يعمل البروتوكول الحالي على تحسين طرق التروية / إزالة الخلايا في الكبد في الموقع وطرق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لإنشاء منصة موثوقة لتصور ديناميكيات إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) أثناء التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير 3D لمصفوفة الكبد خارج الخلية في نموذج فأر لالتهاب الكبد الدهني غير الكحولي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) هو أكثر أمراض الكبد المزمنة شيوعا في الولايات المتحدة ، حيث يصيب أكثر من 70 مليون أمريكي. يمكن أن يتطور التهاب الكبد الدهني غير الكحولي إلى التليف وفي النهاية إلى تليف الكبد ، وهو عامل خطر كبير لسرطان الخلايا الكبدية. توفر المصفوفة خارج الخلية (ECM) الدعم الهيكلي وتحافظ على توازن الكبد عبر إشارات الخلايا الأمومية. ينتج تليف الكبد عن خلل في عملية إعادة تشكيل ECM الديناميكية ويتميز بالتراكم المفرط للعناصر الهيكلية والتغيرات المرتبطة بها في الجليكوزامينوجليكان. يطلق على نمط التليف النموذجي ل NASH اسم "سلك الدجاج" ، والذي يتكون عادة من تليف المنطقة 3 حول الجيوب الأنفية / حول الخلايا ، بناء على الميزات التي لاحظتها صبغة ماسون ثلاثية الألوان وبقع بيكروسيروس الحمراء. ومع ذلك ، فإن تقنيات التصوير التقليدية القائمة على شرائح الأنسجة الرقيقة ثنائية الأبعاد (2D) لا يمكنها إظهار التغييرات الهيكلية التفصيلية ثلاثية الأبعاد (3D) ECM ، مما يحد من فهم إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد.
قام العمل الحالي بتحسين بروتوكول سريع وفعال لتصوير بنية ECM الأصلية في الكبد عن طريق إزالة الخلايا لمواجهة التحديات المذكورة أعلاه. تم تغذية الفئران إما بحمية تشاو أو الوجبات السريعة لمدة 14 أسبوعا. تم إجراء إزالة الخلايا بعد نضح الوريد البابي في الموقع ، وتم تطبيق تقنيات الفحص المجهري ثنائي الفوتون على الصورة وتحليل التغيرات في ECM الأصلي. تم إعادة تشكيل وتحليل صور 3D للكبد الطبيعي و NASH. قدم إجراء إزالة التروية الخلوية في الموقع وتحليل السقالة بواسطة المجهر ثنائي الفوتون منصة عملية وموثوقة لتصور إعادة تشكيل ECM الديناميكي في الكبد.
المقدمة
مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) هو أكثر أمراض الكبد شيوعا ، حيث يصيب 20٪ -25٪ من السكان البالغين. يتقدم 25٪ من مرضى NAFLD إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، حيث يزداد خطر الإصابة بتليف الكبد وفشل الكبدوسرطان الخلايا الكبدية 1. في السنوات العشرين المقبلة ، تشير التقديرات إلى أن NASH ستمثل 2 مليون حالة وفاة مرتبطة بالكبد في الولايات المتحدة2. نظرا لعدم وجود علاجات معتمدة ، هناك حاجة ملحة لفك رموز الآليات التي تسبب تليف الكبد لدى مرضى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي وتطوير علاج مستهدف3.
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي بيئة دقيقة ديناميكية ومعقدة تمارس اتصالا ث....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للإجراءات التجريبية المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUCs) بجامعة ستانفورد ومستشفى شؤون المحاربين القدامى في بالو ألتو. تم تغذية ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 6-8 أسابيع إما بالطعام أو نظام غذائي للوجبات السريعة مكمل ب 4.2٪ شراب الذرة عالي الفركتوز (انظر جدول المواد) في مياه الشرب لمدة 14 أسبوعا5. تم الاحتفاظ بالفئران في أقفاص قياسية في دورة مظلمة / فاتحة مدتها 12 ساعة.
1. التحضير الجراحي وإجراءات نضح الكبد
- وزن الماوس قبل العملية.
- تخدير الفأر عن طريق إعطاء الكيتامين (90 ملغم / كغم) والزيلازين....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم الكشف عن ألياف الكولاجين مع الجيل التوافقي الثاني والمجهر ثنائي الفوتون. الإشارة هي من هياكل الكولاجين الثلاثي الحلزوني والأصلي القابل للكسر. لم يتم استخدام أجسام مضادة محددة لتحليل الأنواع الفرعية للكولاجين. ومع ذلك ، يمكن إضافة هذا إلى تقنية التصوير.
عندما تتم دراسة أنسجة الكبد دون إزالة الخلايا ، يكون من الصعب الحصول على صور عالية الدقة لشبكة الكولاجين (الشكل 5 أ). في ECM منزوع الخلايا ، تظهر ألياف الكولاجين (الخضراء) متوازية أو متشابكة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوضح البروتوكول الحالي أن إزالة الخلايا من خلال معدل تدفق منخفض DOC في التروية في الموقع تحافظ على هياكل الكولاجين الليفي الثلاثي الحلزوني والأصلي القابلة للكسر ، مما يوفر منصة موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لالتقاط إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد NASH. على الرغم من إجراء إزالة الخلايا في الكبد الطبيعي والليفي قبل تحديد مكونات ECM أو توليد سقالات بيولوجية لزراعة الخلايا ، إلا أن ديناميكيات إعادة تشكيل ECM في تليف الكبد لم تتم دراستها جيدا8،9،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه المقالة.
شكر وتقدير
نشكر حديقة Hyesuk على المساعدة الفنية. تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 2DK083283 ، إلى NJT) ، والمعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1R01AG060726 ، إلى NJT). نحن نقدر بامتنان جون مولهولاند وكيتي لي من مرفق تصوير علوم الخلية في مركز بيكمان للمساعدة الفنية في التصوير المجهري ثنائي الفوتون.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4-0 MONOCRYL غير مصبوغ 1 × 18 "P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 خياطة | فيشر علمي | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| حقن AnaSed (زيلازين) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | هذا الدواء للاستخدام من قبل أو بناء على طلب طبيب بيطري مرخص. |
| قسطرة BD INSYTE AUTOGUARD I.V. مع BC TECHNOLOGY | BD | ||
| Chow DIET | Envigo | # 2918 | Control Diet. تركيبة ثابتة ، نظام غذائي غير قابل للتعقيم مصنوع من مكونات عالية الجودة ومصمم لدعم الحمل والرضاعة ونمو القوارض. |
| نظام غذائي للوجبات السريعة (AIN76A Western Diet) | اختبار | النظام الغذائي | 1810060 https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin و Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical | Fisher Scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| حقن هيدروكلوريد الكيتامين | فيدكو | NDC 50989-996-06 - 10 مل - قارورة. | تمت دراسة KetaVed سريريا في الرئيسيات دون البشرية بالإضافة إلى تلك الأنواع المدرجة تحت الإدارة والجرعة. |
| موصل Leica SP5 Confocal المستقيم متعدد الفوتون | Leica | SP5 | |
| Luer (محبس ثلاثي الاتجاهات مع SPIN-LOCK & reg;) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences، Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| قضيب رايون مائل | بيوريتان | 25-806 1PR | |
| شراب ديوكسيكولات الصوديوم | سيجمادريتش | D6750-100G | |
| www.target.com | 24 أونصة سائلة | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 | |
| مضخة تمعجية متغيرة السرعة | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD مضاد للتلاشي تصاعد متوسط | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
المراجع
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incid....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
