التصوير الحي لحالة الميتوكوندريا الجلوتاثيون ريدوكسي في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر قياس النسب

العديد من الإنزيمات الميتوكوندريا الهامة وجزيئات الإشارات تخضع لتنظيم أكسدة ^{الثيول1}. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا هي مصدر خلوي رئيسي لأنواع الأكسجين التفاعلية وعرضة بشكل انتقائي للتلف ^{التأكسدي2}. وبناء على ذلك، فإن إمكانات أكسدة الميتوكوندريا تؤثر بشكل مباشر على الجيوجيات الحيوية، وإشارات الخلايا، ووظيفة الميتوكوندريا، وفي نهاية المطاف صلاحية ^{الخلية3،4}. مصفوفة الميتوكوندريا يحتوي على كميات عالية (1-15 mM) من الغلوتاثيون العازلة أكسدة الثيول-ديسوليد (GSH) للحفاظ على التوازن الأكسدة وجبل الدفاعات المضادة ^{للأكسدة5,6}. يمكن ربط GSH بشكل مشترك بالبروتينات المستهدفة (S-glutathionylation) للتحكم في حالة الأكسدة ونشاطها ويستخدم من قبل مجموعة من الإنزيمات مزيلة للسموم التي تقلل من البروتينات المؤأكسدة. ولذلك، فإن إمكانات أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا هي معلمة غنية بالمعلومات للغاية عند دراسة وظيفة الميتوكوندريا والفيزيولوجيا المرضية.

roGFP2 هو البديل من GFP التي جعلت من حساسية الأكسدة بإضافة اثنين من السيستينات السطحية المكشوفة التي تشكل ثنائي ثنائي هذاول-ديبريتيد ^{الاصطناعية 7,8}. لديها ذروة انبعاث واحد في ~ 510 نانومتر وقممتين الإثارة في ~ 400 نانومتر و 490 نانومتر. الأهم من ذلك ، فإن السعة النسبية للقممتين الإثارة تعتمد على حالة الأكسدة من roGFP2 (الشكل 1) ، مما يجعل هذا البروتين جهاز استشعار نسبة. في مستشعر Grx1-roGFP2، تم دمج الجلوتاريدوشين-1 البشري (Grx1) في N-terminus من roGFP29,10. المرفق التكافؤي لانزيم Grx1 إلى roGFP2 يتيح اثنين من التحسينات الرئيسية للاستشعار: فهو يجعل استجابة الاستشعار محددة لزوج GSH / GSSG الجلوتاثيون أكسدة (الشكل 1)، وأنه يسرع التوازن بين GSSG وroGFP2 بعامل لا يقل عن 100،0009. لذلك ، يتيح Grx1-roGFP2 تصويرا محددا وديناميكيا لإمكانات أكسدة الجلوتاثيون الخلوية.

يمكن إجراء التصوير Grx1-roGFP2 على مجموعة واسعة من المجاهر، بما في ذلك المجاهر الفلورية واسعة النطاق، والمجاهر confocal القرص الغزل، والمجاهر confocal المسح بالليزر. يمكن تحقيق التعبير عن المستشعر في الخلايا العصبية الأولية بطرق مختلفة تشمل شفط ^{الدهون11} ، الحمض النووي / الكالسيوم فوسفات coprecipitation12 ، نقل الجينات بوساطة الفيروس ، أو استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا كمصدر للخلية (الشكل 2). الزائفة المؤتلفة الفيروسات المرتبطة أدينو (rAAV) التي تحتوي على نسبة 1:1 من AAV1 وAAV2 capsid البروتينات ^13,14 استخدمت للتجارب في هذه المقالة. مع هذا المتجه ، عادة ما يتم الوصول إلى أقصى تعبير استشعار بعد 4-5 أيام من العدوى ويبقى مستقرا لمدة أسبوعين على الأقل. لقد استخدمنا بنجاح Grx1-roGFP2 في الخلايا العصبية فرس النهر والقشرية الأولية من الفئران والجرذان.

في هذه المقالة، يتم استخدام التعبير بوساطة rAAV من الميتوكوندريا المستهدفة Grx1-roGFP2 في فرس النهر الفئران الأولية والخلايا العصبية القشرية لتقييم حالة أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا القاعدية واضطراباتها الحادة. يتم توفير بروتوكول للتصوير الحي confocal مع تعليمات مفصلة حول كيفية (1) تحسين إعدادات المجهر confocal المسح بالليزر ، (2) تشغيل تجربة التصوير الحي ، و (3) تحليل البيانات مع فيجي.

وتتوافق جميع التجارب على الحيوانات مع المبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية، بما في ذلك توجيه المجلس 2010/63/EU للبرلمان الأوروبي، وكانت لها موافقة أخلاقية كاملة من وزارة الداخلية (مكتب رعاية الحيوان بجامعة هايدلبرغ وريجيرونغسبرايسيديوم كارلسروه، رخصا T14/21 و T13/21). تم إعداد الخلايا العصبية الأولية فرس النهر والقشرية من الفئران حديثي الولادة أو الجراء الفئران وفقا للإجراءات القياسية والحفاظ عليها لمدة 12-14 يوما كما هو موضح ^سابقا13.

1. إعداد الحلول

1. حلول المخزون للتخزين المؤقت للتصوير
   1. إعداد كل حل الأسهم وفقا للجدول 1 والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل (>3 أشهر)، والحفاظ على aliquots في -20 درجة مئوية.

الجدول 1: حلول المخزون الخاصة بالتخزين المؤقت للتصوير.

2. الأسهم حلول المخدرات والأصباغ
   1. حل دياميد (DA؛ يستخدم لمعايرة نسبة 405:488 القصوى) في الماء للحصول على محلول مخزون 0.5 M (على سبيل المثال، 1 غرام في 11.615 مل من الماء). Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   2. حل dithiothreitol (DTT؛ تستخدم لمعايرة الحد الأدنى من نسبة 405:488) في الماء للحصول على محلول الأسهم 1 M (على سبيل المثال، 5 غرام في 32.425 مل من الماء). عليكوت وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 أشهر.
   3. حل N-ميثيل-D-الأسبارتات (NMDA; تستخدم للحث على السمية والميتوكوندريا) في الماء للحصول على محلول مخزون 10 mM (على سبيل المثال, 25 ملغ في 16.991 مل من الماء). تخزين الاقتباسات في -20 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل (>6 أشهر)، والحفاظ على aliquots في -80 درجة مئوية.
   4. تتراميتيل هودامين إيثيل استر بيركلورات (TMRE؛ مؤشر جزيء صغير من إمكانات غشاء الميتوكوندريا)
      1. حل مسحوق TMRE في الميثانول للحصول على مخزون 20 مليون متر (على سبيل المثال، 25 ملغ في 2.427 مل من الميثانول).
      2. تمييع مخزون 20 mM 1:1,000 في الميثانول للحصول على مخزون 20 ميكرومتر.
      3. Aliquot حلول الأسهم 20 mM و 20 ميكرومتر، ختم مع parafilm، وتخزين محمية من الضوء في -20 درجة مئوية.
         ملاحظة: كلا المخازن حلول مستقرة لعدة سنوات. استخدم حل المخزون 1000x (20 ميكرومتر) للتجارب.
3. المخزن المؤقت للتصوير
   1. إعداد 100 مل من العازلة التصوير عن طريق إضافة جميع المكونات من الجدول 2 إلى 80 مل من الماء العقيم في اسطوانة قياس. رفع مستوى الصوت يصل إلى 100 مل مع الماء العقيم. مزيج عن طريق هز بعناية اسطوانة قياس حتى يبدو الحل متجانسة.
      ملاحظة: من المستحسن استخدام مقياس التناضح للتحقق من osmolarity المخزن المؤقت. وينبغي أن تكون أقرب ما يمكن إلى متوسط النمو من الخلايا. هنا، وهذا هو 315 mOsmol / L. زيادة أو تقليل تركيز السكروز حسب الحاجة لتتناسب مع osmolarity من العازلة التصوير ومتوسط النمو.
   2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. جعل aliquots والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على aliquots في -20 درجة مئوية. دع المخزن المؤقت للتصوير يصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

الجدول 2: تكوين المخزن المؤقت للتصوير. وتستخدم وحدات التخزين المشار إليها لإعداد 100 مل من المخزن المؤقت للتصوير.

4. حلول للتحفيز والمعايرة
   ملاحظة: قم بإعداد حلول التحفيز الجديدة دائما عن طريق إضافة حلول مخزون الأدوية المشار إليها إلى المخزن المؤقت للتصوير قبل التجربة مباشرة. سيتم إضافة حلول التحفيز والمعايرة إلى غرفة التصوير بالتتابع أثناء التجربة (انظر الأقسام 3-5). اعتمادا على نوع التجربة، مطلوب حلول مختلفة للوصول إلى نفس التركيز النهائي في الحجم النهائي المعني في غرفة التصوير.
   1. إعداد محلول NMDA 3x (90 ميكرومتر؛ التركيز النهائي في الغرفة: 30 ميكرومتر) عن طريق إضافة 63 ميكرولتر من مخزون NMDA سعة 10 أمتار إلى 6.937 مل من المخزن المؤقت للتصوير. إضافة 500 ميكرولتر من الحل الناتج إلى الغرفة (الحجم النهائي: 1.5 مل).
   2. إعداد حل DA 2x للخطوات 3 و 4 (1 mM؛ التركيز النهائي في الغرفة: 0.5 mM) عن طريق إضافة 14 ميكرولتر من مخزون DA 0.5 M إلى 6.986 مل من المخزن المؤقت للتصوير. أضف 1 مل إلى الغرفة (المجلد النهائي: 2 مل).
   3. إعداد حل DA 4x للخطوة 5 (2 mM؛ التركيز النهائي في الغرفة: 0.5 mM) عن طريق إضافة 28 ميكرولتر من مخزون DA 0.5 M إلى 6.972 مل من المخزن المؤقت للتصوير. أضف 500 ميكرولتر إلى الغرفة (الحجم النهائي: 2 مل).
   4. إعداد محلول DTT 1x (5 mM؛ التركيز النهائي في الغرفة: 5 mM) عن طريق إضافة 45 ميكرولتر من مخزون DTT M 1 إلى 8955 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير. أضف 1 مل من هذا الحل إلى الغرفة بعد قرصنة المخزن المؤقت للتصوير (الحجم النهائي: 1 مل).

2. تحميل الخلايا مع TMRE

ملاحظة: في هذا البروتوكول، TMRE يستخدم في ^mode15 غير quench بتركيز نهائي من 20 nM. بشكل عام، ينبغي استخدام أقل تركيز ممكن من TMRE التي لا تزال توفر كثافة إشارة كافية على المجهر من اختيار. بسبب التبخر غير المتكافئ ، يمكن أن يختلف حجم المتوسط في الآبار المختلفة في الثقافات الأولية على المدى الطويل. لضمان تركيز TMRE ثابت في جميع الآبار، لا تقم بإضافة TMRE مباشرة إلى الآبار. بدلا من ذلك، استبدل الوسيطة في كل بئر بنفس الكمية من الوسيط المحتوي على TMRE. تم تصميم البروتوكول أدناه للخلايا العصبية الأولية في لوحات 24 بئرا تحتوي على ~ 1 مل من المتوسط لكل بئر.

1. العمل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح زراعة الأنسجة، وجمع 500 ميكروغرام من المتوسطة من كل بئر في أنبوب مخروطي واحد.
2. لكل بئر، أضف 0.5 ميكرولتر من مخزون TMRE 20 ميكرومتر في الأنبوب المخروطي (على سبيل المثال، 12 ميكرولتر ل 24 بئرا).
3. استنشق الوسط المتبقي بعناية من البئر الأول واستبدله ب 500 ميكرولتر من المتوسط المحتوي على TMRE. تابع، بشكل جيد، مع الآبار المتبقية.
   ملاحظة: الحرص على عدم السماح للخلايا تجف وعدم إزعاج الخلايا.
4. إعادة الخلايا إلى الحاضنة وانتظر ما لا يقل عن 60 دقيقة لصبغ التوازن.
   ملاحظة: يمكن تمديد وقت التحميل لعدة ساعات دون آثار ضارة.
5. لضمان تركيزات TMRE متسقة والازواية في جميع أنحاء تجربة التصوير، تأكد من تضمين تركيز نهائي من 20 NM TMRE في المخزن المؤقت للتصوير وجميع حلول التحفيز.

3. التحسين من المسح الضوئي إعدادات المجهر confocal

ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إيجاد أفضل حل وسط بين جودة الصورة وقابلية الخلية للحياة أثناء التصوير المباشر. يصف هذا القسم تحسين إعدادات التصوير roGFP. إذا تم إجراء التصوير متعدد البارامترات، يجب إجراء تحسين مماثل، بما في ذلك التحقق من وجود خط أساس مستقر دون علامات التبييض أو السمية الضوئية، للمؤشرات الإضافية.

1. بدء المجهر confocal وتحميل الإعدادات القياسية للتصوير GFP (488 نانومتر الإثارة، 505 - 550 نانومتر الانبعاثات).
2. تعيين الكاشف إلى 12 بت أو 16 بت.
   ملاحظة: عادة، 8 بتات غير كافية للتصوير الكمي.
3. تنشيط وضع المسح المتتابع وإضافة تسلسل / مسار ثاني (405 نانومتر إثارة، 505 - 550 نانومتر انبعاث).
4. لكلا القناتين، حدد جدول بحث زائف اللون يشير إلى وحدات بكسل فوق وتحت عرض (على سبيل المثال، GLOW OU).
5. حدد هدفا مناسبا للهدف محل الاهتمام.
   ملاحظة: 10x-40x مناسبة لتحليل خلية واحدة، 63x-100x هي مناسبة لتحليل ميتوشوندريون واحد.
6. قم بتركيب غطاء مع خلايا في غرفة التصوير، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير، وضع الحجرة على المجهر.
7. استخدام العدسة والضوء المنقول لتركيز الخلايا.
   ملاحظة: لا تستخدم ضوء الفلورة لتحديد موقع الخلايا وتركيزها. حتى في انخفاض الطاقة، وهذا سوف يؤثر سلبا على الخلايا.
8. تسجيل الصور بتنسيقات بكسل مختلفة. استنادا إلى هذه الصور، حدد أقل عدد بكسل يعطي دقة مقبولة لهيكل الاهتمام.
   ملاحظة: عادة، تعمل 512 × 512 بكسل بشكل جيد للتصوير أحادي الخلية مع أهداف 20x و 40x، و 1024 × 1024 أو 2048 x2048 بكسل تعمل بشكل جيد للتصوير أحادي الميتوشوندريون بهدف 63x.
9. تسجيل الصور مع أحجام الثقب مختلفة. استنادا إلى هذه الصور، حدد أكبر حجم الثقب الذي يعطي دقة مقبولة من هيكل الفائدة.
   ملاحظة: عادة، 3-7 وحدات متجدد الهواء تعمل بشكل جيد.
10. تسجيل الصور مع كثافة الليزر المختلفة.
    1. ضبط كسب الكاشف والعتبة وفقا لذلك. وبناء على هذه الصور، حدد أقل كثافة ليزرية تمنح شدة إشارة مقبولة ونسبة الإشارة إلى الخلفية.
       1. لتحديد نسبة الإشارة إلى الخلفية، قم بقياس كثافة الإشارة في منطقة الاهتمام (ROI) التي تحتوي على خلايا أو الميتوكوندريا (ROI1) وفي عائد الاستثمار بدون خلايا أو الميتوكوندريا (ROI2). ثم، تقسيم شدة ROI1 على كثافة ROI2.
          ملاحظة: تهدف إلى نسبة إشارة إلى الخلفية من >3 وكثافة إشارة من ROIs الفردية من 200-1،000 ل405 نانومتر الإثارة مع 1-3٪ قوة الليزر وكثافة من ROIs الفردية من 300-1،500 ل488 نانومتر الإثارة مع 1٪ قوة الليزر.
11. تسجيل الصور بسرعات مسح ضوئي مختلفة وعدد متوسطات الإطارات. سجل 4-5 صور لكل مجموعة من الإعدادات. استنادا إلى سلسلة الصور هذه، حدد أعلى سرعة وأقل متوسط للإعدادات التي تعطي ضوضاء صورة مقبولة وتقلب الصورة إلى الصورة.
    ملاحظة: تعمل سرعة المسح الضوئي 600 هرتز و 1-2 إطارات لمرحلة متوسطة بشكل جيد في معظم الحالات.
12. باستخدام غطاء جديد، سجل سلسلة الفاصل الزمني مع الإعدادات المحسنة.
    ملاحظة: يجب أن تشبه مدة السلسلة وفترة الصورة مدة السلسلة وفترة التجارب المخطط لها.
13. في نهاية سلسلة الفاصل الزمني، أضف 1 مل من حل DA 2x إلى غرفة التسجيل. صورة لمدة دقيقتين إضافيين.
14. يستنشق المخزن المؤقت للتصوير باستخدام مضخة عمودية أو ماصة محمولة باليد. إضافة 1 مل من حل DTT 1x. صورة لمدة 5 دقائق إضافية.
15. تحليل تجربة الفاصل الزمني (انظر القسم 5).
    1. تحقق من أن أي من القناتين يحصل على أكثر أو تحت يتعرض أثناء DA- و DTT-العلاج مع الإعدادات المحسنة.
    2. ضمان عدم تعرض أي من القناتين تبييضا كبيرا أثناء التسجيل الزمني؛ تهدف إلى فقدان <2٪ من كثافة بين الصور الأولى والأخيرة.
    3. تحقق من أن نسبة 405:488 لا تتغير بشكل كبير أثناء التصوير.
16. كرر الإجراء بأكمله بطريقة تكرارية، باستخدام عدة أغطية، حتى يتم تعريف الإعدادات التي توفر نتائج مقبولة باستمرار.

4. تقييم حالة الأكسدة القاعدية

1. بدء تشغيل المجهر وتحميل الإعدادات الأمثل من القسم 3.
2. تعيين متوسط الإطار إلى 3-5.
3. قم بتركيب غطاء مع خلايا في غرفة التصوير، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير، وضع الحجرة على المجهر.
4. استخدام العدسة والضوء المنقول لتركيز الخلايا.
   ملاحظة: لا تستخدم ضوء الفلورة لتحديد موقع الخلايا وتركيزها. حتى في انخفاض الطاقة، وهذا سوف يؤثر سلبا على الخلايا.
5. التبديل إلى وضع المسح الضوئي واستخدام قناة 488 نانومتر في عرض حي للتركيز وتحديد موقع الخلايا للتصوير.
6. استخدم الدالة متعددة النقاط لتحديد حقول العرض 3-5 على غطاء.
7. تسجيل صورة أساس.
8. إضافة 1 مل من 2x DA حل للغرفة.
9. بعد 1 و2 و3 دقائق، استخدم طريقة العرض المباشر لتأكيد/ضبط التركيز ثم تسجيل صورة.
   ملاحظة: عادة ما تتأكسد الخلايا بالكامل بعد دقيقتين.
10. استبدل المخزن المؤقت في غرفة التصوير بمحلول 1 مل من 1x DTT.
11. بعد 3 و 5 دقائق، استخدم العرض المباشر لتأكيد/ضبط التركيز ثم تسجيل صورة.
    ملاحظة: عادة ما يتم تقليل الخلايا بالكامل بعد 4-5 دقائق.

5. التصوير الحي للعلاجات الحادة

ملاحظة: يصف البروتوكول أدناه تصوير استجابة الأكسدة الميتوكوندريا لعلاج NMDA. قد تحتاج فترات الصورة ومدة التجربة إلى تعديلها للعلاجات الأخرى.

1. بدء تشغيل المجهر وتحميل الإعدادات الأمثل من القسم 3.
2. تعيين الفاصل الزمني الفاصل الزمني إلى 30 ثانية والمدة إلى 25 دقيقة.
3. قم بتركيب غطاء مع خلايا في غرفة التصوير، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للتصوير، وضع الحجرة على المجهر.
   ملاحظة: لتجنب انجراف التركيز الحراري، اترك الخلايا على مرحلة المجهر لمدة 10-15 دقيقة قبل بدء التصوير الفاصل الزمني.
4. استخدام العدسة والضوء المنقول لتركيز الخلايا.
   ملاحظة: لا تستخدم ضوء الفلورة لتحديد موقع الخلايا وتركيزها. حتى في انخفاض الطاقة، وهذا سوف يؤثر سلبا على الخلايا.
5. قم بالتبديل إلى وضع المسح الضوئي واستخدم قناة 488 نانومتر في طريقة العرض المباشر للتركيز وتحديد موقع الخلايا للتصوير.
6. اختياري: لزيادة عدد الخلايا المسجلة لكل تشغيل، استخدم الدالة متعددة النقاط لصورة 2-3 حقول العرض لكل غطاء.
7. بدء اقتناء الفاصل الزمني وتسجيل 5 صور وتسجيل خط الأساس 2 دقيقة.
8. إضافة 500 ميكرولتر من محلول NMDA 3x إلى الغرفة (التركيز النهائي 30 ميكرومتر) وتسجيل 20 صورة إضافية كاستجابة NMDA 10 دقيقة.
   ملاحظة: الخلايا العصبية حساسة جدا للتغيرات في osmolarity. لذلك، تأكد من تقليل تبخر المخزن المؤقت للتصوير. لعلاجات أطول، يجب تغطية غرفة التصوير بغطاء.
9. أضف 500 ميكرولتر من محلول DA 4x إلى الغرفة وسجل 6 صور أخرى (معايرة قصوى 3 دقائق).
10. يستنشق المخزن المؤقت من غرفة التصوير واستبداله بمحلول 1 مل من 1x DTT. سجل 10 صور أخرى (معايرة الحد الأدنى 5 دقائق).
11. إنهاء التسجيل وحفظ سلسلة الصور.

6. تحليل البيانات

1. استيراد البيانات ومعالجة الصور مسبقا في فيجي
   1. استخدم مستورد التنسيقات الحيوية لفتح مجموعة من الصور من الخطوة 4 أو ملف صورة من الخطوة 5. انقر على الإضافات | | التنسيقات الحيوية المستورد تنسيقات الحيوية. في مربع الحوار، استخدم View stack مع: Hyperstack، وضع اللون: افتراضي، حدد Autoscale، ولا تنقسم إلى إطارات منفصلة.
      ملاحظة: تحسين Autoscale عرض البيانات على شاشة الكمبيوتر. لا يغير كثافة البكسل.
   2. إذا تم فتح صور فردية من الخطوة 4، انقر على صورة | | المكدسات أدوات | قم بدمجها في مكدس صورة واحدة.
   3. إذا كان هناك XY الانجراف خلال سلسلة الصور، انقر على الإضافات | StackReg لتسجيل الصور. في مربع الحوار ، حدد النص الصلب أو الترجمة.
   4. تغيير تنسيق الصورة إلى 32 بت بالنقر على صورة | اكتب | 32 بت.
   5. تقسيم قنوات اللون إلى نوافذ منفصلة عن طريق النقر على صورة | | اللون تقسيم القنوات.
   6. حدد القناة 1 (405 نانومتر) وضبط العتبة لتحديد الميتوكوندريا للتحليل عن طريق النقر على صورة | ضبط | عتبة. في مربع الحوار، حدد الافتراضي والأحمر والخلفية الداكنة والمكدس التكراري وانتظر حتى تظهر البيكسلات المحددة باللون الأحمر. انقر فوق تطبيق. حدد تعيين وحدات بكسل الخلفية إلى NaN و معالجة كافة الصور.
      ملاحظة: لتجنب التحيز المراقب المحتملة، يجب استخدام تحديد العتبة التلقائي. تقدم FIJI عدة أساليب تلقائية (مثل الافتراضي، هوانغ، Intermodes، Otsu) التي يمكن تحديدها من القائمة المنسدلة في مربع الحوار عتبة. عادة ما يعطي الأسلوب الافتراضي نتيجة جيدة. يوصى بمقارنة عدة طرق خلال التحليل الأول للعثور على أفضل طريقة عتبة لمجموعة معينة من الصور. بمجرد اختيار طريقة ، يجب تطبيقها على جميع الصور.
   7. كرر الخطوة 6.1.6 للقناة 2 (488 نانومتر).
   8. إنشاء صورة نسبة لتصور نسبة 405:488 نانومتر عن طريق النقر على عملية | حاسبة الصورة. في مربع الحوار، حدد Image 1: القناة 1، العملية: تقسيم، الصورة 2: القناة 2، إنشاء نافذة جديدة، معالجة كافة الصور.
   9. تغيير جدول البحث عن صورة النسبة إلى اللون الزائف. على سبيل المثال، لتغيير إلى النار، انقر على صورة | | جداول البحث أطلق النار.
2. تحليل الصور
   1. على صورة النسبة، ارسم ROIs حول الخلايا الفردية أو الميتوكوندريا. بعد رسم كل عائد استثمار، أضفه إلى مدير عائد الاستثمار. تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار | إضافة. (اختصار لوحة المفاتيح: 'T') حدد إظهار الكل.
      ملاحظة: لأنه تم تعيين وحدات البكسل الخلفية إلى 'ليس رقما' (NaN) في الخطوتين 6.1.6 و 6.1.7، فإنها لن تؤثر على نتيجة القياس. لذلك، من المقبول تضمين بعض وحدات البكسل الخلفية في ROI.
   2. قياس نسب 405:488 من الخلايا الفردية عن طريق النقر على مدير عائد الاستثمار | ctrl + A لتحديد جميع ROIs | المزيد من | قياس متعدد. في مربع الحوار ، حدد قياس كافة الشرائح و صف واحد لكل شريحة.
   3. تصدير القياسات إلى برنامج جدول البيانات.
   4. حدد الصورة 405 نانومتر. قياس كثافة جميع ROIs كما هو الحال في الخطوة 6.2.2. استخدام ROIs المخزنة في إدارة عائد الاستثمار.
   5. تصدير القياسات إلى برنامج جدول البيانات.
   6. حدد الصورة 488 نانومتر. قياس كثافة جميع العائد على الاستثمار كما هو الحال في الخطوة 6.2.2. استخدام ROIs المخزنة في إدارة عائد الاستثمار.
   7. تصدير القياسات إلى برنامج جدول البيانات.
   8. حفظ ROIs للرجوع إليها في المستقبل عن طريق النقر على مدير عائد الاستثمار | ctrl + A لتحديد جميع ROIs | المزيد من | حفظ.
   9. الموصى بها: توليد كثافة مقابل الوقت المؤامرات من آثار 405 و 488 نانومتر. تحقق من عدم وجود تبييض ملحوظ في أي من القناتين (يجب أن تكون كثافة الإشارة في نهاية سلسلة التصوير ≥98٪ من الصورة الأولى) وأن التتبعين ينتقلان إلى اتجاهين متعاكسين أثناء استجابات الاستشعار (على سبيل المثال ، يجب أن يزيد تتبع 405 نانومتر أثناء الأكسدة بينما يجب أن ينخفض تتبع 488 نانومتر).
3. تطبيع البيانات
   1. لكل عائد استثمار من صورة النسبة، حدد القيمة القصوى أثناء علاج DA (_Rmax) والقيمة الدنيا أثناء علاج DTT (_Rmin).
   2. حساب نسبة تسويتها كما يلي:
      
      ملاحظة: هذا سيتم تعيين الحد الأقصى للنسبة إلى 1.0 والحد الأدنى للنسبة إلى 0.
4. تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا
   1. للحصول على قياسات مورفولوجيا الميتوكوندريا بالتوازي مع كثافة roGFP في الخطوة 6.2.6 ، انتقل إلى تحليل | تعيين القياسات والتحقق من واصفات الشكل واحتواء القطع الناقص.
      ملاحظة: بالإضافة إلى متوسط الكثافة، ستشمل القياسات في نافذة النتائج طول المحور الرئيسي (Major)، وطول المحور الثانوي (الصغرى)، ونسبة العرض إلى الارتفاع (AR؛ والمحور الرئيسي مقسوما على محور ثانوي؛ والميتوكوندريا المستديرة لها AR ~ 1، والميتوكوندريا الممدودة لها AR أكبر)، بالإضافة إلى قياسات التعميم (Circ.) والتقريب (الجولة).

القياس الكمي للاختلافات في حالة الأكسدة الميتوكوندريا الثابتة بعد انسحاب عامل النمو
لإثبات كمية الاختلافات في الحالة الثابتة في حالة الأكسدة الميتوكوندريا ، تمت مقارنة الخلايا العصبية الأولية التي تزرع في الوسط القياسي بالخلايا العصبية المستزرعة دون عوامل نمو لمدة 48 ساعة قبل التصوير. نتائج انسحاب عامل النمو في موت الخلايا العصبية المبرمج بعد 72 h16. تم تصوير الخلايا بعد 48 ساعة لاختبار ما إذا كان هذا يسبقه تغييرات في حالة أكسدة الميتوكوندريا. أصيبت الخلايا العصبية القشرية الجرذ الأولية التي تزرع على الأغطية المغلفة بولي-L-ornithine مع rAAV-mito-Grx1-roGFP2 في أيام في المختبر 6 (DIV6) وصورت على DIV12. تم إجراء التصوير الحي في درجة حرارة الغرفة وفقا للقسم 4 من هذا البروتوكول على مجهر كونفوجكال ليزر مقلوب مجهز بهدف غمر المياه 40x/1.10. وكانت إعدادات Confocal الثقب 7 وحدات متجدد الهواء، حجم بكسل 568.7 نانومتر (512 × 512 بكسل)، سرعة المسح الضوئي 600 هرتز، قوة الليزر 405 نانومتر 3٪، قوة الليزر 488 نانومتر 1٪، عرض النطاق الترددي الانبعاثات 505-550 نانومتر، ومتوسط الإطار 4. لم يكن هناك فرق كبير بين نسب 405:488 نانومتر الخام من الشرطين (الشكل 3B). بعد تطبيع البيانات، تم الكشف عن مجموعة فرعية من الخلايا مع زيادة نسبة 405:488 نانومتر في مجموعة سحب عامل النمو (الشكل 3C). وهذا يشير إلى أن تغييرات أكسدة الميتوكوندريا قد تسبق موت الخلايا العصبية، ويؤكد على أهمية تطبيع البيانات ماكس / دقيقة للمقارنة بين حالات الأكسدة القاعدية بين المجموعات.

التغيرات الديناميكية في حالة الأكسدة الميتوكوندريا عند علاج الخلايا العصبية مع NMDA
مستقبلات الغلوتامات NMDA من نوع (NMDAR) يلعب دورا مركزيا في اللدونة العصبية ولكن يمكن أيضا التوسط تلف الخلايا العصبية وموت الخلية. التنشيط المرضي لNMDAR يؤدي إلى العديد من الآثار السلبية على الميتوكوندريا التي تشمل مصفوفة الكالسيوم الزائد, أكسدة الميتوكوندريا والتجزؤ, والانتقال نفاذية الميتوكوندريا. في دراسة سابقة، تم استخدام البروتوكول المذكور أعلاه للتحقيق في العلاقة السببية بين الحمل الزائد للكالسيوم الميتوكوندريا الناجم عن NMDA وأكسدة الميتوكوندريا13. أصيبت الخلايا العصبية فرس النهر الفئران الأولية التي تزرع على بولي-د-ليسين/مغلفة باللمينين مع rAAV-mito-Grx1-roGFP2 على DIV4 وصورت على DIV12. تم إجراء التصوير الحي عند 37 درجة مئوية على مجهر كونفوجكال قرص دوار مقلوب مجهز بهدف غمر متعدد 20x/0.75 (تم استخدام غمر الماء) ونظام حضانة على خشبة المسرح. كانت Mito-Grx1-roGFP2 متحمسة بشكل متسلسل كل 20 ثانية باستخدام خطوط الليزر 405 نانومتر و488 نانومتر ، وتم جمع الانبعاثات مع فلتر انبعاثات 527/55 نانومتر لكلا الطولين الموجيين للإثارة. تسبب علاج الخلايا العصبية مع 30 μM NMDA أكسدة الميتوكوندريا في غضون دقائق قليلة (الشكل 4A، B). وتجدر الإشارة إلى أن الحماض الميتوكوندريا الناجم عن NMDA تسبب في إخماد كبير للفلورة roGFP2 ، بما يتماشى مع حساسية الأسكسيد الحموضة المعروفة8. للتأكد من أن هذا الترويض المعتمد على الحموضة لم يؤثر على نسبة 405:4889 ، تم أكسدة الميتوكوندريا بالكامل من قبل DA قبل إضافة NMDA في تجربة التحكم. المعالجة المسبقة مع DA يمنع أي أكسدة أخرى من الميتوكوندريا من قبل NMDA، وبالتالي، فإن نسبة 405:488 لم تتغير في هذه التجربة على الرغم من إخماد كبير من كثافة الفلورية roGFP2 (الشكل 4C).

تحليل متعدد البارامترات للتغيرات الناجمة عن NMDA من الميتوكوندريا التشجرية
لتقييم التسلسل الزمني للتغيرات الناجمة عن NMDA في مورفولوجيا الميتوكوندريا ، وإمكانات الأغشية ، وحالة الأكسدة ، تم إجراء التصوير الموازي لفلورة TMRE - و mito-Grx1-roGFP2 بدقة مكانية وزمنية عالية. أصيبت الخلايا العصبية القشرية الجرذ الأولية التي تزرع على الأغطية المغلفة بولي-L-ornithine مع rAAV-mito-Grx1-roGFP2 على DIV6 وصورت على DIV12. تم إجراء التصوير الحي في درجة حرارة الغرفة على مجهر مسح ليزر كونفوج مقلوب باستخدام هدف غمر الزيت 63x/1.40 ، وسرعة المسح الضوئي 600 هرتز ، وحجم بكسل 90.2 نانومتر (1024 × 1024 بكسل في تكبير المسح الضوئي 2x) ، وحجم الثقب من 3 وحدات متجدد الهواء ، ومتوسط الإطار 2. كل 30 ثانية، تم تسجيل ثلاث صور في وضع متتابع: 405 نانومتر من الإثارة/505-550 نانومتر من الانبعاثات؛ 405 نانومتر من الإثارة/505-550 نانومتر؛ 405 نانومتر؛ 405 نانومتر؛ 405 نانومتر؛ 405 نانومتر؛ 505-550 نانومتر؛ 488 نانومتر الإثارة/505-550 نانومتر الانبعاثات; 552 نانومتر الإثارة/560-600 نانومتر الانبعاثات. أدى علاج الخلايا العصبية مع NMDA 60 ميكرومتر في فقدان إشارة TMRE وزيادة في نسبة roGFP 405:488 نانومتر، تليها بعض التقريب المتأخر من الميتوكوندريا (الشكل 5).

الشكل 1: التمثيل التخطيطي لوظيفة Grx1-roGFP2 وأطياف الإثارة roGFP2. (أ) الإجهاد التأكسدي والعمل من أنظمة الدفاع المضادة للأكسدة أكسدة تجمع الجلوتاثيون الخلوية. Grx1 في البروتين الانصهار Grx1-roGPF2 يعزز التوازن السريع للدولة الأكسدة roGFP2 مع حالة الأكسدة من تجمع الجلوتاثيون. ويمكن تقييم حالة الأكسدة من تجمع roGFP2 من خلال رصد نسبة انبعاثات GFP-مضان في 510 نانومتر بعد الإثارة في 405 نانومتر و 488 نانومتر. وتظهر الأنواع المنخفضة باللون الأزرق؛ تظهر الأنواع المؤتأكسدة باللون الأحمر. (ب) أطياف الإثارة من انخفاض تماما (الأزرق) وتأكسد (الأحمر) roGFP2. عند أكسدة roGFP2 ، تزداد انبعاثات الفلورسينس عند 400 نانومتر ، في حين تنخفض الانبعاثات عند 490 نانومتر من الإثارة. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق13. تم رسم أطياف الإثارة في B استنادا إلى الشكل 1B من 8. خطوط منقط في B تشير إلى أطوال موجية من خطوط الليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر المستخدمة عادة. الاختصارات: GSH = الجلوتاثيون; GSSG = الغلوتاثيون المؤتأكسدة; Grx = الغلوتاريدوشين; roGFP = متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس للأكسدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: سير العمل للطريقة. التعبير عن الإثارة-ratiometric الأكسدة الحساسة للبروتين الفلورسنت roGFP2 في الخلايا العصبية يمكن أن يتحقق من خلال العديد من الطرق التي تشمل إعادة العدوى, شفط الدهون, نقل الجينات الفيروسية, والحيوانات المعدلة وراثيا. يمكن استخدام المستشعر لدراسة حالة الأكسدة العصبية في الخلايا العصبية الأولية المستزرعة ، والنباتات الخارجية للأنسجة الحية ، والحيوانات السليمة. يمكن إجراء التصوير roGFP2 على مجموعة متنوعة من المجاهر التي تشمل المجاهر الفلورية واسعة النطاق، المجاهر confocal، والمجاهر 2 فوتون. يمكن إجراء تحليل لبيانات التصوير roGFP2 مع برنامج ImageJ/FIJI المتاح مجانا. اختصار: roGFP = متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس للأكسدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: سحب عامل النمو يسبب أكسدة الميتوكوندريا العصبية. (أ) ممثل 405:488 نانومتر نسبة الصور من الخلايا العصبية المستزرعة في وجود (+ GF) أو غياب (- GF) من عوامل النمو لمدة 48 ساعة قبل التصوير. تمثل المقاييس المرمزة بالألوان نسبا غير طبيعية تبلغ 405:488 نانومتر (تتوافق النسب المنخفضة مع حالة مخفضة؛ وتماثل النسب الأعلى حالة مؤتأكسدة). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (ب) القياس الكمي لنسبة 405:488 نانومتر في الخلايا العصبية الفردية. (ج) ماكس / دقيقة معايرة 405:488 نانومتر نسبة الخلايا العصبية الفردية. تمثل الرموز المستديرة خلايا مفردة؛ يمثل الشريط متوسط. N = 40-44 خلية من 3 أغطية من إعداد واحد. اختصار: GF = عامل النمو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: NMDA الناجمة عن أكسدة الميتوكوندريا العصبية. (أ) ممثل 405:488 نانومتر نسبة الصور قبل وبعد العلاج مع 30 μM NMDA وبعد المعايرة ماكس / دقيقة مع DA وDTT. في هذا التكبير ، يتم الكشف عن إشارة roGFP في الغالب في السماء والتشعبات القريبة. يمثل المقياس المرمز بالألوان نسبا غير طبيعية تبلغ 405:488 نانومتر (تتوافق النسب المنخفضة مع حالة مخفضة؛ وتتوافق النسب الأعلى مع الحالة المؤتأكسدة). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (ب) القياس الكمي لتشغيل التصوير الموضح في A. NMDA يحفز أكسدة الميتوكوندريا السريعة والمستدامة التي يمكن معايرة باستخدام DA و DTT. (ج) يسبب الحماض الميتوكوندريا الناجم عن NMDA انخفاضا في مضان GFP على كل من 405 نانومتر و488 نانومتر من الإثارة (اللوحة العلوية). لعزل تأثير درجة الحموضة مدفوعة وتأكيد أن نسبة 405:488 نانومتر غير حساسة درجة الحموضة، تم أكسدة الخلايا العصبية أولا إلى أقصى حد باستخدام DA وتحدى في وقت لاحق مع NMDA في وجود DA (لوحة أقل). في ظل هذه الظروف، NMDA لا يزال يسبب حموضة الميتوكوندريا ولكن لا مزيد من أكسدة الميتوكوندريا. وبناء على ذلك، وعلى الرغم من أن كلا من 405 نانومتر و 488 نانومتر تظهر انخفاض درجة الحموضة يحركها في كثافة الفلورسينس، فإن نسبة 405:488 نانومتر لا تزال مستقرة. وقد تم تعديل هذا الرقم من 13. الاختصارات: GFP = بروتين فلوري أخضر. roGFP = متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس للأكسدة؛ NMDA = N-ميثيل-D-الأسبارتات; DA = دياميد; DTT = ديثيوثيريتول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التغيرات الناجمة عن NMDA في إمكانات الأغشية، وحالة الأكسدة، ومورفولوجيا الميتوكوندريا التشجرية. (أ) ثلاث صور عالية التكبير من تجربة الفاصل الزمني، المكتسبة في t = 1 و 4 و 9 دقائق، والتي تظهر الميتوكوندريا التشجرية والأجنالية. يمثل التلوين كثافة TMRE (انظر شريط المعايرة). (ب) 405:488 نانومتر صور نسبة roGFP من نفس التجربة الفاصل الزمني كما هو الحال في (أ) في ر = 1 و 4 و 9 دقائق. لاحظ أنه بسبب كفاءة العدوى AAV محدودة، فقط مجموعة فرعية من الخلايا العصبية يعبر عن mito-Grx1-roGFP2، وبالتالي، ليست كل الميتوكوندريا إيجابية TMRE هي roGFP إيجابية. يمثل شريط المعايرة المرمز بالألوان نسبا غير طبيعية تبلغ 405:488 نانومتر (تتوافق النسب المنخفضة مع حالة مخفضة؛ وتتوافق النسب الأعلى مع الحالة المؤتأكسدة). (ج) تحديد كمية كثافة TMRE، roGFP 405:488 نانومتر نسبة، والتقريب من ميتوشوندريون واحد (المشار إليها بالسهام في A، B). بعد 1 دقيقة من تسجيل خط الأساس، تمت إضافة 60 ميكرومتر NMDA إلى محلول الحمام. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. يصور المحور ص في C نسبة roGFP 405:488 نانومتر بالنسبة إلى خط الأساس T0 (الخط الأخضر المتقطع)، وكثافة تفلور TMRE بالنسبة إلى خط الأساس T0 (الخط المنقط الأحمر)، واصف شكل FIJI/ImageJ "الاستدارة" (الخط الصلب الأسود). الاختصارات: GFP = roGFP = متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس للأكسدة؛ ميتو-Grx1-roGFP2 = الجلوتاريدوشين-1 تنصهر إلى N-terminus من roGFP; AAV = الفيروس المرتبط بال أدينو؛ TMRE = رباعي ميثيل هودامين، استر الإيثيل؛ NMDA = N-ميثيل-D-الأسبارتات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.