تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لتوصيف الحويصلات خارج الخلية. تسلط هذه الورقة الضوء على المعلمات والضوابط التجريبية NTA بالإضافة إلى طريقة موحدة لتحليل وتوصيف العينات والمخففات اللازمة لاستكمال المبادئ التوجيهية المقترحة من قبل MISEV2018 و EV-TRACK للتكرار بين المختبرات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحسين قابلية التكرار لتلبية الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية إرشادات 2018 في تحليل تتبع الجسيمات النانوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أحد طرق التوصيف العديدة المستخدمة في أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV) منذ عام 2006. يعتبر الكثيرون أن أدوات NTA وحزم برامجها يمكن استخدامها بسهولة بعد الحد الأدنى من التدريب وأن معايرة الحجم ممكنة داخليا. نظرا لأن كل من اقتناء NTA وتحليل البرامج يشكلان توصيفا للمركبات الكهربائية ، فقد تم تناولهما في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV2018). بالإضافة إلى ذلك ، تم رصدها من خلال الإبلاغ الشفاف ومركزية المعرفة في أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV-TRACK) لتحسين متانة تجارب EV (على سبيل المثال ، تقليل التباين التجريبي بسبب العوامل غير المنضبطة).
على الرغم من الجهود المبذولة لتشجيع الإبلاغ عن الأساليب والضوابط ، فإن العديد من الأوراق البحثية المنشورة تفشل في الإبلاغ عن الإعدادات الحرجة اللازمة لإعادة إنتاج ملاحظات NTA الأصلية. ويشير عدد قليل من الأوراق البحثية إلى توصيف NTA للضوابط أو المخففات السلبية، على افتراض واضح أن المنتجات المتاحة تجاريا، مثل المياه المالحة العازلة بالفوسفات أو المياه المقطرة فائقة النقاء، خالية من الجسيمات. وبالمثل ، نادرا ما يتم الإبلاغ عن الضوابط الإيجابية أو معايير الحجم من قبل الباحثين للتحقق من حجم الجسيمات. تتضمن معادلة ستوكس-أينشتاين متغيرات لزوجة العينة ودرجة الحرارة لتحديد إزاحة الجسيمات. وبالتالي ، فإن الإبلاغ عن درجة حرارة غرفة الليزر المستقرة أثناء جمع عينة الفيديو بالكامل هو إجراء تحكم أساسي للتكرار الدقيق. كما لا يتم الإبلاغ عن ترشيح العينات أو المخففات بشكل روتيني ، وإذا كان الأمر كذلك ، فنادرا ما يتم تضمين تفاصيل المرشح (الشركة المصنعة ، ومواد الغشاء ، وحجم المسام) وظروف التخزين. يجب أن تتضمن معايير الحد الأدنى من المعايير التي وضعتها الجمعية الدولية للحويصلة خارج الخلية (ISEV) للتفاصيل التجريبية المقبولة بروتوكول NTA موثق جيدا لتوصيف المركبات الكهربائية. توفر التجربة التالية دليلا على أن بروتوكول تحليل NTA يحتاج إلى إنشاء بروتوكول تحليل من قبل الباحث الفردي وتضمينه في طرق المنشورات التي تستخدم توصيف NTA كأحد الخيارات لتلبية متطلبات MISEV2018 لتوصيف الحويصلة الواحدة.
المقدمة
يمثل التحليل الدقيق والقابل للتكرار للمركبات الكهربائية وغيرها من الجسيمات ذات مقياس النانومتر العديد من التحديات عبر البحث والصناعة. كان تكرار أبحاث EV صعبا ، جزئيا ، بسبب عدم وجود توحيد في الإبلاغ عن المعلمات الضرورية المرتبطة بجمع البيانات. لمعالجة أوجه القصور هذه ، اقترحت ISEV إرشادات الصناعة كمجموعة دنيا من المعايير الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والوظيفية للباحثين في مجال EV ونشرتها كبيان موقف ، يشار إليه عادة باسم MISEV20141. تطلبت الوتيرة المتسارعة لأبحاث السيارات الكهربائية مبدأ توجيهيا محدثا ، ووسع "MISEV2018: بيان موقف ISEV" إرشادات MISEV20142. تضمنت ورقة MISEV2018 جداول وخطوطا عريضة للبروتوكولات المقت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. المبادئ التوجيهية العامة للبروتوكول
- حافظ على المجهر على طاولة هوائية أو على الأقل على طاولة خالية من الاهتزاز. تأكد من الحفاظ على الاهتزازات الدخيلة (على سبيل المثال ، النقر على القدم على الأرض ، ولمس الطاولة ، وإغلاق الأبواب ، وحركة المرور في المختبر) إلى الحد الأدنى.
- اضبط درجة حرارة وحدة الليزر وحافظ عليها عند درجة حرارة ثابتة لجميع تسجيلات الفيديو.
ملاحظة: كانت درجة الحرارة المختارة 25 درجة مئوية لأن محلل حجم الجسيمات النانوية تمت معايرته عند درجة الحرارة تلك. لذلك ، من المهم أن يعرف جميع مستخدمي الأداة درجة الحرارة المعايرة ويستخدمونها. درجة حرارة الغرفة ليست إعدادا مقبولا لأنها يمكن أن تختلف. - تأكد من أن جميع ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يحتوي الجدول 1 على نتائج مقاطع فيديو NTA لعينات الجسيمات الشحمية (18 تمت تصفيتها و 18 غير مصفاة) ومخفف DPBS تمثيلي. تم الانتهاء من المقارنات عبر المجموعتين بغض النظر عن مستوى الكاميرا أو عتبة الكشف في هذه الورقة. وكان متوسط قطر الجسيمات في العينات المصفاة 108.5 نانومتر، ووضع الجسيمات 86.2 نانومتر، وتركيز 7.4 × 108 جسيمات/مل. وعلى النقيض من ذلك، بلغ متوسط قطر الجسيمات غير المصفاة 159.1 نانومتر، ووضع الجسيمات 105.7 نانومتر، وتركيز 7.6 × 108 جسيمات/مل. كانت قيم المتوسط والوضع للعينات ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك عدة طرق متاحة لتقدير حجم وتركيز الجسيمات النانوية11. وتشمل هذه الطرق الجماعية التي تولد تقديرا للحجم من السكان ، بما في ذلك تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، والترسيب بالطرد المركزي ، وتحليل مستوى الجسيمات الواحدة - المجهر الإلكتروني ، NTA ، مجهر القوة الذرية ، واستشعار النبض المقاوم القابل للضبط. من بين هذه ، يتم استخدام DLS و NTA على نطاق واسع ، وطرق قياس الحجم والتركيز غير المدمرة ، استنادا إلى الحركة البراونية في وسط مثالي. تعتمد DLS على تشتت الضوء وتتناسب شدتها مع مربع حجم الجسيمات. وبالتالي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم العمل من قبل ولاية كانساس إلى معهد الغرب الأوسط لبيولوجيا الخلايا الجذعية المقارنة (MICSCB) ، ومركز جونسون لأبحاث السرطان إلى MLW و NIH R21AG066488 إلى LKC. تلقى مكتب خدمات الرقابة الداخلية دعما من GRA من MICSCB. يشكر المؤلفون الدكتور سانتوش أريال على توفير الجسيمات الشحمية المستخدمة في هذا المشروع وأعضاء مختبرات فايس وكريستنسون لإجراء محادثات وتعليقات مفيدة. الدكتور هونغ هو ممتن للدعم الفني. تشكر MLW بيتي غورين فايس على دعمها ومشورتها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الماصة | |||
| الأوتوماتيكية ، مخروطية الشكل ، Nunc 15 مل | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser | Module Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| ماصة المناشف | |||
| الورقية ، 1-200 & micro ؛ L ، مفلتر ، معقم ، منخفض الارتباط | BioExpress | P -3243-200X | |
| أطراف ماصة ، 50-1,000 & micro ؛ L ، مفلتر ، معقم | BioExpress | P-3243-1250 | |
| ملحي ، فوسفات Dulbecco مخزن (بدون Ca أو Mg) | معايير Gibco | 14190-144 | |
| ، نقل اللاتكس - 100 نانومتر (3 مل) معايير | NTA4088 | Malvern | |
| ، نقل اللاتكس - 50 نانومتر & nbsp ؛ (3 مل) | NTA4087 | مالفيرن | |
| ، 33 مم ، .22 وميكرو ؛ م ، MCE ، ماركة | Sterile Fisher | 09-720-004 | |
| حقنة ، TB ، 1 مل ، طرف انزلاق | Becton Dickinson | 309659 | |
| حاوية |
المراجع
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
