تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان ومشتقاتها العصبية والدبقية

Summary

تشير هذه الدراسة إلى نهج جديد لقياس المعلمات الوظيفية المتعددة للميتوكوندريا استنادا إلى قياس التدفق الخلوي والتلطيخ المزدوج باستخدام اثنين من المراسلين الفلوريين أو الأجسام المضادة للكشف عن التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتكوين سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، والحمض النووي للميتوكوندريا.

Abstract

الميتوكوندريا مهمة في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض التنكسية العصبية. غالبا ما تكون التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، وإنتاج الميتوكوندريا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وعدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) من سمات هذه العمليات. يفصل هذا التقرير نهجا جديدا قائما على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs) والخلايا العصبية والدبقية المشتقة من iPSC. تستخدم هذه الاستراتيجية القائمة على التدفق الخلايا الحية لقياس حجم الميتوكوندريا ومستويات MMP و ROS ، بالإضافة إلى الخلايا الثابتة لتقدير مكونات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا (MRC) والبروتينات المرتبطة ب mtDNA مثل عامل نسخ الميتوكوندريا A (TFAM).

من خلال المشاركة في التلطيخ مع مراسلي الفلورسنت ، بما في ذلك MitoTracker Green (MTG) ، و tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ، و MitoSox Red ، يمكن قياس التغيرات في حجم الميتوكوندريا و MMP و ROS الميتوكوندريا كميا والمتعلقة بمحتوى الميتوكوندريا. يسمح التلطيخ المزدوج بالأجسام المضادة ضد الوحدات الفرعية المعقدة MRC و translocase لغشاء الميتوكوندريا الخارجي 20 (TOMM20) بتقييم تعبير الوحدة الفرعية MRC. نظرا لأن كمية TFAM تتناسب مع عدد نسخ mtDNA ، فإن قياس TFAM لكل TOMM20 يعطي قياسا غير مباشر ل mtDNA لكل حجم الميتوكوندريا. يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في غضون 2-3 ساعات. الأهم من ذلك ، تسمح هذه البروتوكولات بقياس معلمات الميتوكوندريا ، سواء على المستوى الكلي أو المستوى المحدد لكل حجم الميتوكوندريا ، باستخدام قياس التدفق الخلوي.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات أساسية موجودة في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا. الميتوكوندريا هي المسؤولة عن إمدادات الطاقة عن طريق إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية وتعمل كوسطاء التمثيل الغذائي للتخليق الحيوي والتمثيل الغذائي. تشارك الميتوكوندريا بعمق في العديد من العمليات الخلوية المهمة الأخرى ، مثل توليد ROS ، وموت الخلايا ، وتنظيم Ca^{2 +} داخل الخلايا. ارتبط خلل الميتوكوندريا بالعديد من الأمراض العصبية التنكسية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، ومرض الزهايمر (AD) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، وترنح فريدريش (FRDA) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS)¹. ويعتقد أيضا أن زيادة الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وتشوه mtDNA تساهم....

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول التكميلي S1 للاطلاع على وصفات جميع الوسائط والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تمايز iPSCs البشرية إلى NCSs ، والخلايا العصبية الدوبامين (DA) ، والخلايا النجمية

1. إعداد لوحات مغلفة مصفوفة.
   1. قم بإذابة قارورة من 5 مل من المصفوفة على الجليد بين عشية وضحاها. قم بتخفيف 1 مل من المصفوفة مع 99 مل من النسر المتوسط المعدل من دولبيكو المتقدم البارد / F-12 من هام (DMEM / F12 المتقدم) (تركيز نهائي بنسبة 1٪). اصنع 1 مل من الأليكوتات وخزنها عند -20 درجة مئوية.
   2. قم بإذابة محلول المصفوفة عند 4 درجات مئوية (اجعله باردا) وقم بتغطية 6 آبار (1 مل لكل....

Results

يوضح الشكل 3 وصفا تخطيطيا لطريقة التمايز واستراتيجيات التدفق الخلوي. يتم تمييز iPSCs البشرية إلى وريدات عصبية ثم يتم رفعها إلى ثقافة التعليق للتمايز في المجالات العصبية. يتم تمييز المجالات العصبية بشكل أكبر ونضجها إلى خلايا عصبية DA. يتم فصل الكرات العصبية إلى خلايا مفردة لتوليد الخلايا النجمية الدبقية ، ويتم طلاؤها في طبقات أحادية كNSCs ، ثم يتم تمييزها إلى خلايا نجمية. يوفر هذا البروتوكول الاستراتيجيات اللازمة للحصول على العينات وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي لقياس MMP وحجم الميتوكوند.......

Discussion

فيما يلي بروتوكولات لتوليد الخلايا العصبية والخلايا النجمية المشتقة من iPSC وتقييم جوانب متعددة من وظيفة الميتوكوندريا باستخدام قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه البروتوكولات بالتحويل الفعال ل iPSCs البشرية إلى كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية الدبقية والتوصيف التفصيلي لوظيفة الميتوكوندريا ، معظمها في الخلايا الحية. توفر البروتوكولات أيضا استراتيجية قائمة على قياس التدفق الخلوي المشترك للحصول على وظائف الميتوكوندريا المتعددة وتحليلها ، بما في ذلك مستويات ROS للحجم و MMP والميتوكوندريا في الخلايا الحية ومجمعات MRC و TFAM.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857 ، RRID: AB_445175	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد SSEA4	Abcam	ab16287 ، RRID: AB_778073	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للفأر IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11005) كجسم مضاد ثانوي.
anti-Sox2	Abcam	ab97959 ، RRID: AB_2341193	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
anti-Pax6	Abcam	ab5790 ، RRID: AB_305110	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
المضادة لنستين	سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية	sc-23927 ، RRID: AB_627994	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدام ك 1:50 ، 20 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للفأر IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11005) كجسم مضاد ثانوي.
المضادة ل GFAP	Abcam	ab4674 ، RRID: AB_304558	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & mu ؛ L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.   استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للدجاج IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11042) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد S100 وبيتا ؛   مقترن ب Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442 ، RRID: AB_2722596	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 400 ، 2.5 & mu ؛ L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.
المضادة TH	Abcam	ab75875 ، RRID: AB_1310786	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد Tuj 1	Abcam	ab78078 ، RRID: AB_2256751	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 1000 ، 1 & mu ؛ L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للفأر IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11005) كجسم مضاد ثانوي.
المضادة للتشابك	Abcam	ab32127 ، RRID: AB_2286949	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد ل PSD-95	Abcam	ab2723 ، RRID: AB_303248	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.   استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للدجاج IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11042) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد TFAM مقترن بالجسم المضاد الأساسي Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	؛ استخدم ك 1: 400 ، 2.5 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام الماوس أحادي النسيلة IgG2b  Alexa Fluor® 488 كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
مضاد TOMM20 مترافق مع Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat # sc-17764 RRID: AB_628381	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 400 ، 2.5 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام الماوس أحادي النسيلة IgG2a  Alexa Fluor® 488 كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
المضادة NDUFB10	Abcam	ab196019	الجسم المضاد الأساسي; استخدام ك 1: 1000, 1 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للأرانب كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
المضادة ل SDHA	Abcam	ab137040	الجسم المضاد الأساسي. استخدم ك 1: 1000 ، 1 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.   استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للأرانب كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
المضادة ل COX IV	Abcam	ab14744 ، RRID: AB_301443	الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 1000 ، 1 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. الاستخدام  أليكسا فلور & ريج; 488 الماعز المضادة للفأر IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11001) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للماوس كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
Activin A	PeproTech	120-14E	مكون متوسط تمايز الخلايا النجمية
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	الوسط القاعدي لثقافة الخلايا النجمية
AGM SingleQuots Supplement	Pack Lonza	CC-4123	مكمل لثقافة الخلايا النجمية
المضاد الحيوي المضاد للفطريات	الحرارية فيشر العلمي	15240062	مكون CDM
متقدم DMEM / F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	وسيط قاعدي لألبومين مصل Geltrex
البقري المخفف	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	عامل حجب لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في فحوصات التلوين المناعي ومكون CDM
BDNF	PeproTech	450-02	DA الخلايا العصبية المكون المتوسط
B-27	Supplement Thermo Fisher Scientific	17504044	المكون المتوسط لتمايز الخلايا النجمية
BD Accuri C6 Plus مقياس التدفق	BD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية
تركيز الدهون	كيميائيا Thermo Fisher Scientific	11905031	مكون CDM
كاشف	17104019	العلمي	للتفكك اللطيف ل iPSCs البشرية
CCD مجهر كاميرا Leica DFC3000 G	Leica Microsystems ، ألمانيا
أطباق الثقافة غير المعالجة Corning	Sigma-Aldrich	CLS430589	ثقافة التعليق
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	تستخدم لمجموعة متنوعة من غسيل ثقافة الخلايا
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10565018	تمايز الخلايا النجمية القاعدية المتوسطة
EDTA	Thermo Fisher كاشف 15575020 العلمي		للتفكك اللطيف من iPSCs البشرية
أساسي 8 متوسطة	حرارية فيشر علمية	A1516901	وسيط قاعدي لثقافة iPSC
أساسي 8 مكمل غذائي (50X)	A1517101	علمي Thermo Fisher	لثقافة iPSC
EGF بروتين بشري مؤتلف	ملحق PHG0314 علمي		لثقافة NSC
FGF-basic (AA 10 – 155) بروتين بشري مؤتلف	Thermo Fisher	علمي PHG0024	لثقافة NSC
مصل الأبقار الجنيني	Sigma-Aldrich	12103C	مكون متوسط
FGF-basic	PeproTech	100-18B	متوسط تمايز الخلايا النجمية
FCCP	Abcam	ab120081	يزيل إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتلوين
TMREنظام شفط السوائل التحكم BVC	Vacuubrand ، ألمانيا
الفورمالديهايد (PFA) 16٪	Thermo Fisher Scientific	28908	تثبيت الخلية
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	يستخدم لربط وصيانة iPSCs البشرية
GlutaMAX	Supplement Thermo Fisher Scientific	35050061	لثقافة NSC
GDNF	Peprotech	450-10	DA الخلايا العصبية المكون المتوسط
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	تستخدم لمنع المخزن المؤقت
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 البشري	Sigma-Aldrich	SRP3055	المكون المتوسط لتمايز الخلايا النجمية
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	وصمة عار النوى للصورة متحدة البؤر
Heracell 150i حاضنات CO2	فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	الوسط القاعدي ل CDM
الأنسولين	Roche	1376497	مكون CDM
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	مكون متوسط الحث العصبي
عامل النمو الشبيه بالأنسولين - I الإنسان	سيجما ألدريتش	I3769	تمايز الخلايا النجمية المكون المتوسط
KnockOut DMEM / F-12 متوسط	Thermo Fisher Scientific	12660012	الوسط القاعدي لثقافة
NSC Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
Leica TCS SP8 STED مجهر متحد البؤر	Leica Microsystems ، ألمانيا
مونوثيوغليسرين	سيجما ألدريتش	M6145	CDM مكون
MitoTracker الأخضر FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	يستخدم لمؤشر حجم الميتوكوندريا
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	يستخدم لمؤشر ROS للميتوكوندريا
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural المكون المتوسط التعريفي
N-2 الملحق	Thermo Fisher Scientific	17502048	تمايز الخلايا النجمية المكون المتوسط
مصل الماعز	العادي Thermo Fisher	Scientific PCN5000	يستخدم لمنع الهزازات المدارية العازلة
- SSM1	Stuart Equipment ،
	Sigma-Aldrich	P4957	يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	يعزز تمايز الخلايا العصبية DA
إطالة الذهب المضاد للتلاشي	Thermo Fisher Scientific	P36930	تركيب الغطاء للصورة
متحد البؤرPBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	تستخدم لمجموعة متنوعة من الغسيل
المؤتلف للإنسان / الفأر FGF-8b بروتين	R & D Systems	423-F8-025 / CF	يعزز تمايز الخلايا العصبية
DA SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	الحث العصبي المكون
المتوسط StemPro الملحق العصبي	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	لثقافة NSCs
TrypLE Express إنزيم	Thermo Fisher Scientific	12604013	كاشف تفكك الخلية
Transferrin	Roche	652202	مكون CDM
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	يستخدم لنفاذية الخلايا في فحوصات التلوين المناعي
TMRE	Abcam	ab113852	يستخدم في تلطيخ غشاء الميتوكوندريا
المائي حمام مائي أكاديمية Jb Basic Jba5 JBA5 أدوات منح	المنح ، الولايات المتحدة الأمريكية