مقالة منهجية

استخدام كريستال البنفسجي لتحسين البصرية Cytopathic تأثير القائم على القراءة ل Titration الفيروسية باستخدام TCID50 المقايسات

DOI:

10.3791/63063

⸱

فبراير 12, 2022

 , 
1College of Veterinary Medicine, Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هذا البروتوكول نهجا دقيقا وموضوعيا لتصور المعايرة الفيروسية باستخدام اللون البنفسجي البلوري ، من خلال مقارنتها بالفحص المجهري البصري والتلوين الكيميائي المناعي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعايرة الفيروسية هي المقايسة الرئيسية لأبحاث الفيروسات. الكشف عن تأثير الخلايا (CPE) عن طريق المقايسات TCID50 ووحدات تشكيل البلاك (PFU) المقايسات هي الطريقتين الرئيسيتين لحساب titer من مخزون الفيروس وغالبا ما تستند إلى الكشف المجهري أو تلطيخ الخلايا للتصور. في حالة اختبار TCID50 ، يستند التصور الموضوعي عادة إلى تلطيخ المناعة الكيميائية (ICC) للفيروس داخل الخلايا لحساب الثديات جنبا إلى جنب مع الكشف البصري عن CPE عن طريق المجهر. ومع ذلك ، فإن تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية مكلف ويستغرق وقتا طويلا. في هذه الدراسة، قارنا المراقبة البصرية CPE عن طريق المجهر، تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية وتلطيخ الكريستال البنفسجي لتحديد الثدي من اثنين من الفيروسات تشكيل CPE، فيروس الأنفلونزا A (IAV) من أصل الخنازير وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV). نظهر أن كل من الكريستال البنفسجي وتلطيخ ICC هي أكثر دقة من الكشف عن CPE البصرية، وتقديم مستويات متطابقة تقريبا من الدقة على كل من IAV وPRRSV. لهذا السبب، نقدم هنا تلطيخ الكريستال البنفسجي كوسيلة أسرع وأكثر بأسعار معقولة لتحديد المعايرة الفيروسية على المقايسة TCID50 للفيروسات تشكيل CPE titrated في خطوط الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعايرة الفيروسية عن طريق TCID50 المقايسة هي تقنية شائعة الاستخدام في أبحاث الأمراض المعدية1. على الرغم من أن الاختلافات في الرياضيات وراء هذه الطريقة قد اقترحت على مدى الوقت1,2,3,4, تعتمد الطرق المطبقة حاليا للكشف عن العدوى على تأكيد بصري من خلال وجود تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) باستخدام المجهر5. لتأكيد التصور CPE أكثر موضوعية على المقايسات TCID50، immunocytochemical (ICC) تلطيخ داخل الخلايا التي تستهدف بروتينات الفيروس هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما6 كما ي....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بروتوكول المعايرة

ملاحظة: استخدام فيروس cytopathic تصيب الخلايا الملتصقة. لهذه المظاهرة، فيروس الأنفلونزا A (IAV) من أصل الخنازير (A/California/07/2009/(H1N1)) وفيروس متلازمة بورسين التناسلية والتنفسية (PRRSV) نوع 2، سلالة NC 1-7-4 استخدمت.

  1. يسوي هذه الفيروسات في 96 لوحة بئر لمدة 7 أيام في خزانة السلامة الحيوية الموجودة في مختبر السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2).
    1. لتنفيذ هذه المعايرة، البذور 96 لوحات البئر مع خط الخلية المطلوبة. بالنسبة ل PRRSV، استخدم خط الخلية MA-104 ول IAV استخدم خط الخلية MDCK. لثقافة الخلية، استخدم DMEM المتوسطة تكملها مع 10٪ FBS، L-الجلوتامين وبينيسيلين-ستريبتوميسين وتنمو الخلايا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعادلات المستخدمة لحساب رياضيا titer وصفت سابقا2،3.

باختصار، بالنسبة ل PRRSV، نطبق طريقة Karber:

تيتر (TCID50) = 10 T + 1.3 حيث:

معادلة ديناميكيات الدوران ، T = d + (r / N) × (n + N / 2) ، تحليل الصيغة.

في هذه الصيغة د = سجل سلبي .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم المعايرة الفيروسية بشكل روتيني في أبحاث الفيروسات، مع الكشف عن PFU وتقيايس TCID50 الأكثر استخداما1،2،3،4. تعتمد كلتا الطريقتين على اكتشاف CPE في الخلايا المصابة ، وعلى الرغم من أنه يمكن تقييمها بصريا عن طريق المجهر ، عادة ما يتم تطبيق تلطيخ للحصول على نتيجة أكثر موضوعية أو حتى لتقليل أوقات الحضانة. في حالة TCID50 ، واحدة من البدائل الأكثر استخداما للكشف عن CPE البصرية التي توفر.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور فرانك شولي لتعليقاته المفيدة في المخطوطة، وكلوي ماريانت لمساعدتها في تصوير المجهر وتيريزا م. تيدج لتنقيحها المفيد للغة الإنجليزية.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 بئر لوحات ثقافة الخلاياGenesee25-221واضح ومسطح القاع
Thermo Fisher1122
Crystal violetThermo FisherC581-25 ؛ C581-100
DMEMCorning10-017-CV
مصل الأبقار الجنينيBioWestS1480
ParaformaldehideThermo FisherJ19943
الأجسام المضادة للأنفلونزاالأولية BiossBS-0344R
الأجسام المضادة الأولية PRRSVBiossBS-10043R
SaponinThermo ScientificAAA1882014
الأجسام المضادة SecondatyInvitrogen31460
تريس هيدروكلوريدالحرارية العلميةAM9856
محلول AEC

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
  2. Ramakrishnan, M. A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Crystal Violet StainingTCID50 AssayCell StainingVirus StockPlaque AssayImmunocytochemical StainingInfluenza A VirusPRRSV

مقالات ذات صلة