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).
  10. Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  11. Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
  12. Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
  13. Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
  14. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
  15. Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
  16. Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
  20. Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).
  21. Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).
  22. Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).
  23. Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126(1994).
  24. Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
  25. Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
  26. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Cardiomyocyte IsolationCardiomyocyte IsolationLangendorff Free MethodPerfusion BufferDigestion BufferFunctional ExperimentsCalcium ChlorideCell StrainerShaking Water BathCardiac Biology

Related Articles