هنا ، نصف طريقة مراقبة غير جراحية تتضمن تعبير لوسيفيراز وبروتين الفلورسنت الأخضر في خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة. يوفر هذا البروتوكول تقنية لمراقبة تكوين الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي في الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة نمو سرطان الثدي وتكوين مستعمرة النقيلي في الفئران باستخدام التلألؤ الحيوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
سرطان الثدي هو ورم خبيث غير متجانس متكرر والسبب الرئيسي الثاني للوفيات لدى النساء ، ويرجع ذلك أساسا إلى ورم خبيث في الأعضاء البعيدة. تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية ، بما في ذلك نماذج الفئران العظمية المستخدمة على نطاق واسع ، حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في وسادة الدهون الثديية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه النماذج المساعدة في مراقبة حركية نمو الورم والاستعمار النقيلي. الأدوات المتطورة لمراقبة الخلايا السرطانية في الوقت الحقيقي في الفئران ستعزز بشكل كبير فهم بيولوجيا الورم.
هنا ، تم إنشاء خطوط خلايا سرطان الثدي التي تعبر بثبات عن luciferase وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). على وجه التحديد ، تحتوي هذه التقنية على خطوتين متتابعتين بدأتا بقياس نشاط luciferase في المختبر وتليها زرع الخلايا السرطانية في منصات الدهون الثديية للفئران غير البدينة. بعد الحقن ، تتم مراقبة كل من نمو الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي بواسطة نظام التصوير غير الباضع. بعد ذلك ، سيتم فحص القياس الكمي للنقائل المعبرة عن GFP في الرئتين بواسطة المجهر الفلوري للتحقق من صحة نتائج التلألؤ الحيوي المرصودة. يقوم هذا النظام المتطور الذي يجمع بين أدوات الكشف القائمة على اللوسيفيراز والتألق بتقييم ورم خبيث للسرطان في الجسم الحي ، والذي يتمتع بإمكانات كبيرة للاستخدام في علاجات سرطان الثدي وإدارة الأمراض.
المقدمة
سرطان الثدي هي أنواع متكررة من السرطان في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقرب من 250،000 حالة جديدة يتم تشخيصها كل عام في الولايات المتحدة1. على الرغم من ارتفاع معدل الإصابة به ، إلا أن مجموعة جديدة من الأدوية المضادة للسرطان قد حسنت بشكل كبير نتائج مرضى سرطان الثدي2. ومع ذلك ، لا تزال هذه العلاجات غير كافية ، حيث يعاني العديد من المرضى من انتكاس المرض وانتشاره النقيلي إلى الأعضاء الحيوية2 ، وهو السبب الرئيسي لاعتلال المرضى ووفياتهم. لذلك ، فإن أحد التحديات الرئيسية في أبحاث سرطان الثدي هو تحديد الآليات الجزيئية التي تنظم تكوين النقائل البعيدة لتطوير وسائل جديدة لمنع تطورها.
ورم خبيث سرطاني هو عملية ديناميكية تنفصل فيها الخلايا عن الورم الأساسي وتغزو الأنسجة المجاورة من خلال الدورة الدموية. وبالتالي ، فإن النماذج الحيوانية التي تخضع فيها الخلايا لسلسلة نقيلي مماثلة يمكن أن تسهل تحديد الآليات التي تحكم هذه العملية 3,4. بالإضافة إلى ذلك ، هذه النماذج في الجسم الحي ضرورية لتطوير عوامل علاج سرطان الثدي 5,6. ومع ذلك ، لا يمكن أن تشير هذه النماذج التقويمية إلى حركية نمو الورم الفعلية حيث يتم تحديد التأثير فقط عند الإنهاء. لذلك ، أنشأنا أداة قائمة على luciferase للكشف عن تطور الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي. بالإضافة إلى ذلك، تعبر هذه الخلايا عن GFP للكشف عن المستعمرات النقيلية. هذا النهج بسيط نسبيا ولا ينطوي على أي إجراءات غازية3. وبالتالي ، فإن الجمع بين اكتشاف لوسيفيراز والتألق هو استراتيجية مفيدة للمضي قدما في الدراسات قبل السريرية لعلاجات سرطان الثدي وإدارة الأمراض.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع تجارب الفئران بموجب البروتوكول المعتمد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في الجامعة العبرية MD-21-16429-5. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجامعة العبرية معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد رعاية المختبرات (AAALAC).
1. صيانة خط الخلية
ملاحظة: تم استخدام خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية (MCF-7 و MDA-MB-468 و MDA-MB-231) في هذا البروتوكول.
- استزرع جميع خطوط خلايا سرطان الثدي في وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) ، مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة (5٪ CO2).
ملاحظة: تحقق من كثافة الخلايا بانتظام. تقسيم وتوسيع للاستخدام في المستقبل عندما تصل إلى 70٪ التقاء.
2. تحضير الفيروسات
- عالج خلايا HEK293T ب 1 مل من التربسين حتى تنفصل.
- أضف 10 مل من DMEM (10٪ FBS) لتحييد نشاط التربسين ، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد 15 مل.
- جهاز طرد مركزي في 150 × غرام لمدة 5 دقائق لترسيب الخلايا. تخلص من المادة الفائقة بعد الطرد المركزي وأضف 1 مل من وسط DMEM الطازج.
- تحديد تركيز الخلية والبذور 1.2 × 106 خلايا / بئر في لوحة من ستة آبار.
- في اليوم التالي ، قم بتسخين جميع الكواشف اللازمة مسبقا ، بما في ذلك كاشف النقل ، DMEM الخالي من المصل ، بلازميد المغلف (VSV-G) ، بلازميد تغليف lentivirus (ΔVPR) ، و pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid أو بلازميد FUW GFP.
- في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل ، امزج 50 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل مع 0.3 ميكروغرام من بلازميد VSV-G ، و 1 ميكروغرام من ΔVPR ، و 1.2 ميكروغرام من بلازميد انفجار pLX304 Luciferase-V5 أو بلازميد FUW GFP.
- بعد خلط هذه البلازميدات جيدا مع الوسط ، أضف 5 ميكرولتر من كاشف النقل ، واخلطه بلطف ، واحتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- بعد الحضانة ، أضف الخليط قطرة إلى خلايا HEK293T.
- بعد 24 ساعة، استبدل وسط النمو ب 2 مل من (30٪ FBS) DMEM. في اليوم التالي (48 ساعة بعد النقل) ، قم بحصاد الوسط الذي يحتوي على الفيروسات ("pLX304 Luciferase-V5 أو فيروسات FUW GFP").
ملاحظة: استخدام 30٪ FBS يعزز كفاءة إنتاج الفيروسات. - لتجنب أي بقايا خلايا HEK293T ، قم بتمرير الوسط المحتوي على الفيروس من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر أو جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق ، وجمع supernatant.
ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل ، حافظ على أليكوتس العمل للفيروس عند -80 درجة مئوية.
3. إنشاء خلايا تعبر بثبات عن GFP و luciferase ("GFP + Luc + cells")
- في اليوم السابق لإصابة الخلايا ، البذور 8 × 105 خلايا لكل بئر في لوحة من ستة آبار.
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها، استبدل وسط النمو بوسط طازج يحتوي على 8 ميكروغرام/مل من البوليبرين. أضف 200 ميكرولتر من فيروسات FUW GFP إلى الخلايا.
- اختياري: لتعزيز كفاءة الفيروس، قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 560 × جم لمدة 30 دقيقة (37 درجة مئوية) (عدوى الدوران).
- احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة ، والتحقق من تعبير GFP بواسطة المجهر الفلوري.
- فرز الخلايا المعبرة عن GFP حسب فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) (GFP+) (الشكل 1A).
- إصابة الخلايا التي تم فرزها بواسطة GFP بفيروسات الانفجار pLX304 Luciferase-V5 كما هو موضح في الخطوة 3.2.
- عالج الخلايا بالبلاستيسيدين (10 ميكروغرام / مل) بعد 30 ساعة من الإصابة لإثراء الخلايا المعبرة عن الانفجار pLX304 Luciferase-V5 (GFP + ، خلايا Luc +). ثم ، كل يومين ، استبدله بوسط طازج يحتوي على البلاستسيدين. بالإضافة إلى ذلك ، كعنصر تحكم ، عالج الخلايا الساذجة بنفس الوسط المحتوي على البلاستيسيدين.
ملاحظة: يجب ملاحظة وجود فرق واضح بين الخلايا المصابة والخلايا الضابطة بعد بضعة أيام من علاج البلاستسيدين. يعتمد هذا التأثير على خط الخلية وعادة ما يستغرق حوالي 8-10 أيام. سيشير معدل البقاء على قيد الحياة الضعيف إلى انخفاض إنتاجية الفيروس. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بإنتاج مجموعة جديدة من الفيروسات لأن الكفاءة المنخفضة قد تؤثر على التجارب المستقبلية.
4. التحقق من صحة نشاط لوسيفيراز في المختبر
- قم بزراعة خلايا MCF-7 و MDA-MB-468 و MDA-MB-231 GFP+ Luc+ في صفيحة 15 سم إلى 80٪ من التقاء. حصاد الخلايا عن طريق التربسينات ، كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.2.
- زرع عدد متزايد من الخلايا في كل بئر (0.1 ، 0.5 ، 1 ، 2 ، 3 ، 4 × 104) في صفيحة سوداء من 96 بئرا.
ملاحظة: تعد الألواح السوداء ذات ال 96 بئرا أكثر ملاءمة لقياس مستويات لوسيفيراز حيث ستنتج الألواح البيضاء أو الشفافة إشارات تلألؤ ذاتي. كعنصر تحكم ، استخدم المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) وحدها في بئر واحد لضمان عدم وجود تلألؤ ذاتي من PBS. - املأ جميع الآبار ب 100 ميكرولتر من DMEM واحتضنها لمدة 16-24 ساعة.
- تحضير محلول لوسيفيرين في PBS بتركيز 1.5 ملغم / مل من مخزون 30 ملغ / مل. Aliquot مخزون محلول luciferin وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بلطف ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول لوسيفيرين في كل بئر ، وانتظر لمدة 2 دقيقة. أخيرا ، قم بقياس نشاط luciferase في جميع خلايا سرطان الثدي باستخدام التلألؤ الحيوي.
ملاحظة: يعد فحص تعبير GFP و luciferase في المختبر قبل التجارب على الحيوانات أمرا بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام الآبار الفارغة لطرح الخلفية.
5. حقن الفئران بخلايا GFP + Luc +
- انقل 5 × 10 6 (MCF-7 و MDA-MB-468) أو 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP + Luc + إلى 200 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر PBS ، على التوالي.
- قبل الحقن ، قم بتنظيف الغطاء البيولوجي المعقم بمحلول مطهر بنسبة 5٪ (انظر جدول المواد). ثم ، قم بتخدير الفئران بهواء مصفى (0.2 ميكرومتر) يحتوي على 4٪ من الأيزوفلوران بمعدل تدفق هواء 1 لتر / دقيقة لمدة 2-3 دقائق.
ملاحظة: من الضروري تأكيد التخدير المناسب. قرصة إصبع قدم الماوس وابحث عن أي استجابة. - ضع مخروطا فوق رأس الفأر المخدر في وضع ضعيف. ضع مرهم بيطري على عينيه لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- امسح منطقة البطن من الماوس ، فوق الغدة الثديية ، باستخدام الإيثانول باستخدام قطعة قطن وارفع الغدة الثديية 4 بالملقط.
- أدخل الإبرة 27 جم × 3/4 (0.4 × 19 مم) تحت وسادة الدهون وحقن 100 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية.
ملاحظة: سيظهر انتفاخ دائري تحت الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي الحقن غير السليم إلى انحراف في معدل نمو الورم أو عدم وجود ورم في نفس المجموعة التجريبية. - بعد إجراء الحقن ، أخرج الفئران من الغطاء وانقلها إلى قفص جديد. راقب الفئران حتى تعود إلى الوعي.
ملاحظة: تأكد من التخلص من جميع الإبر والمحاقن المستخدمة في صندوق الأدوات الحادة.
6. قياس مستويات luciferase في GFP + Luc + الفئران
- قبل اكتشاف التلألؤ الحيوي ، قم بتقييد الماوس الواعي عن طريق تثبيت رقبته باليد اليسرى. ثم ، قم بإمالة اليد إلى اليسار ، مما يؤدي إلى وجه الماوس لأعلى مع الجزء السفلي من الجسم في وضع ضعيف.
- حقن 100 ميكرولتر من لوسيفيرين (30 ملغم / مل) داخل الصفاق (i.p) في سطح البطن للفأر في الربع البطني السفلي الأيسر باستخدام حقنة 1.0 مل مع إبرة بحجم 27 جم × 3/4 (0.4 × 19 مم).
ملاحظة: لا ينبغي إدخال طرف الإبرة أكثر من 3-5 مم من جدار البطن ، لأنه قد يخترق الأعضاء الحشوية. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بإجراء حقن i.p. بدون تخدير لأن توزيع لوسيفيرين في جسم الفئران المخدرة أبطأ من الفئران الواعية. وبالتالي ، فإن مراقبة مستويات luciferase في الفئران الواعية هو إجراء أسرع. - احتفظ بالماوس لمدة 7 دقائق بدون تخدير تليها 3 دقائق داخل غرفة التخدير قبل قياس حركية الورم.
ملاحظة: يختلف وقت الحضانة بين التجارب المختلفة وخطوط الخلايا والأنواع إلى الأنواع. وبالتالي ، يوصى بمعايرة وقت الحضانة قبل بدء التجارب. - تخدير الفئران كما هو موضح في الخطوات 5.2-5.3.
- افتح البرنامج (جدول المواد) أثناء الحضانة ، وقم بتهيئة نظام التصوير ، وانقر فوق الزر تهيئة .
ملاحظة: كن على علم بأن الكاميرا ستستغرق حوالي 10 دقائق لتبرد وتصل إلى -90 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، كتحكم في الخلفية ، قم بقياس مستويات luciferase في الفئران الساذجة (أي الفئران GFP + التي تم حقنها بخلايا لا تعبر عن جين luciferase). - حافظ على الإعداد في التعريض الضوئي التلقائي باستخدام الإعدادات التالية: وقت التعرض التلقائي ، 60 ثانية ؛ وسط الربط ، F / Stop 1 ؛ مرشح الإثارة المحظورة. مرشح الانبعاثات مفتوح. عند انتهاء التهيئة ، حدد معالج التصوير | التلألؤ الحيوي ومن ثم انقر فوق التالي | فتح | تصفية حدد الماوس في موضوع الصورة.
- في طريقة عرض الحقل، حدد المرحلة C (10 سم) وارتفاع الهدف: 1.50 سم.
- انقر فوق مرحلة إعداد الصورة إلى C، وقبل النقر فوق الزر اكتساب ، تأكد من وضع الماوس على المسرح في وضع الاستلقاء المناسب.
- أغلق الباب، وانقر فوق الزر " اكتساب"، وانتظر ظهور صورة على الشاشة.
ملاحظة: مع خيار التعرض التلقائي ، تستغرق الإشارة القوية 5-20 ثانية اعتمادا على الإشارة. ستستغرق الإشارة الضعيفة حوالي 60 ثانية. - كرر هذه الخطوة للفئران الأخرى.
- للكشف عن ورم خبيث في الرئة، قم بتغطية الإشارة القوية للورم الأساسي باستخدام ورق مقوى أسود سميك وقم فقط بفضح الجانب البطني من الرئتين نحو الكاميرا. التقط الصورة باستخدام نفس المعلمات الموضحة أعلاه.
7. الحصول على صورة خارج الجسم الحي باستخدام التلألؤ الحيوي والتألق
- القتل الرحيم للفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO2) في المجفف وتشريح الفئران باستخدام مقص وملقط معقم.
- قم بدمج الفئران باستخدام 0.9٪ من المياه المالحة ، وحصاد الأعضاء ، وشطفها باستخدام 1x PBS للقضاء على بقع الدم من العضو.
- انقل العضو المشطف إلى طبق بتري وضعه في مرحلة آلة التلألؤ الحيوي. تطبيق نفس إعداد التلألؤ الحيوي كما هو موضح في الخطوات 6.2-6.6.
ملاحظة: نظرا لانخفاض إشارة luciferase ، فإن هذه الخطوة محددة زمنيا. وهكذا ، بعد القتل الرحيم للفئران ، تصور العضو على الفور عن طريق التلألؤ الحيوي. - بالنسبة لصور GFP، قم بتطبيق نفس الإعداد كما هو موضح في الخطوة 6.3، باستخدام مرشح GFP الفلوري بدلا من التلألؤ الحيوي.
- التقط صورا للرئة باستخدام مجهر ستيريو لفحص وجود مستعمرات GFP +.
8. تحليل بيانات التلألؤ الحيوي
- انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج وحدد فتح من القائمة ملف .
- افتح جميع الملفات وقم بتصغيرها. تأكد من أن جميع الوحدات هي Radiance (الفوتونات). بالإضافة إلى ذلك، انقر فوق تطبيق على الكل للحفاظ على نفس المعلمات لكافة الصور.
- من القائمة عرض ، حدد لوحة الأدوات، التي ستفتح نافذة جديدة.
- من نافذة لوحة الأدوات، حدد علامة التبويب أدوات عائد الاستثمار وفي النوع، اختر متوسط عائد الاستثمار على Bkg.
- من أدوات عائد الاستثمار، حدد دائرة، وارسم دائرة صغيرة على المنطقة الصدرية للماوس.
- انقر نقرا مزدوجا فوق الدائرة، وحدد الخيار استخدام ك BKG لعائد الاستثمار المستقبلي من علامة التبويب عائد الاستثمار في الخلفية ، وانقر فوق تم.
9. قياس التدفق الكلي
- من نافذة لوحة الأدوات ، حدد علامة التبويب أدوات عائد الاستثمار وفي النوع، اختر قياس عائد الاستثمار.
- من أدوات عائد الاستثمار، حدد دائرة، وارسم دائرة كبيرة على الورم الأساسي للماوس.
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق نسخ عائد الاستثمار وانقر بزر الماوس الأيمن فوق لصق عائد الاستثمار في كل ملف فردي لكل ماوس.
- انقر فوق قياس عائد الاستثمار من علامة التبويب أدوات عائد الاستثمار، والتي ستفتح نافذة جديدة تسمى قياسات عائد الاستثمار. من علامة التبويب هذه، احتفظ بأنواع القياسات كإشعاع (فوتونات) وسمات الصورة ككل القيم المملوءة.
- قم بتصدير الملف بتنسيق ملف القياسات (*.txt) أو Csv (*.csv).
- افتح البيانات المصدرة في جدول بيانات وخذ إجمالي التدفق (p/s) والقيم للأسابيع.
ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخطوة لقياس مجموعات مختلفة. على سبيل المثال ، عولجت الفئران بسيارة مقابل تلك التي عولجت بعقار. - قم بإنشاء مخطط XY ، حيث يتم تقديم الوقت على طول المحور X والتدفق الكلي (p / s) على طول المحور Y. لكل أسبوع ، خذ معلمة التدفق الكلي (p / s) لكل مجموعة عينة وحدد أي اختلافات كبيرة باستخدام اختبار t للطالب غير المعلمي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقد أنشأنا خطوط خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-231 و MCF-7 و MDA-MB-468) التي تعبر عن ناقلات GFP و luciferase. على وجه التحديد ، تم تحقيق ذلك عن طريق عدوى متتابعة. أولا ، أصيبت خطوط خلايا سرطان الثدي بناقل فيروس lentivirus يعبر عن GFP الفلورسنت. تم فرز الخلايا الإيجابية GFP (GFP +) بعد يومين من الإصابة (الشكل 1A ، B) وأصيبت بناقل pLX304 Luciferase-V5. بعد ذلك ، تم استخدام blasticidin لاختيار luciferase لتوليد الخلايا المشار إليها (GFP + ، Luc +). ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التجارب القائمة على الحيوانات إلزامية لأبحاث السرطان7،8،9 ، وبالفعل تم تطوير العديد من البروتوكولات3،6،10،11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات حددت التأثير البيولوجي فقط في نهاية التجارب ، و...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد كشف جميع المؤلفين أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر Y.D.S. نود أن نشكر معهد وول للطب الانتقالي في مركز هداسا الطبي في القدس على توفير مرفق تصوير الحيوانات الصغيرة. تم دعم هذه الدراسة من قبل جائزة التطوير الوظيفي البحثي من صندوق أبحاث السرطان الإسرائيلي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.7 مل أنابيب eppendorf Lifegene | LMCT1.7B-500 | ||
| 10 & micro ؛ نصائح L | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 & micro; نصائح L | Lifegene | LRT1000 | |
| أنابيب 15 مل Lifegene | LTB15-500 | ||
| 200 & micro ؛ نصائح | L Lifegene | LRT200 | |
| 6 لوحة ثقافة خلايا | جيدة COSTAR | 3516 | |
| 96 ألواح بئر أسود مسطحة | بار Naor | BN30496 | |
| عدادات الخلايا الآلية | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III فارز | BD | ||
| BD Microlance 3 إبر 27 جم (3/4 بوصة) | BD | 302200 | |
| محاقن BD Plastipak 1 مل × 120 | دينار بحريني | 303172 | |
| كورنينج 100 مم × 20 مم طبق أنيق | كورنينج | 430167 | |
| كورنينج 150 مم × 20 مم طبق أنيق | كورنينج | 430599 | |
| شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسة | Thermofisher | C10228 | |
| وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، نسبة عالية من الجلوكوز ، بدون جلوتامين | الصناعات البيولوجية | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i مجهر | نيكون | ||
| eppendorf الطرد المركزي 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | الصناعات البيولوجية | 04-127-1A | |
| FUW GFP | موهوب من مختبر الدكتور يوسي بوغانيم (الجامعة العبرية في القدس) | ||
| HEK293T | موهوب من مختبر الدكتور ليئور نسيم (الجامعة العبرية في القدس) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine | Solution Biological Industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence القياس | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| ماصات باستور | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655 / 500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | # 8455 | مقدمة من ديفيد م. ساباتيني s lab (معهد وايتهيد ، بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | # 8454 | مقدمة من David M. Sabatini ' مختبر s (معهد وايتهيد ، بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية) |
| البنسلين والستربتومايسين | للصناعات البيولوجية | 03-031-1B | |
| طبق بتري 90 مم (90 × 15) | بلاست | 820-090-01-017 | |
| ماصات 10 مل | ماصات لايف جين | إل جي GSP010010S | |
| 25 مل | ماصات لايف جين | إل جي-GSP010050S | |
| 5 مل | لايف جين | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 انفجار البلازميد | Addgene | # 98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | # 107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| كاشف الخزانات | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 مجاهر ستيريو نيكون | |||
| كلوريد الصوديوم | Bio-Lab | مرشحات حقنة 190359400 | |
| Lifegene | LG-FPV403030S | ||
| Trypan Blue 0.5٪ | محلول الصناعات البيولوجية | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25٪) EDTA (0.05٪) | الصناعات البيولوجية | 03-052-1a | |
| مرشحات مدفوعة بالفراغ | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | مطهر | ||
| VivoGlo Luciferin ، في الجسم الحي الصف | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA TRANSFECTION | REAGENT Sigma Aldrich | # 6366236001 |
المراجع
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175(2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212(2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967(2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040(2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077(2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173(2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316(2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
