يصف البروتوكول الحالي نظام "حركة الرأس السلبية" المصمم خصيصا ، والذي يعيد إنتاج التسارع الميكانيكي عند رؤوس القوارض المتولدة أثناء تشغيل جهاز المشي بسرعات معتدلة. يسمح بتشريح العوامل / العناصر الميكانيكية من الآثار المفيدة لممارسة الرياضة البدنية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطبيق حركة الرأس السلبية لتوليد تسارع محدد عند رؤوس القوارض
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من المسلم به على نطاق واسع أن التمرين فعال لمختلف الأمراض والاضطرابات الجسدية ، بما في ذلك تلك المتعلقة بضعف الدماغ. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية وراء الآثار المفيدة للتمرين غير مفهومة بشكل جيد. العديد من التدريبات البدنية ، وخاصة تلك المصنفة على أنها تمارين هوائية مثل الركض والمشي ، تنتج قوى اندفاعية في وقت ملامسة القدم للأرض. لذلك ، تم التكهن بأن التأثير الميكانيكي قد يكون متورطا في كيفية مساهمة التمرين في التوازن العضوي. لاختبار هذه الفرضية على الدماغ ، تم تطوير نظام "حركة الرأس السلبية" المصمم خصيصا (المشار إليه فيما يلي باسم PHM) والذي يمكنه توليد تسارع رأسي بمقادير وأنماط محددة ومحددة وإعادة إنتاج التحفيز الميكانيكي الذي يمكن تطبيقه على رؤوس القوارض أثناء تشغيل جهاز المشي بسرعات معتدلة ، وهو تدخل نموذجي لاختبار آثار التمرين في الحيوانات. باستخدام هذا النظام ، ثبت أن PHM يلخص النوع الفرعي لمستقبلات السيروتونين (5-هيدروكسي تريبتامين ، المشار إليه فيما يلي باسم 5-HT) من النوع الفرعي 2A (5-HT2A) في الخلايا العصبية لقشرة الفص الجبهي (PFC) للفئران. يوفر هذا العمل بروتوكولات مفصلة لتطبيق PHM وقياس التسارع الميكانيكي الناتج عند رؤوس القوارض.
المقدمة
التمرين مفيد لعلاج أو منع العديد من الاضطرابات الجسدية ، بما في ذلك أمراض نمط الحياة مثل داء السكري وارتفاع ضغط الدم الأساسي1. فيما يتعلق بهذا ، تم أيضا تجميع الأدلة فيما يتعلق بالآثار الإيجابية للتمرين على وظائف الدماغ2. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء فوائد التمرين للدماغ لا تزال غير واضحة في المقام الأول. تولد معظم الأنشطة البدنية والتدريبات تسارعا ميكانيكيا في الرأس ، على الأقل إلى حد ما. في حين يتم تنظيم الظواهر الفسيولوجية المختلفة ميكانيكيا ، فقد تم توثيق أهمية التحميل الميكانيكي ، في معظم الحالات ، في الجهاز العضلي الهيكلي3،4،5. على الرغم من أن الدماغ يتعرض أيضا لقوى ميكانيكية أثناء الأنشطة البدنية ، وخاصة ما يسمى بتمارين التأثير ، إلا أنه نادرا ما تمت دراسة التنظيم الميكانيكي لوظائف الدماغ الفسيولوجية. نظرا لأن توليد التسارع الميكانيكي في الرأس شائع نسبيا في التدريبات البدنية ، فقد تم التكهن بأن التنظيم الميكانيكي قد يكون متورطا في فوائد التمرين لوظائف الدماغ.
إشارات مستقبلات 5-HT2A ضرورية في تنظيم العواطف والسلوكيات بين الإشارات الكيميائية الحيوية المختلفة التي تعمل في الجهاز العصبي. وتشارك في العديد من الأمراض النفسية6،7،8 ، والتي ثبت أن التمارين الرياضية فعالة علاجيا. مستقبلات 5-HT2A هي نوع فرعي من مستقبلات 5-HT2 التي تنتمي إلى عائلة السيروتونين وهي أيضا عضو في عائلة مستقبلات البروتين G (GPCR) ، والتي يتم تعديل إشاراتها من خلال استيعابها ، إما تعتمد على الليجند أو مستقلة9. ارتعاش الرأس هو سلوك مميز للقوارض ، حيث تمثل الكمية (التردد) صراحة شدة إشارات مستقبلات 5-HT2A في الخلايا العصبية لقشرة الفص الجبهي (PFC)10,11. بالاستفادة من الخصوصية الصارمة لهذه الاستجابة المهلوسة ل 5-HT (استجابة ارتعاش الرأس ، المشار إليها فيما يلي باسم HTR ؛ انظر الفيلم التكميلي 1) ، تم اختبار الفرضية المذكورة أعلاه حول الآثار الميكانيكية في تأثيرات التمرين على وظائف الدماغ. وهكذا ، قمنا بتحليل ومقارنة HTR للفئران التي تعرضت إما للتمرين القسري (تشغيل جهاز المشي) أو التدخل الميكانيكي الذي يحاكي التمرين (PHM).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة للمركز الوطني لإعادة تأهيل الأشخاص ذوي الإعاقة. تم استخدام ذكور فئران Sprague-Dawley البالغة من العمر 8-9 أسابيع لقياس التسارع في الرأس أثناء الجري على جهاز المشي و PHM. تم استخدام ذكور C57BL / 6 الفئران البالغة من العمر 9-10 أسابيع لاختبارات السلوك والتحليلات النسيجية ل PFC. تم الحصول على الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
1. قياس مقادير التسارع على طول محاور x و y و z أثناء تشغيل جهاز المشي
- تخدير الفئران مع استنشاق 1.5 ٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: تم استخدام الفئران بعد 1 أسبوع على الأقل من التأقلم مع بيئة المختبر. تأكد من أن الجرذ لا يستجيب لقرصة إصبع القدم الخلفي. - ثبت مقياس التسارع (انظر جدول المواد) أعلى رأس الجرذ باستخدام الشريط الجراحي.
- بعد الشفاء التام من التخدير ، ضع الجرذ في جهاز المشي (انظر جدول المواد) ، واضبط جهاز المشي بسرعة معتدلة (20 م / دقيقة)12 (الشكل 1 أ).
ملاحظة: استغرق الأمر 20 دقيقة على الأقل لتأكيد الشفاء التام للفأر من التخدير بعد إنهاء استنشاق الأيزوفلوران وبدء تجربة جهاز المشي. تأكد من أن الجرذ يستجيب لقرص إصبع القدم الخلفي ، وأن يكون قادرا على المشي أو الجري دون ترنح واضح. - قم بقياس حجم التسارع الرأسي أثناء تشغيل جهاز المشي باستخدام البرنامج التطبيقي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: استخرج 10 موجات تسلسلية واحسب بشكل فردي متوسط التسارع على طول المحاور ثلاثية الأبعاد (محاور x و y و z ، الشكل 1B). تم تحديد مقادير الذروة من خلال تحديد الموجات المتزامنة (~ تردد 2 هرتز) على أنها تسارع ناتج عن تشغيل جهاز المشي (الشكل 1C). تم استخدام الفئران في هذه الدراسة لأن حجم جسمها الأكبر كان مناسبا لقياس التسارع الرأسي في الرأس بشكل موثوق ، وهو ما لم يكن ممكنا في الفئران. ومع ذلك ، تم استخدام الفئران لمزيد من الدراسات بسبب السهولة والموثوقية فيما يتعلق بالتحليل الكمي لاستجابة ارتعاش الرأس.
2. تعديل نظام PHM وتطبيق PHM على الفئران
- اضبط مسبقا سعة تذبذب المنصة وسرعة دوران الكاميرا على شكل مروحة في نظام PHM (الشكل 1D) بحيث يتطابق حجم وتكرار التسارع الرأسي مع القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4.
ملاحظة: يتكون نظام PHM من إطار معدني ومنصة خشبية. يمكن تغيير سرعة المحرك والتحكم فيها عن طريق ضبط القرص المتصل بالسائق المدمج (انظر جدول المواد). مقياس الاتصال الهاتفي 600 يتوافق مع 2 هرتز ، الشكل 1E. تحتوي الكاميرا على شكل مروحة على أربع شفرات بارتفاعات خطوة 5 مم (الشكل 1F). - تخدير الفأر عن طريق استنشاق 1.2٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: تم استخدام الفئران بعد 1 أسبوع على الأقل من التأقلم مع بيئات المختبر. تأكد من أن الماوس لا يستجيب لقرص إصبع القدم الخلفي. - ضع الماوس في وضع الانبطاح مع وجود الرأس وبقية الجسم على المنصات المتذبذبة والثابتة ، على التوالي.
ملاحظة: حافظ على تخدير الماوس (1.2٪ إيزوفلوران). - قم بتشغيل المحرك لتذبذب المنصة عموديا ، وقم بتطبيق PHM على الماوس.
ملاحظة: تم ضبط سرعة المحرك لتذبذب المنصة عند 2 هرتز (انظر الخطوة 2.1). تخدير ووضع ماوس التحكم على منصة PHM بالمثل ، ولكن اترك المحرك مغلقا.
3. تشغيل الماوس على جهاز المشي
- ضع الماوس على جهاز المشي واضبط جهاز المشي بسرعة معتدلة (10 م / دقيقة)13.
4. القياس الكمي لاستجابة ارتعاش رأس الفأر (HTR)
- قم بإعداد كاميرا الفيديو (معدل الإطارات: 24 إطارا في الثانية) لتسجيل المساحة بأكملها في العلبة البلاستيكية الشفافة.
ملاحظة: تم استخدام القفص البلاستيكي للحفاظ على الماوس في مجال تسجيل الفيديو. - تطبيق 5-هيدروكسيتريبتوفان (5-HTP) (100 ملغ/كغ) (انظر جدول المواد)، مقدمة ل 5-HT، إلى الماوس.
- ضع الماوس في القفص الشفاف وابدأ التسجيل لمدة 30 دقيقة.
- راجع الفيديو المسجل (سرعة 1/2x أو 1/3x) ، مع حساب ارتعاش الرأس يدويا.
ملاحظة: لم يعمى المحللون عن الإجراء التجريبي. تم احتساب الحركة السريعة المميزة "الشبيهة بالتشنجات اللاإرادية" للفأر (انظر الفيلم التكميلي 1) على أنها ارتعاش في الرأس ، والذي نادرا ما يحدث في بيئة التكاثر العادية.
5. التحليل المناعي الكيميائي للفأر PFC
- بمجرد الانتهاء من اختبارات HTR ، قم بتخدير الفأر عن طريق إعطاء خليط من الميدازولام (4.0 مجم / كجم) ، وبوتورفانول (4.0 مجم / كجم) ، وميديتوميدين (0.3 مجم / كجم) ، وفيوز مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني ، ثم استأصل الدماغ بعد التقارير المنشورة مسبقا14،15.
- بعد إصلاح العقول في 4٪ PFA في PBS لمدة 24 ساعة إضافية عند 4 درجات مئوية ، وتخزينها في 30٪ سكروز / PBS حتى تغرق. قم بتجميد مركب درجة حرارة القطع المثلى الثابت (مركب OCT ، انظر جدول المواد).
- استرجع المقاطع البردية لدماغ الفأر من صندوق الشرائح (انظر جدول المواد). اترك الشرائح على مناديل نظيفة في درجة حرارة الغرفة حتى تجف العينات تماما.
ملاحظة: تم تحضير مقاطع سهمية بسمك عشرين ميكرومتر (جانبي + 0.5-1.5 مم) من عينات مجمدة مدمجة في مركب OCT باستخدام cryostat (انظر جدول المواد). - استخدم قلم مانع السوائل (انظر جدول المواد) لرسم دائرة حول الأنسجة المقطعية بالتبريد على الشريحة لحصر منطقة انتشار المحلول (0.1٪ Tween-20 في محلول ملحي مخزن من Tris (TBS-T).
- ضع مناديل مبللة في قاع صينية تحمل الشرائح لخلق بيئة رطبة.
- بعد النفاذية باستخدام TBS-T ، قم بكتلتها بمصل حمار 4٪ (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- شطف الشرائح مرة واحدة عن طريق الانغماس لمدة 5 دقائق في TBS-T.
- ضع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف بشكل مناسب ومزيج DAPI (انظر جدول المواد) على كل شريحة ، وقم بتغطية الدرج لتجنب تجفيف العينة ، واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- شطف مع TBS-T ثلاث مرات (5 دقائق حضانة لكل منهما).
- ضع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي الفلوري المطابق للأنواع المخفف بشكل مناسب (مترافق مع Alexa Fluor 488 أو 568 أو 645) (انظر جدول المواد) على كل شريحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف مع TBS-T ثلاث مرات (5 دقائق حضانة لكل منهما).
- قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط التثبيت (انظر جدول المواد). قم بتغطية الشرائح بأغطية أغطية.
- عرض العينة تحت المجهر مضان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كان حجم الذروة للتسارع الرأسي عند رؤوس الفئران أثناء تشغيل جهاز المشي بسرعة معتدلة (20 م / دقيقة) حوالي 1.0 × جم (الشكل 1C). تم إنشاء نظام PHM (الشكل 1D) لتوليد قمم تسارع رأسية تبلغ 1.0 × جم عند رؤوس القوارض.
أدى تطبيق PHM (2 هرتز ، 30 دقيقة / يوم لمدة 7 أيام) على الفئران إلى تخفيف HTR بشكل كبير مقارنة بالفئران الضابطة (التخدير اليومي بدون PHM لمدة 30 دقيقة / يوم لمدة 7 أيام) (الشكل 2). ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
باستخدام نظام تطبيق PHM المطور ، أظهرنا أن إشارات 5-HT في الخلايا العصبية PFC الخاصة بهم منظمة ميكانيكيا. بسبب تعقيد آثار التمرين ، كان من الصعب تشريح عواقب التمرين بدقة في سياق تعزيز الصحة. ينصب التركيز على الجوانب الميكانيكية لمنع مشاركة أو مساهمة الأحداث الأيضية التي قد تحدث مع أو بعد ممارسة الأنشطة ، مثل استهلاك الطاقة. من المتوقع أن تكون الطريقة الموصوفة هنا مفيدة على نطاق أوسع في الأبحاث الطبية الحيوية التي تستكشف الآليات الكامنة وراء تأثيرات التمرين على وظائف الدماغ.
يتطلب النظام الحالي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصلحة متنافسة مرتبطة بالعمل الموصوف في هذه الورقة.
شكر وتقدير
وحظي هذا العمل جزئيا بدعم من صندوق البحوث الداخلية التابع لوزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية اليابانية؛ منح معونة للبحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); برنامج مدعوم من MEXT لمؤسسة البحوث الاستراتيجية في الجامعات الخاصة ، 2015-2019 من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا اليابانية (S1511017) ؛ مؤسسة نايتو للعلوم والهندسة. تلقى هذا البحث أيضا تمويلا من التحالف من أجل أبحاث وتدريب إعادة التأهيل التجديدي (AR3T) ، والذي يدعمه معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) ، والمعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية (NIBIB) التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة P2CHD086843.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5-هيدروكسي تريبتوفان (5-HTP) | سيجما ألدريتش | H9772 | السيروتونين (5-HT) سلائف |
| سائق محرك بدون فرش | محرك شرقي | BMUD30-A2 | مبدل السرعة مدمج سائق |
| محرك C57BL / 6 فئران | شركة الخميرة الشرقية | C57BL / 6J | الفئران المستخدمة في هذه الدراسة |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome لقطع العينات |
| المجمدةمحرك | DC Motor Oriental | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey مضاد للماعز Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | جسم مضاد ثانوي يستخدم في تلطيخ الكيمياء المناعية |
| الحمار المضاد للفأر Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | الجسم المضاد الثانوي المستخدم في التلوين الكيميائي المناعي |
| الحمار المضاد للأرانب Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | الجسم المضاد الثانوي المستخدم في تلطيخ الكيمياء المناعية |
| مصل الحمار | Sigma-Aldrich | S30-100ML | الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في التلوين الكيميائي المناعي |
| المجهر المضان | Keyence | BZ-9000 | المجهر الفلوري |
| الماعز متعدد النسيلة المضاد ل 5-HT2A< / sub> | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-15073 | الجسم المضاد الأساسي المستخدم في التلوين الكيميائي المناعي |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | التخدير الاستنشاقي |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | قطعة قماش ورقية لتنظيف الأسطح والأجزاء والأدوات في المختبر |
| مانع السوائل | Daido Sangyo | PAP-S | Marker المستخدم في صنع سطح الشريحة طارد للماء |
| ماوس أحادي النسيلة مضاد للنيو (استنساخ A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | الجسم المضاد الأساسي المستخدم في تلطيخ الأنسجة الكيميائية المناعية |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | مقياس التسارع لقياس التسارع |
| مركب OCT | Sakura Finetek | 45833 | عامل تضمين لإعداد أقسام الأنسجة |
| المجمدة إطالة الذهب المضاد للتلاشي حامل | Invitrogen | P36934 | التركيب لمنع يتلاشى الدقيق |
| الأرنب متعدد النسيلة المضاد ل c-Fos | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-52 | الجسم المضاد الأساسي المستخدم في تلطيخ الكيمياء |
| المناعية صندوق الشريحة | AS ONE | 03-448-1 | صندوق غير شفاف لتخزين الشرائح |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N / A | برنامج تطبيق يستخدم لتحليل التسارع |
| فئران Sprague-Dawley | Japan SLC | Slc: SD | Rats المستخدمة في هذه الدراسة |
| آلة المشي | Muromachi | MK-680 | المستخدم في تجارب الجري القسري للفئران والفئران |
المراجع
- Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
- Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).
- Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
- Sakitani, N., et al. Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes. Journal of Visualized Experiments. (151), e59475(2019).
- Miyazaki, T., et al. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Scientific Advances. 5 (9), (2019).
- Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).
- Canli, T., Lesch, K. -P. Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).
- Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders. Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).
- Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).
- Canal, C. E., Morgan, D. Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model. Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).
- Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement. Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).
- Kim, S. -E., et al. Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus. Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).
- Li, H., et al. Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress. Brain Research. 1531, 1-8 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Ryu, Y., et al. Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons. iScience. 23 (2), 100874(2020).
- Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice. FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).
- Wang, J., et al. Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes. Experimental Neurology. 330, 113325(2020).
- Pacák, K. Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Physiological Research. 49, 11-17 (2000).
- Okamoto, M., Soya, H. Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis. The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
