يصف البروتوكول الحالي كيفية استخدام علم البصريات اللاسلكي جنبا إلى جنب مع تصوير الفيديو عالي السرعة في مهمة واحدة للوصول إلى الإمساك لتوصيف الدوائر العصبية المشاركة في أداء السلوك الحركي الماهر في الفئران التي تتحرك بحرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في فيفو التحكم البصري الوراثي اللاسلكي للسلوك الحركي الماهر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المهارات الحركية الدقيقة ضرورية في الحياة اليومية ويمكن أن تتعرض للخطر في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي. يتطلب اكتساب هذه المهام وأدائها تكاملا حسيا حركيا وينطوي على تحكم دقيق في دوائر الدماغ الثنائية. سيؤدي تنفيذ النماذج السلوكية أحادية اليد في النماذج الحيوانية إلى تحسين فهم مساهمة هياكل الدماغ ، مثل المخطط ، في السلوك الحركي المعقد لأنه يسمح بالتلاعب وتسجيل النشاط العصبي لنوى معينة في ظروف التحكم والمرض أثناء أداء المهمة.
منذ إنشائه ، كان علم البصريات الوراثي أداة مهيمنة لاستجواب الدماغ من خلال تمكين التنشيط أو تثبيط الانتقائية والمستهدفة للسكان العصبيين. إن الجمع بين علم البصريات الوراثي والاختبارات السلوكية يلقي الضوء على الآليات الأساسية لوظائف الدماغ المحددة. تسمح الأنظمة اللاسلكية المثبتة على الرأس مع الثنائيات المصغرة الباعثة للضوء (LEDs) بالتحكم البصري الوراثي عن بعد في يتحرك بحرية تماما. هذا يتجنب قيود النظام السلكي كونه أقل تقييدا لسلوك الحيوانات دون المساس بكفاءة انبعاثات الضوء. يجمع البروتوكول الحالي بين نهج علم البصريات اللاسلكي وتصوير الفيديو عالي السرعة في مهمة براعة أحادية يدوية لتشريح مساهمة مجموعات عصبية محددة في السلوك الحركي الدقيق.
المقدمة
السلوك الحركي الماهر موجود خلال معظم الحركات التي نقوم بها ، ومن المعروف أنه يتأثر في العديد من اضطرابات الدماغ1،2،3،4،5،6. يعد تنفيذ المهام التي تسمح بدراسة تطوير الحركات الماهرة وتعلمها وأدائها أمرا بالغ الأهمية لفهم الأسس العصبية البيولوجية للوظيفة الحركية ، خاصة في نماذج إصابات الدماغ والاضطرابات العصبية التنكسية والنمو العصبي 2,7,8,9,10,11,12,13 . يتم الوصول إلى الأشياء واسترجاعها بشكل روتيني في إجراءات الحياة اليومية ، وهي واحدة من أوائل المهارات الحركية المكتسبة خلال التطوير المبكر ثم يتم صقلها عبر السنين 5,6. وهو يتألف من سلوك معقد يتطلب عمليات حسية حركية مثل إدراك ميزات الجسم ، وتخطيط الحركة ، واختيار الحركة ، وتنفيذ الحركة ، وتنسيق الجسم ، وتعديل السرعة7،14،15،16. وبالتالي ، تتطلب مهام البراعة العالية أحادية اليد مشاركة العديد من هياكل الدماغ في نصفي الكرة الأرضية16،17،18،19،20،21،22. في الفئران ، تتميز مهمة الوصول إلى الإمساك بالكريات المفردة لعدة مراحل يمكن التحكم فيها وتحليلها بشكل منفصل7،13،23. تسمح هذه الميزة بدراسة مساهمة مجموعات فرعية عصبية محددة في مراحل مختلفة من اكتساب وأداء السلوك وتوفر منصة للدراسات التفصيلية للأنظمة الحركية13،23،24. تحدث الحركة في بضع ثوان. وبالتالي ، ينبغي استخدام تصوير الفيديو عالي السرعة للتحليل الحركي في مراحل متميزة من المسار الحركي الماهر 7,25. يمكن استخراج العديد من المعلمات من مقاطع الفيديو ، بما في ذلك وضع الجسم والمسار والسرعة ونوع الأخطاء25. يمكن استخدام التحليل الحركي للكشف عن التغيرات الطفيفة أثناء التلاعب البصري الوراثي اللاسلكي 7,23.
إن استخدام الثنائيات المصغرة الباعثة للضوء (LEDs) لتوصيل الضوء عبر نظام لاسلكي مثبت على الرأس يجعل من الممكن التحكم البصري الوراثي عن بعد أثناء أداء الحيوان للمهمة. تقبل وحدة التحكم البصرية الجينية اللاسلكية أوامر الزناد أحادية النبضة أو المستمرة من محفز وترسل إشارات الأشعة تحت الحمراء (IR) إلى جهاز استقبال متصل ب LED المصغر23,26. يجمع البروتوكول الحالي بين هذا النهج اللاسلكي البصري الوراثي مع تصوير الفيديو عالي السرعة لمهمة براعة لتشريح دور مجموعات عصبية محددة أثناء أداء السلوك الحركي الدقيق23. نظرا لأنها مهمة أحادية اليد ، فإنها تسمح بتقييم مشاركة الهياكل في نصفي الكرة الأرضية. تقليديا ، يتحكم الدماغ في حركة الجسم بطريقة غير متماثلة للغاية. ومع ذلك ، تتطلب المهام عالية البراعة تنسيقا دقيقا وتحكما من العديد من هياكل الدماغ ، بما في ذلك النوى الجانبية والمساهمة التفاضلية للسكان الفرعيين العصبيين داخل النوى10،20،21،22،23. يوضح هذا البروتوكول أن الهياكل تحت القشرية من نصفي الكرة الأرضية تتحكم في مسار الطرف الأمامي23. يمكن أن يكون هذا النموذج مناسبا لدراسة مناطق الدماغ الأخرى ونماذج أمراض الدماغ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية ووافقت عليها اللجنة المؤسسية المقابلة لرعاية الحيوانات واستخدامها (معهد علم وظائف الأعضاء الخلوية بروتوكول IACUC VLH151-19). تم استخدام الفئران الذكور المعدلة وراثيا Drd1-Cre27 ، 35-40 يوما بعد الولادة مع خلفية C57BL / 6 في البروتوكول الحالي. تم الاحتفاظ بالفئران في ظل الظروف التالية: درجة الحرارة 22±1 درجة مئوية. الرطوبة 55 ٪. جدول الإضاءة 12/12 ساعة مع إطفاء الأنوار في الساعة 7 مساء وتم فطامها في يوم ما بعد الولادة 21. تم إيواء الجراء المفطومة في مجموعات من نفس الجنس من 2-5. تم إيواء الحيوانات في مساكن ثابتة مع قمم الحواجز الصغيرة. يتكون الفراش من نجارة الحور الرجراج المعقمة. تم توفير كريات القوارض والمياه النقية RO بشكل مخصص ، إلا عند الإشارة إليها.
1. العمليات الجراحية
- قم بإعداد قنية LED بالطول المطلوب وفقا للإحداثيات الظهرية البطنية للهيكل محل الاهتمام (من الناحية المثالية 0.5 مم أطول لحساب سمك الجمجمة ، للمخطط الظهري الجانبي 3.5 مم) (الشكل 1).
- قم بقطع الألياف الزجاجية إلى طول أطول من الحجم النهائي المطلوب ، وطحن طرف الألياف إلى الطول المستهدف بورق صنفرة خشن ، وأخيرا ، قم بتلميع طرف الألياف بورق صنفرة ناعم.
ملاحظة: قنية LED عبارة عن ألياف بصرية زجاجية قطرها 250 ميكرومتر متصلة بجهاز استقبال الأشعة تحت الحمراء (انظر جدول المواد).
- قم بقطع الألياف الزجاجية إلى طول أطول من الحجم النهائي المطلوب ، وطحن طرف الألياف إلى الطول المستهدف بورق صنفرة خشن ، وأخيرا ، قم بتلميع طرف الألياف بورق صنفرة ناعم.
- اسحب الماصات الزجاجية (قطرها الخارجي 1.14 مم وقطرها الداخلي 0.53 مم وطولها 3.5 مم) للحاقن النانوي باستخدام مجتذب أفقي (انظر جدول المواد) وتخزينها لوقت لاحق. قم ببرمجة المجتذب في حلقة واحدة للحصول على قطر طرف 15-20 ميكرومتر مع مستدق منحدر تدريجي طويل (4-5 مم).
- قم بإعداد منطقة الجراحة عن طريق التطهير الدقيق للجهاز المجسم، وغطاء المحرك، والحاقن الصغير (انظر جدول المواد)، والأسطح المحيطة بالإيثانول بنسبة 70٪.
ملاحظة: يعد جهاز التاكسي المجسمة للفأر ضروريا لحقن فيروس أدينو المرتبط (AAVs) بدقة ووضع قنية LED في المنطقة محل الاهتمام. - ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة لهذا الإجراء ، بما في ذلك معطف المختبر النظيف أو الثوب الجراحي الذي يمكن التخلص منه ، والقفازات المعقمة ، وقناع الوجه ، وغطاء الرأس القابل للتصرف.
- ضع المعدات اللازمة بالقرب من منطقة الجراحة ، مثل الأدوات الجراحية المعقمة ، ونصائح القطن ، والمحاليل ، والماصة الدقيقة ، ونصائح الماصة ، والشعيرات الدموية ، والملء الدقيق بالزيوت المعدنية ، والعلامة.
- املأ ماصة للحقن المجهري بالزيوت المعدنية وضعها في الحاقن الصغير. تأكد من أن الحاقن الصغير يعمل بشكل صحيح عن طريق إخراج بعض الزيوت المعدنية.
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الأدوات المستخدمة أثناء الجراحة معقمة ومعقمة. يجب استخدام تقنية التعقيم. - تخدير الحيوانات مع الايزوفلوران الغازي 4-5 ٪ للحث على التخدير و 1.2 ٪ طوال الجراحة مع 0.5-1 لتر / دقيقة من الأكسجين النقي. تبدأ الجراحة فقط بعد أن يصل الحيوان إلى نقطة تخدير عميق ، يتم تقييمها من خلال عدم وجود انسحاب مخلب بعد قرصة طفيفة.
- مراقبة مستمرة لمعدل التنفس ودرجة حرارة الحيوان. حافظ على درجة حرارة الجسم بواسطة وسادة تدفئة مثبتة على 34 درجة مئوية.
- تطبيق مرهم العيون. إزالة الشعر من فروة الرأس مع أداة تشذيب وكريم إزالة الشعر. امسح فروة الرأس بمسحات قطنية تحتوي على 8٪ من البوفيدون واليود (انظر جدول المواد) و 70٪ من الإيثانول بالتناوب ثلاث مرات لكل منهما.
- ضع الماوس في الجهاز المجسمة وقم بتأمين الرأس ، مما يضمن تسوية الجمجمة في المحاور المتوسطة الجانبية والأمامية الخلفية.
- قم بعمل شق 1 سم باستخدام مشرط عبر فروة الرأس على مستوى العينين على طول المحور السهمي. سحب الجلد لكشف الجمجمة وتنظيف السمحاق بمسحات القطن.
- نظف سطح الجمجمة بمحلول ملحي ومسحات قطنية معقمة. حل أي نزيف على السطح باستخدام رماح العين الماصة المعقمة (انظر جدول المواد) أو مواد ماصة معقمة مماثلة.
- ضع قطرة من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 2.5٪ باستخدام قطعة قطن واتركها تعمل لبضع ثوان لجعل خيوط الجمجمة مرئية والحصول على مرجع أفضل. بعد بضع ثوان ، نظف جيدا باستخدام قطعة قطن نظيفة.
- باستخدام الماصة الزجاجية (قطر الطرف النهائي 15 ميكرومتر) ، حدد موقع bregma و lambda للتحقق من تسوية الجمجمة في المحور الأمامي الخلفي.
ملاحظة: يوصى باستخدام مجهر مجسمي أو مجهر USB لرؤية طرف الماصة الزجاجية. في حالة الحاجة إلى ذلك ، اضبط ارتفاع حامل الفم لتسوية الجمجمة. - حرك الشعيرات الدموية نحو الإحداثيات الأمامية والخلفية (AP) والإحداثيات الإنسية الجانبية (ML) المحددة (المخطط الظهري الجانبي AP 1.2 مم ، ML 2.28 مم). قم بطلاء نقطة مرجعية في فروة الرأس فوق الإحداثيات المحددة بعلامة معقمة.
- في النقطة المرجعية ، قم بإجراء بضع القحف بقطر ~ 1 مم مع تطبيق ضغط لطيف على الجمجمة باستخدام أداة دوارة معقمة أو مثقاب أسنان بسرعة منخفضة إلى متوسطة باستخدام مثقاب أسنان دائري صغير (انظر جدول المواد).
- قم بتحميل الشعيرات الدموية ب 300-400 نانولتر من الفيروس المرتبط بالأدينو المعتمد على Cre (AAV) مثل AAV1-dflox-hChR-2-mCherry للتعبير عن Channelrhodopsin أو AAV للتعبير فقط عن البروتين المراسل (على سبيل المثال ، mCherry) كعنصر تحكم في المنطقة ذات الاهتمام (انظر جدول المواد). تحقق من أن الطرف غير مسدود ، ثم أدخل الماصة الزجاجية في الدماغ عند الإحداثيات الظهرية البطنية (DV) المطلوبة (المخطط الظهري الجانبي DV -3.35 مم).
- حقن 200 نانولتر باستخدام حاقن أوتوماتيكي بمعدل 23 نانولتر / ثانية. انتظر لمدة 10 دقائق بعد الانتهاء من الحقن ، واسحب الماصة الزجاجية ببطء لتجنب الانسكاب.
ملاحظة: من الممكن استخدام إبرة 30 جم للحقن بالحاقن الدقيق المناسب.
- حقن 200 نانولتر باستخدام حاقن أوتوماتيكي بمعدل 23 نانولتر / ثانية. انتظر لمدة 10 دقائق بعد الانتهاء من الحقن ، واسحب الماصة الزجاجية ببطء لتجنب الانسكاب.
- تنظيف وتجفيف أي بقايا مع مسحات القطن.
- قم بتوصيل قنية LED الزجاجية المعقمة بالذراع المجسمة ومعايرة الإحداثيات باستخدام bregma كمرجع. أدخل القنية ببطء شديد (300 ميكرومتر / دقيقة) لتجنب تلف الأنسجة ووضعها على بعد 100 ميكرومتر فوق موقع الحقن.
- بمجرد أن تكون قنية LED في مكانها ، أضف قطرة (100 ميكرولتر) من لاصق الأنسجة على حافة بضع القحف.
- تحضير خليط أسمنت الأسنان (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة لتثبيت الألياف في الجمجمة.
ملاحظة: باختصار ، استخدم طبقا من البورسلين المبرد للحصول على مزيد من وقت العمل قبل مجموعات الأسمنت. أضف 2 مغرفة من مسحوق الراتنج الشفاف إلى طبق البورسلين ، وأضف 4 قطرات من القاعدة السريعة و 1 قطرة من المحفز ، ثم اخلطها جيدا. يمكن ضبط نسبة المسحوق / السائل إذا كانت هناك حاجة إلى لزوجة أرق أو أكثر سمكا. - باستخدام فرشاة معقمة ، ضع خليط أسمنت الأسنان حول موصل القنية شيئا فشيئا ، وقم ببناء طبقات حتى يتم تغطية الجمجمة ويتم توصيل الموصل بإحكام بالجمجمة ، تاركا المسامير خالية تماما. تجنب الحصول على أسمنت الأسنان على جلد الماوس.
- اتركيه جافا تماما.
- أغلق الجلد حول الغرسة باستخدام لاصق الأنسجة (انظر جدول المواد).
- ضع الماوس في قفص الاسترداد فوق وسادة تسخين عند 33 درجة مئوية. راقب وجود واحدة أو أكثر من علامات الألم / عدم الراحة التالية: 1) منحني أو نقص أو تقليل النشاط الحركي ، 2) الفشل في الاستمالة ينعكس في معطف قذر غير محفوظ ، 3) لعق أو خدش مفرط ، احمرار في موقع الشق ، 4) السلوك العدواني ، 5) فقدان الشهية أو الجفاف ، و 6) عدم تكوين العش.
ملاحظة: حافظ على الماوس في قفص فردي أثناء جميع الإجراءات لتجنب فصل الزرع. في حالة انفصال القنية ، قم بإجراء القتل الرحيم عن طريق حقن 150 ملغم / كغم من بنتوباربيتال الصوديوم متبوعا بقطع الرأس بعد الوصول إلى التخدير العميق. - حقن الميلوكسيكام تحت الجلد (SC) 1 مغ / كغ مرة واحدة يوميا لمدة ثلاثة أيام بعد الجراحة لتوفير مسكن.
- انتظر 7 أيام على الأقل للتعافي التام و 14 يوما للتعبير عن opsin قبل اتخاذ مزيد من الإجراءات.
ملاحظة: قم بإجراء متابعة ما بعد الجراحة كل 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام ، ثم تحقق من الحيوانات كل يوم حتى يوم القتل الرحيم في نهاية التجربة.
2. التدريب على الوصول إلى الفهم
- في اليوم 7 بعد الجراحة ، ابدأ بروتوكول الحرمان من الطعام28. وزن الفئران لمدة ثلاثة أيام متتالية لتحديد متوسط وزن جسمها الدائم. بعد ذلك ، قم بجدولة القيود الغذائية بحيث تتلقى الحيوانات ما يكفي من العناصر الغذائية للحفاظ على ما يقرب من 90 ٪ ولا تقل عن 85 ٪ من وزن الجسم.
ملاحظة: يتم تحقيق ذلك من خلال توفير 2.5-3 غرام من الطعام يوميا. راقب وزن الحيوانات يوميا وسجل للرفاهية العامة مع مراقبة سلوك الحيوانات ومظهرها ، على سبيل المثال ، مظهر المعطف والعينين. استخدم نظام تسجيل حالة الجسم من المرجع29. - خلال فترات ما قبل التدريب والتدريب والاختبار ، قم بتزويد كل فأر ب 20 كريات (20 ملغ من الكريات بنكهة الشوكولاتة الخالية من الغبار) يوميا (انظر جدول المواد) (تؤكل أثناء المهمة أو بعدها) إلى جانب كريات الطعام القياسية.
- قبل ثلاثة أيام من التعود ، نثر 0.4 جم / / يوم 20 ملغ من الكريات بنكهة الشوكولاتة الخالية من الغبار في أقفاصها المنزلية ، حتى تتعرف الفئران على الكريات التي تعمل كمكافأة أثناء مهمة الوصول إلى الفهم.
- اعتاد الفئران عن طريق وضعها لمدة 10 دقائق في غرفة الاختبار قبل يوم واحد من التدريب المسبق باستخدام الكريات المتناثرة على أرضية الغرفة (الشكل 1A).
- اسمح بتناول الطعام يوميا بعد التدريب والاختبار. احتفظ بجدول زمني مماثل كل يوم.
- في اليوم الأول من التدريب المسبق ، ضع الفئران في غرفة الوصول إلى الإمساك وراقب من الأمام. ضع الكريات أمام الغرفة بالقرب من الفتحة حتى تبدأ في استهلاك الكريات. في هذه المرحلة ، يسمح للفئران بالاستيلاء على الكريات بأي شكل من الأشكال.
- في اليوم الثاني من التدريب المسبق ، ضع الكريات أكثر فأكثر من الفتحة حتى تصل إلى المسافة البادئة (1 سم من الفتحة) حتى تتمكن الفئران من تشكيل حركتها التي تصل إلى الإمساك (الشكل 1C).
- تدريب الفئران على الركض إلى الجزء الخلفي من القفص والعودة إلى فتحة القفص لتلقي حبيبات الطعام التالية كاستراتيجية لإضفاء الطابع الفردي على التجارب.
ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك عن طريق الانتظار حتى يكون الماوس في الجزء الخلفي من القفص قبل وضع حبيبة في المسافة البادئة لكل تجربة. - ضع الكريات ليتم الإمساك بها إما بواسطة مخلبها الأيمن أو الأيسر.
ملاحظة: تبدأ الفئران باستخدام مخلب واحد بشكل تفضيلي للإمساك ، والذي سيتم استخدامه في الأيام التالية من التدريب والاختبار. - تدريب الحيوانات لمدة 6 أيام في جلسات يومية تستمر 20 تجربة أو حتى انقضاء 10 دقائق كحد أقصى. من اليوم الثاني من التدريب ، ضع جهاز الاستقبال الوهمي (الأبعاد 12 × 18 × 7 مم ، 1 جم ، انظر جدول المواد) ، حتى تعتاد الفئران على الوزن أثناء أداء المهمة (الشكل 1B). كل يوم يسجل عدد المحاكمات التي تم ضربها وتفويتها.
- سجل السلوك باستخدام كاميرا عادية والتقط 30-60 إطارا / ثانية من الجزء الأمامي من الغرفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء وضع مرآة تحت غرفة التدريب بزاوية 45 درجة لمراقبة وضع الحيوانات (الشكل 1D ، E).
- للتحليل الحركي اللاحق (الشكل 2)، قم بتركيب كاميرا عالية السرعة (انظر جدول المواد) بزاوية 45 درجة للتسجيل من جانب القفص. إذا كانت هناك حاجة إلى تحليل 3D ، فضع كاميرا ثانية عالية السرعة للتسجيل بزاوية 35 درجة من مقدمة الغرفة ؛ يجب وضع كلتا الكاميرتين في الجانب الأيمن أو الأيسر من القفص اعتمادا على جانب الحيوانات ويجب التقاطهما بنفس معدل الإطارات ومزامنتهما7 (الشكل 3D ، E).
- اضبط الكاميرات عالية السرعة على 100 إطار / ثانية بدقة 376 × 252 بكسل أو أكثر إن أمكن. ضع جدران الستايروفوم البيضاء خلف جانبي ومؤخرة الغرفة لتقليل الخلفية وزيادة التباين (الشكل 1E).
- في يوم الاختبار، استبدل الوحدة الوهمية بجهاز استقبال الأشعة تحت الحمراء للتحفيز البصري الوراثي اللاسلكي (الشكل 1B,C).
- عندما تبدأ الفئران في الوصول ، قم بتشغيل قنية LED يدويا باستخدام وحدة التحكم عن بعد للحصول على تحفيز مستمر للوقت الذي يتم فيه تنفيذ السلوك ولمدة لا تزيد عن 2 ثانية. يفضل برمجة نموذج التحفيز التلقائي. يقوم جهاز التحفيز بتشغيل مؤشر LED يبلغ 470 نانومتر (الضوء الأزرق) مع كثافة عند طرف 1.0 mW / mm2.
- اجمع مقاطع الفيديو لمزيد من الفحص ، بما في ذلك التسجيل والتحليل الحركي.
3. تأكيد نسيجي لاحق مخصص
- عند الانتهاء من التجربة ، تأكد من التعبير الفيروسي ووضع قنية LED. تخدير الحيوان مع كوكتيل من الكيتامين 100 ملغم / كغم و زيلازين 10 ملغ / كغ. بمجرد أن يظهر الماوس علامات التخدير العميق (الخطوة 1.7) ، قم باختراق المياه المالحة العازلة بالفوسفات البارد (PBS) تليها 4٪ PFA.
- قم بإزالة القنية المزروعة بعناية عن طريق الإمساك بإحكام بالموصل باستخدام الملقط وسحبه بلطف.
- استخراج وبعد إصلاح الدماغ لمدة 24 ساعة في 4٪ PFA23.
- قم بإجراء غسلات لمدة 3-10 دقائق باستخدام PBS.
- قطع الدماغ في أقسام 50 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم (انظر جدول المواد).
- قم بتركيب الأقسام في شرائح باستخدام وسائط تركيب ثابتة مع DAPI لتلطيخ النوى وتغطية الشرائح.
- بعد التجفيف ، راقب الأقسام تحت المجهر البؤري وتحقق من موقع القنية المزروعة والتعبير عن Ch2R المنصهر مع أي بروتين فلورسنت.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مهمة الوصول إلى الفهم هي نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة التشكيل والتعلم والأداء والحركية لحركة المهارات الدقيقة تحت التلاعب التجريبي المختلف. تتعلم الفئران تنفيذ المهمة في غضون يومين وتحقيق دقة تزيد عن 55٪ للوصول إلى الهضبة بعد 5 أيام من التدريب (الشكل 2A ، B). وعلى غرار ما تم الإبلاغ عنه سابقا، فإن نسبة مئوية من الحيوانات لا تؤدي المهمة بشكل مناسب (29.62٪)، وينبغي استبعاد تلك الحيوانات من التحليل الإضافي30. وتشمل هذه مجموعة فرعية من الفئران غير ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن استخدام التلاعب البصري الوراثي للسكان العصبيين في النماذج السلوكية المحددة جيدا يعزز معرفتنا حول الآليات الكامنة وراء التحكم الحركي 7,23. الطرق اللاسلكية مناسبة بشكل خاص للمهام التي تتطلب اختبارات على متعددة أو حرية الحركة34,35. ومع ذلك ، مع تحسين التقنيات والأجهزة ، يجب أن يكون الخيار المفضل لأي مهمة سلوكية مقترنة بعلم البصريات الوراثي34,36.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي إفصاحات.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مشروع IA203520 التابع لبعثة الأمم المتحدة في أفغانستان. نشكر منشأة الحيوانات التابعة لمؤسسة التمويل الدولية على مساعدتها في صيانة مستعمرات الفئران والوحدة الحسابية لدعم تكنولوجيا المعلومات ، وخاصة فرانسيسكو بيريز أوجينيو.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| آلة التخدير | RWD | R583S | مبخر الأيزوفلوران |
| Anesket | PiSA | Ketamine | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090 / M | اللوح البصري المصنوع من الألومنيوم |
| الصلب عدسة الكاميرا | الكاميرا Canon | 50mmf / 1.4 عدسات التركيز اليدوي (c-mount) | |
| نظام الكاميرا | BrainVision | MiCAM02 | وحدة التحكم في الكاميرا و مزامن |
| مسحات | |||
| CS الحل | PiSA | محلول كلوريد الصوديوم 9٪ | |
| غرفة تدريب مخصصة | في المنزل | ||
| مثقاب # 105 | Dremel | 2 615 010 5AE | قاطع النقش |
| كريات الشوكولاته الخالية من الغبار | Bio-Serv | F05301 | |
| الكحول الإيثيلي | J. T. بيكر | 9000-02 | الإيثانول |
| Ultracell | 40400-8 | رمحات العين من مادة PVA الماصة | |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | |
| الشعيرات الدموية الزجاجية | Isoflurane Drumond Scientific | 3-000-203-G / X | ماصات ل NanoJect II |
| Hidrogen بيروكسيد | Farmacom | مطهر | |
| كاميرا عالية السرعة | BrainVision | MiCAM02-CMOS | كاميرات أحادية اللون عالية السرعة |
| باعث الأشعة تحت الحمراء حقنة | |||
| LED | Teleopto | TelC-c-l-d | LED قنية 250um 487nm ضوء |
| ماصة دقيقة 10 ميكرولتر | Eppendorf | Z740436 | |
| مجهر مجتذب أفقي | |||
| LSM780 | مجهر | زايس متحد البؤر | |
| ميكروتوم | |||
| جهاز استقبال وهمي | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | حاقن صغير |
| خزان الأكسجين | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2 (H134R) -mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | ناقل فيروسي لتعبير ChR-2 |
| Parafilm | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
| عازلة محلول ملحي للفوسفات | Sigma | P-4417 | أقراص عازلة ملحية للفوسفات |
| أطراف ماصة 10 ميكرولتر | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL & nbsp; حجم |
| Pisabental | PiSA | الصوديوم pentobarbital | |
| زجاج شبكي | ورقة الاكريليك | التجارية | |
| بوفيدون اليود | فارماكوم | مطهر | |
| Procin | PiSA | Xylacine | |
| Puralube | Perrigo فارما | 1228112 | زيوت تشحيم العين 15٪ زيت معدني / 85٪ فازلين |
| أداة دوارة | Kmoon | مطحنة | صغيرة قياسية |
| مشرط مشرط | |||
| شفرة | |||
| جهاز Stereotaxic | Stoelting | 51730D | جهاز رقمي |
| Super-Bond C & B | Sun Medical | Dental Cement | |
| جراحي يمكن التخلص | |||
| التحكم عن بعد Teleopto | Teleopto | ||
| Tg Drd1-Cre خط الماوس | Gensat | 036916-UCD | إدخال الجينات المعدلة وراثيا FK150Gsat |
| الأنسجة | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | وسائط تركيب Microtome | |
| Vectashield مع | مختبرات | H-1200 | وسائط التركيب |
| جهاز استقبال لاسلكي | Teleopto | TELER-1-P |
المراجع
- Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738(2018).
- Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
- MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
- Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
- Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720(2019).
- Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41(2018).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
- Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
- Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
- Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
- Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
- Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
- Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
- d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
- Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742(2011).
- vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
- Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651(2021).
- Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
- Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
- Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
- Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
- Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
- Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
- Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238(2014).
- Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
- Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834(2017).
- Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
- Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
- Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
- Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961(2016).
- Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
- Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
