Method Article

تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان ومشتقاتها العصبية والدبقية

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير هذه الدراسة إلى نهج جديد لقياس المعلمات الوظيفية المتعددة للميتوكوندريا استنادا إلى قياس التدفق الخلوي والتلطيخ المزدوج باستخدام اثنين من المراسلين الفلوريين أو الأجسام المضادة للكشف عن التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتكوين سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، والحمض النووي للميتوكوندريا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا مهمة في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض التنكسية العصبية. غالبا ما تكون التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، وإنتاج الميتوكوندريا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وعدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) من سمات هذه العمليات. يفصل هذا التقرير نهجا جديدا قائما على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs) والخلايا العصبية والدبقية المشتقة من iPSC. تستخدم هذه الاستراتيجية القائمة على التدفق الخلايا الحية لقياس حجم الميتوكوندريا ومستويات MMP و ROS ، بالإضافة إلى الخلايا الثابتة لتقدير مكونات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا (MRC) والبروتينات المرتبطة ب mtDNA مثل عامل نسخ الميتوكوندريا A (TFAM).

من خلال المشاركة في التلطيخ مع مراسلي الفلورسنت ، بما في ذلك MitoTracker Green (MTG) ، و tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ، و MitoSox Red ، يمكن قياس التغيرات في حجم الميتوكوندريا و MMP و ROS الميتوكوندريا كميا والمتعلقة بمحتوى الميتوكوندريا. يسمح التلطيخ المزدوج بالأجسام المضادة ضد الوحدات الفرعية المعقدة MRC و translocase لغشاء الميتوكوندريا الخارجي 20 (TOMM20) بتقييم تعبير الوحدة الفرعية MRC. نظرا لأن كمية TFAM تتناسب مع عدد نسخ mtDNA ، فإن قياس TFAM لكل TOMM20 يعطي قياسا غير مباشر ل mtDNA لكل حجم الميتوكوندريا. يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في غضون 2-3 ساعات. الأهم من ذلك ، تسمح هذه البروتوكولات بقياس معلمات الميتوكوندريا ، سواء على المستوى الكلي أو المستوى المحدد لكل حجم الميتوكوندريا ، باستخدام قياس التدفق الخلوي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي عضيات أساسية موجودة في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا. الميتوكوندريا هي المسؤولة عن إمدادات الطاقة عن طريق إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية وتعمل كوسطاء التمثيل الغذائي للتخليق الحيوي والتمثيل الغذائي. تشارك الميتوكوندريا بعمق في العديد من العمليات الخلوية المهمة الأخرى ، مثل توليد ROS ، وموت الخلايا ، وتنظيم Ca2 + داخل الخلايا. ارتبط خلل الميتوكوندريا بالعديد من الأمراض العصبية التنكسية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، ومرض الزهايمر (AD) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، وترنح فريدريش (FRDA) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS)1. ويعتقد أيضا أن زيادة الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وتشوه mtDNA تساهم في شيخوخة الإنسان 2,3.

تحدث أنواع مختلفة من خلل الميتوكوندريا في الأمراض العصبية التنكسية ، والتغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإزالة الاستقطاب MMP ، وإنتاج ROS ، والتغيرات في عدد نسخ mtDNA شائعة4،5،6،7. لذلك ، فإن القدرة على قياس هذه الوظائف وغيرها من وظائف الميتوكوندريا لها أهمية كبيرة عند دراسة آليات المرض واختبار العوامل العلاجية المحتملة. علاوة على ذلك ، نظرا لعدم وجود نماذج حيوانية تكرر بأمانة الأمراض العصبية التنكسية البشرية ، فإن إنشاء أنظمة نموذجية مناسبة في المختبر تلخص المرض البشري في خلايا الدماغ هو خطوة مهمة نحو فهم أكبر لهذه الأمراض وتطوير علاجات جديدة2،3،8،9.

يمكن استخدام iPSCs البشرية لتوليد خلايا دماغية مختلفة ، بما في ذلك الخلايا العصبية وغير العصبية (أي الخلايا الدبقية) ، وقد تم العثور على تلف الميتوكوندريا المرتبط بالأمراض العصبية التنكسية في كلا النوعينمن الخلايا 3،10،11،12،13. تتوفر الطرق المناسبة لتمايز iPSC إلى سلالات عصبية ودبقية 14،15،16. توفر هذه الخلايا منصة فريدة من نوعها للإنسان / المريض لنمذجة الأمراض في المختبر وفحص الأدوية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذه مشتقة من المرضى ، فإن الخلايا العصبية المشتقة من iPSC والخلايا الدبقية توفر نماذج مرضية تعكس ما يحدث في البشر بشكل أكثر دقة.

حتى الآن ، تتوفر طرق قليلة ومريحة لقياس معلمات وظيفية متعددة للميتوكوندريا في iPSCs ، وخاصة الخلايا العصبية الحية والخلايا الدبقية. يوفر استخدام قياس التدفق الخلوي للعالم أداة قوية لقياس المعلمات البيولوجية ، بما في ذلك وظيفة الميتوكوندريا ، في الخلايا المفردة. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل لتوليد أنواع مختلفة من خلايا الدماغ، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، والخلايا العصبية، والخلايا النجمية الدبقية من iPSCs، بالإضافة إلى النهج الجديدة القائمة على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك iPSCs والخلايا العصبية والدبقية المشتقة من iPSC. يوفر البروتوكول أيضا استراتيجية تلطيخ مشترك لاستخدام قياس التدفق الخلوي لقياس حجم الميتوكوندريا ، MMP ، مستوى ROS الميتوكوندريا ، مجمعات MRC ، و TFAM. من خلال دمج مقاييس حجم الميتوكوندريا أو كتلتها ، تسمح هذه البروتوكولات أيضا بقياس كل من المستوى الكلي والمستوى المحدد لكل وحدة ميتوكوندريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول التكميلي S1 للاطلاع على وصفات جميع الوسائط والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تمايز iPSCs البشرية إلى NCSs ، والخلايا العصبية الدوبامين (DA) ، والخلايا النجمية

  1. إعداد لوحات مغلفة مصفوفة.
    1. قم بإذابة قارورة من 5 مل من المصفوفة على الجليد بين عشية وضحاها. قم بتخفيف 1 مل من المصفوفة مع 99 مل من النسر المتوسط المعدل من دولبيكو المتقدم البارد / F-12 من هام (DMEM / F12 المتقدم) (تركيز نهائي بنسبة 1٪). اصنع 1 مل من الأليكوتات وخزنها عند -20 درجة مئوية.
    2. قم بإذابة محلول المصفوفة عند 4 درجات مئوية (اجعله باردا) وقم بتغطية 6 آبار (1 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
    3. ضع اللوحة المطلية بالمصفوفة في حاضنة هواء رطبة بنسبة 5٪ CO2/95٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. أخرج اللوحة من الحاضنة واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: يوصى باستخدام اللوحة في غضون 3 أيام من الطلاء. ومع ذلك ، يمكن تخزين اللوحة المطلية لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية. فقط تذكر أن تخرجه واتركه يسخن إلى RT قبل الاستخدام. للتخزين لفترة طويلة، أضف 1 مل من وسط ثقافة iPSC إلى اللوحة المطلية لتجنب تجفيف المصفوفة.
  2. إذابة iPSCs
    1. قم بتسخين الألواح المطلية بالمصفوفة في RT أو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. قم بتسخين الكمية المطلوبة من وسيط ثقافة iPSC مسبقا في RT.
    2. امزج 6 مل من وسط ثقافة iPSC المسخن مسبقا مع 12 ميكرولتر من مثبط Y-27632 ROCK للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر.
    3. قم بإذابة القارورة المجمدة من iPSCs جزئيا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى تبقى قطعة صغيرة من الجليد.
    4. أضف ببطء 1 مل من وسط زراعة iPSC المسخن مسبقا مع 12 ميكرولتر من مثبط ROCK إلى الخلايا. انقل المحتوى السائل للقارورة باستخدام iPSCs قطرة إلى بئر واحد من لوحة مسبقة الصنع من 6 آبار باستخدام ماصة سعة 5 مل.
    5. حرك اللوحة في اتجاهات عمودية لخلط محتويات البئر وإعادة اللوحة إلى الحاضنة. قم بتغيير وسط زراعة iPSC بعد 24 ساعة بعد الغسيل باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من دولبيكو (1x) (Ca2 + / Mg2+-free) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار).
      ملاحظة: لا تقم بإضافة مثبط ROCK إلى الوجبات اللاحقة. تغيير وسيط ثقافة iPSC يوميا.
  3. الزراعة الفرعية ل iPSCs
    1. قم بتسخين الألواح المطلية بالمصفوفة في RT أو في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. قم بتسخين الكمية المطلوبة من وسيط ثقافة iPSC مسبقا في RT.
    2. استنشاق وسط الثقافة من الألواح التي تحتوي على الخلايا. شطف iPSCs مع DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + مجانا) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
    3. أضف EDTA (0.5 ملليمتر) (1 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ حواف المستعمرات في الرفع من البئر (عادة 3-5 دقائق). شفط EDTA.
    4. أضف وسط ثقافة iPSC المسخن مسبقا (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) وافصل مستعمرات iPSC بقوة باستخدام ماصة معقمة سعة 10 مل مرة واحدة. لا تقم بماصة لأعلى ولأسفل لأن هذا قد يكسر كتل الخلايا إلى خلايا مفردة.
    5. انقل محتويات كل بئر إلى بئرين فرديين في صفيحة من 6 آبار مغلفة بالمصفوفة (2 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) واحتضنها عند 37 درجة مئوية. لا تولد فقاعات في التعليق أثناء السحب.
      ملاحظة: رج الطبق بلطف قبل الاحتفاظ به في الحاضنة. يمكن أن تكون نسبة الانقسام 1: 2 (بئر واحد إلى بئرين جديدين) إلى 1: 4 (بئر واحد في 4 آبار جديدة).
    6. استبدل الوسط يوميا حتى تصل المستعمرات إلى 60٪ من الالتقاء مع حجم جيد واتصالات.
  4. الحث العصبي وتوليد السلف العصبي
    1. تحضير 500 مل من الوسط المحدد كيميائيا (CDM) ، و 500 مل من وسط الحث العصبي (NIM) ، و 500 مل من وسط الخلايا الجذعية العصبية الخالي من المصل (NSC SF).
    2. شطف الخلايا مع DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + مجانا) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار) وإضافة NIM (3 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). إعداد اليوم 0.
    3. استبدل NIM (3 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) في اليوم 1 واليوم 3 واليوم 4 وراقب تحت الفحص المجهري يوميا.
    4. في اليوم 5 ، افصل الورود العصبية إلى ثقافة التعليق كما هو موضح أدناه.
      1. يغسل مرة واحدة بلطف باستخدام DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + -free) (4 مل لكل بئر في طبق من 6 آبار). أضف الكولاجيناز IV (1 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) واحتفظ بها في حاضنة لمدة دقيقة واحدة. استنشق الكولاجيناز IV واغسله مرة واحدة باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في طبق من 6 آبار) بلطف.
      2. أضف 2 مل من NSC SF Medium لكل بئر إلى لوحة من 6 آبار. افصل الخلايا عن طريق كشط قيعان الآبار عن طريق رسم الشبكات باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر.
      3. اجمع تعليق الخلية من طبق 6 بئر في طبق غير ملتصق بطول 10 سم. اجعل الحجم يصل إلى 12 مل باستخدام NSC SF Medium.
      4. رج الطبق غير الملتصق عند 65-85 دورة في الدقيقة على شاكر مداري في حاضنة لمنع التجميع.
  5. DA تمايز الخلايا العصبية
    1. في اليوم 7 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة المكملة بعامل نمو الخلايا الليفية 100 نانوغرام / مل -8b (FGF-8b) ووضع الطبق على الخلاط المداري في الحاضنة.
    2. في الأيام 8-13 ، قم بتغيير الوسط كل يومين وراقب تحت المجهر يوميا.
    3. في اليوم 14 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة المكملة ب 100 نانوغرام / مل FGF-8b و 1 ميكرومتر بورمورفامين (PM). ضع الطبق على الخلاط المداري في الحاضنة.
    4. في الأيام 15-20 ، قم بتغيير الوسط كل يومين وراقب الخلايا تحت الفحص المجهري يوميا.
    5. قم بتمرير الكرات ميكانيكيا باستخدام نصائح 1000 ميكرولتر لتفتيت الكرات الأكبر.
      ملاحظة: يمكن أن تكون النسبة 1: 2 (طبق واحد إلى طبقين جديدين).
  6. إنهاء التمايز
    1. قم بتغطية صفيحة أو أغطية من 6 آبار بالبولي إل-أورنيثين (PLO) واللامينين كما هو موضح أدناه.
      1. قم بتغطية صفيحة من 6 آبار ب 1 مل من منظمة التحرير الفلسطينية لكل بئر ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استنشاق حل منظمة التحرير الفلسطينية.
      2. تعقيم اللوحة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة. شطف الآبار مرتين باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
      3. أضف محلول laminin 5 ميكروغرام / مل (1 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) إلى البئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. استنشق اللامينين واغسل الآبار لفترة وجيزة باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) مرة واحدة قبل الطلاء.
    2. اجمع جميع الكرات (من الخطوة 1.5.5) في أنابيب سعة 50 مل واشحن ب DPBS (1x). يقلب المزيج على 300 × غرام لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت.
    3. احتضان مع 2 مل من كاشف تفكك الخلايا (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تليها التريتور لطيف مع ماصة 200 ميكرولتر (20-50 مرة اعتمادا على حجم الكرات، وتجنب تشكيل فقاعة).
    4. قم بتحييد كاشف تفكك الخلية باستخدام 2 مل من وسيط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) وطرد مركزي للأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
    5. أضف 1 مل من آلية التنمية النظيفة المكملة بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) و 10 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) لإعادة تعليق كريات الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل للحصول على معلقات أحادية الخلية.
    6. استنشاق محلول اللامينين من اللوحة (الخطوة 1.6.1.3) ، واغسله لفترة وجيزة باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) ، وزرع الخلايا (من الخطوة 1.6.5) في الألواح المطلية مسبقا أو أغطية في 3 مل من CDM مكملة ب 10 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF. تغذية الخلايا كل 4 أيام.
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على الثقافات المميزة لعدة أسابيع تصل إلى 3 أشهر. عادة ما يظهر المورفولوجيا العصبية بعد 2 أسابيع من الإنهاء ويمكن استخدامها لتحليلات المصب من تلك النقطة فصاعدا. BDNF و GDNF ليست ضرورية للزراعة لصيانة أطول (تصل إلى 2 أشهر).
  7. جيل مجلس الأمن القومي
    1. لوحات مصفوفة معطف.
    2. اجمع جميع الكرات العصبية (التي تم إنشاؤها من الخطوة 1.4) في أنابيب 50 مل واشحن مع DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + -free). يقلب المزيج على 300 × غرام لمدة 5 دقائق. شفط الخارقين.
    3. احتضان الكريات مع 2 مل من كاشف تفكك الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ، تليها التريتور اللطيف مع ماصة 200 ميكرولتر (20-50 مرة اعتمادا على حجم المجالات ، وتجنب تكوين فقاعة).
    4. تحييد مع 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS والطرد المركزي للأنابيب المخروطية 50 مل التي تحتوي على الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في RT. شفط supernatants. أعد تعليق كريات الخلايا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل للحصول على معلقات أحادية الخلية.
    5. استنشاق محلول المصفوفة من لوحة مغلفة مسبقا وزرع الخلايا في الألواح المطلية مسبقا في NSC SF Medium (3 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). تغذية الخلايا كل 2-3 أيام وتقسيم الخلايا عند التقاء.
      ملاحظة: من هذه المرحلة فصاعدا ، يمكن توسيع NSCs وتجميدها لأسفل.
  8. تمايز الخلايا النجمية الدبقية
    1. تمايز الخلايا النجمية عن NSCs
      1. تحضير 500 مل من وسط تمايز الخلايا النجمية.
      2. NSCs البذور على لوحات / أغطية مغلفة بالبولي دي ليسين (PDL) مع NSC SF Medium.
      3. في اليوم التالي ، اشطف الخلايا باستخدام DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + -free) (4 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) وأضف Astrocyte Differentiation Medium (3 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار). إعداد اليوم 0.
      4. راقب NSCs تحت المجهر يوميا واستبدل وسط تمايز الخلايا النجمية (3 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) كل يومين من الأيام 1 إلى 27.
    2. نضج الخلايا النجمية
      1. إعداد وسط نضج الخلايا النجمية.
      2. في اليوم 28 ، اشطف الخلايا باستخدام DPBS (1x) (4 مل لكل بئر في صفيحة 6 آبار) وأضف وسط نضج الخلايا النجمية (3 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار).
      3. في اليوم 29 وما بعده ، راقب الخلايا تحت المجهر يوميا واستبدل وسط نضج الخلايا النجمية (3 مل لكل بئر في صفيحة 6 آبار) كل يومين.
      4. بعد شهر واحد من النضج ، قم بتوسيع الخلايا والحفاظ عليها بالتبريد من هذه المرحلة فصاعدا.
        ملاحظة: خلال هذه المرحلة، سيزداد عدد الخلايا. عند تقسيم الخلايا ، فإن الأغطية المغلفة ب PDL ليست ضرورية للزراعة.

2. توصيف الخلايا عن طريق الكيمياء المناعية وتلطيخ التألق المناعي

  1. في نهاية فترة الثقافة ، انقل الأغطية مع الخلايا إلى لوحة من 12 بئرا.
    شطف الخلايا مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) (1x) مرتين واحتضان لمدة 10 دقائق في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) (0.5 مل لكل بئر في لوحة 12 بئر) في RT.
    ملاحظة: يمكن تغطية العينة الثابتة ب 2 مل من PBS (1x) وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى تكون مطلوبة للتلطيخ المناعي. PFA سام ويشتبه في أنه يسبب السرطان. منع تعرض الجلد والعين، والعمل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  2. قم بحظر الخلايا وتغلغلها واحتضانها باستخدام مخزن مؤقت مانع يحتوي على PBS (1x) و 0.3٪ Triton X-100 و 10٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعة واحدة في RT.
  3. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في منع العازلة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية: بقع iPSCs مع عامل النسخ المرتبط بالأوكتامر 4 (Oct4) والمستضد الجنيني المضاد للمرحلة 4 (SSEA4) ، NSCs مع المنطقة المحددة للجنس Y box-2 (Sox2) ومضاد Nestin ، الكرات العصبية مع المربع المضاد للإقران -6 (Pax6) ومضاد Nestin ، الخلايا النجمية مع البروتين الحمضي الليفي المضاد للدبقية (GFAP) والبروتين المرتبط بالكالسيوم المضاد S100 β (S100β) ، والخلايا العصبية DA مع هيدروكسيلاز مضاد للتيروزين (TH) ، مضاد β III Tubulin (Tuj 1) ، مضاد Synaptophysin ، ومضاد PSD-95 (0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسي لكل بئر في لوحة من 12 بئرا ؛ انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
  4. اغسل العينات باستخدام PBS (1x) ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع اهتزاز لطيف.
  5. احتضان مع محلول الأجسام المضادة الثانوية (1:800 في المخزن المؤقت المانع ، 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor لكل بئر في صفيحة 12 بئر) لمدة 1 ساعة في RT مع هزاز لطيف.
  6. احتضن الخلايا باستخدام Hoechst 33342 (1:5,000 ، 0.5 مل لكل بئر في صفيحة من 12 بئرا) في PBS (1x) لمدة 15 دقيقة في RT لتسمية النوى.
  7. قم بتركيب الخلايا مع وسط التركيب وجاف بين عشية وضحاها في RT للتصوير تحت المجهر الفلوري في الظلام. انظر الشكل التكميلي S1 للاطلاع على إعدادات المجهر ومعلماته.

3. قياس التدفق الخلوي لحجم الميتوكوندريا ، MMP ، و ROS الميتوكوندريا في الخلايا الحية

  1. زرع الخلايا بشكل منفصل في 4 آبار في صفيحة من 6 آبار حتى تصل الخلايا إلى 50٪ -60٪ التقاء. قم بتسمية هذه الآبار الأربعة على أنها # 1 و # 2 و # 3 و # 4.
  2. في نهاية فترة الاستزراع ، قم بإعداد 5 حلول تلطيخ فردية (500 ميكرولتر لكل بئر في لوحة من 6 آبار) على النحو التالي: # 1 وسط استزراع فقط (إلى البئر # 1 يحتوي على خلايا فقط للتحكم ؛ # 2-1 يحتوي على FCCP (100 ميكرومتر) ؛ # 2-2 تحتوي على FCCP (100 ميكرومتر) + TMRE (100 نانومتر) + MTG (150 نانومتر) في وسط الاستزراع ؛ # 3 تحتوي على TMRE (100 نانومتر) + MTG (150 نانومتر) في وسط الثقافة ؛ # 4 يحتوي على MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) في PBS (1x) مع 10٪ FBS. انظر الشكل 1 أ والجدول التكميلي S2 وجدول المواد للحصول على تفاصيل حول هذه المركبات وإعداد قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: استخدم الوسط الثقافي لإعداد محلول التلطيخ. قم بتسخين الوسط و PBS (1x) في RT قبل الاستخدام. FCCP سامة. منع تعرض الجلد والعين والعمل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  3. استنشاق الوسيط من البئر رقم 2 وأضف الحل رقم 2-1 (FCCP فقط). احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. قم بشفط الوسط من الآبار رقم 2 و # 3 وأضف الحل # 2-2 (FCCP + TMRE + MTG) في البئر رقم 2 والحل رقم 3 (TMRE + MTG) في # 3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  5. استنشاق الوسيط من البئر رقم 4 وأضف الحل رقم 4 (MitoSox Red + MTG). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. شفط الوسط من جميع الآبار. يغسل مع PBS (1x) (4 مل لكل بئر في لوحة من 6 آبار). افصل الخلايا باستخدام 1 مل من كاشف تفكك الخلايا (1 مل لكل بئر في صفيحة من 6 آبار) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد كاشف تفكك الخلية في 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS (2 مل لكل بئر في لوحة 6 آبار).
  7. جمع محتويات جميع الآبار في أنابيب مخروطية 15 مل. جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 300 × غرام لمدة 5 دقائق. اغسل الكريات باستخدام PBS (1x) مرة أو مرتين.
  8. شفط supernatants ولكن ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في الأنابيب. أعد تعليق كريات الخلايا في 300 ميكرولتر من PBS (1x). انقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. حافظ على الأنابيب في الظلام في RT.
  9. تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي (مع تكوين ليزر 3 أزرق و 1 أحمر). اكتشف MTG في المرشح 1 (FL1) باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 530/30 ، TMRE في المرشح 2 (FL2) باستخدام مرشح النطاق الترددي 585/40 ، و MitoSox Red في المرشح 3 (FL3) باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 510/580.

4. قياس التدفق الخلوي للوحدات الفرعية المعقدة MRC و TFAM في الخلايا الثابتة

  1. في نهاية فترة الزرع ، افصل الخلايا (~ 106) عن طريق إضافة كاشف تفكك الخلية ؛ ثم ، بيليه وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. ثبت الخلايا في 1.6٪ PFA (1 مل من 1.6٪ PFA في أنبوب 15 مل) في RT لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  3. تخلل الخلايا مع الميثانول المثلج البارد 90٪ (1 مل من الميثانول 90٪ في أنبوب 15 مل) عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بحظر العينات في المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 0.3 مليون جليسين ، ومصل الماعز بنسبة 5٪ ، وألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 1٪ - الجزء V في PBS (1x) (1 مل من المخزن المؤقت المانع في أنبوب 15 مل). اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين (كما في الخطوة 3.7).
  5. احتضن الخلايا بالأجسام المضادة الأولية التالية لمدة 30 دقيقة: anti-NDUFB10 (1:1,000) لقياس الوحدة الفرعية المعقدة I ، الوحدة الفرعية المعقدة لبروتين الفلافوبروتين A (SDHA ، 1:1,000) لقياس الوحدة الفرعية II المعقدة و anti-COX IV (1:1,000) لقياس الوحدة الفرعية IV المعقدة ، والأجسام المضادة المضادة TFAM المترافقة مع Alexa Fluor 488 (1:400). قم بتلطيخ نفس العدد من الخلايا بشكل منفصل باستخدام الأجسام المضادة المضادة TOMM20 المترافقة مع Alexa Fluor 488 (1:400) لمدة 30 دقيقة (1 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسي في أنبوب 15 مل ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الأجسام المضادة).
  6. اغسل الخلايا باستخدام PBS (1x) مرة واحدة باستخدام الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أضف أجساما مضادة ثانوية (1:400) إلى أنابيب NDUFB10 و SDHA و COX IV واحتضن الخلايا بهذه المحاليل لمدة 30 دقيقة.
  7. اغسل الخلايا باستخدام PBS (1x) مرة واحدة عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. شفط supernatants ، وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في الأنابيب. أعد تعليق كريات الخلايا في 300 ميكرولتر من PBS (1x). انقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل المحفوظة في الظلام على الجليد.
  8. تحليل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي (مع تكوين ليزر أزرق 3 و 1 أحمر). اكتشف الإشارات في المرشح 1 (FL1) باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 530/30. انظر الشكل التكميلي S2 للاطلاع على إعدادات المجهر والمعلمات.

5. اكتساب وتحليل قياس التدفق الخلوي

  1. استخدم أنبوب التحكم غير الملون لضبط مخططات تشتت منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبية (SSC-A) بناء على حجم وتعقيد مجموعة الخلايا التي تم تحليلها. انظر الشكل التكميلي S2 للاطلاع على إعدادات المجهر والمعلمات.
    ملاحظة: قم بإعداد عناصر تحكم غير ملطخة لأنواع الخلايا الفردية.
  2. استخدم أنابيب التحكم غير الملطخة لتحديد البوابات الموجبة، واستخدم أنابيب التحكم أحادية اللون للتعويض عن التداخل الطيفي الفلوري بين MTG (الفلوروفور-1 [FL-1]) وTMRE (FL-2) في قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. استخدم التحكم في النمط المتماثل للتحكم السلبي لمراقبة تلطيخ الخلفية في عينات MRC و TFAM. استخدم أنبوب FCCP كعنصر تحكم في إزالة الاستقطاب لتلطيخ TMRE.
  3. قم بإخراج الحطام الدخيل لاختيار الخلايا الحية والبوابة الرئيسية من مخطط التشتت الأمامي والجانبي (الشكل 2A). قم بإخراج الثنائيات باستخدام ارتفاع تشتت أمامي (FSC-H) مقابل (مقابل) مخطط كثافة FSC-A لاستبعاد الثنائيات وكذلك بناء ارتفاع تشتت جانبي (SSC-H) مقابل مخطط SSC-A (الشكل 2A).
  4. الحصول على البيانات (مقياس التدفق الخلوي)
    1. باستخدام العينات غير الملطخة أو المتماثلة كعنصر تحكم سلبي ، قم بإنشاء بوابة فوق المجموعة الرئيسية لأحداث الخلية الواحدة أثناء عرض SSC-A والمرشحات المختلفة (FL1 و FL2 و FL3 و FL4) (الشكل 1B والشكل 2B).
  5. تحليل البيانات (برنامج CFlow)
    1. انسخ موضع البوابات على عينات الخلايا الملطخة ، وسجل كمية الخلايا الملطخة بشكل إيجابي للتلطيخ الإيجابي.
    2. لكل مجموعة فرعية من الخلايا ، حدد مخططا بيانيا وحلل متوسط كثافة التألق (MFI) لقنوات المرشح المختلفة (FL1 ، FL2 ، FL3 ، FL4) (المحور x).
      1. احسب مستويات TMRE عن طريق طرح MFI ل FL2 للخلايا المعالجة ب FCCP # 2 من MFI ل FL2 من العينات الملطخة ب TMRE # 3 في رسم بياني ، كما هو الحال في Eq (1) أدناه.
        مستويات TMRE = MFI من FL2 من # 3 عينات TMRE ملطخة - MFI من FL2 من # 2 الخلايا المعالجة FCCP (1)
      2. احسب القيم المحددة ل MMP و ROS الميتوكوندريا بواسطة MFI في TMRE أو MitoSox Red ، مع قسمة مؤشر حجم الميتوكوندريا MTG.
      3. احسب القيمة المحددة للوحدة الفرعية المعقدة و TFAM باستخدام MFI في التعبير المعقد أو TFAM ، مع قسمة مؤشر حجم الميتوكوندريا TOMM20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 3 وصفا تخطيطيا لطريقة التمايز واستراتيجيات التدفق الخلوي. يتم تمييز iPSCs البشرية إلى وريدات عصبية ثم يتم رفعها إلى ثقافة التعليق للتمايز في المجالات العصبية. يتم تمييز المجالات العصبية بشكل أكبر ونضجها إلى خلايا عصبية DA. يتم فصل الكرات العصبية إلى خلايا مفردة لتوليد الخلايا النجمية الدبقية ، ويتم طلاؤها في طبقات أحادية كNSCs ، ثم يتم تمييزها إلى خلايا نجمية. يوفر هذا البروتوكول الاستراتيجيات اللازمة للحصول على العينات وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي لقياس MMP وحجم الميتوكوند...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيما يلي بروتوكولات لتوليد الخلايا العصبية والخلايا النجمية المشتقة من iPSC وتقييم جوانب متعددة من وظيفة الميتوكوندريا باستخدام قياس التدفق الخلوي. تسمح هذه البروتوكولات بالتحويل الفعال ل iPSCs البشرية إلى كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية الدبقية والتوصيف التفصيلي لوظيفة الميتوكوندريا ، معظمها في الخلايا الحية. توفر البروتوكولات أيضا استراتيجية قائمة على قياس التدفق الخلوي المشترك للحصول على وظائف الميتوكوندريا المتعددة وتحليلها ، بما في ذلك مستويات ROS للحجم و MMP والميتوكوندريا في الخلايا الحية ومجمعات MRC و TFAM...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز التصوير الجزيئي والمرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بيرغن في النرويج. تم دعم هذا العمل بتمويل من مجلس البحوث النرويجي (رقم المنحة: 229652) ، Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ومجلس المنح الدراسية الصيني (رقم المشروع: 201906220275).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857 ، RRID: AB_445175الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد SSEA4Abcamab16287 ، RRID: AB_778073الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للفأر IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11005) كجسم مضاد ثانوي.
anti-Sox2Abcamab97959 ، RRID: AB_2341193الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
anti-Pax6Abcamab5790 ، RRID: AB_305110الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
المضادة لنستينسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-23927 ، RRID: AB_627994الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدام ك 1:50 ، 20 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للفأر IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11005) كجسم مضاد ثانوي.
المضادة ل GFAPAbcamab4674 ، RRID: AB_304558الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & mu ؛ L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.   استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للدجاج IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11042) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد S100 وبيتا ؛   مقترن ب Alexa Fluor 488Abcamab196442 ، RRID: AB_2722596الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 400 ، 2.5 & mu ؛ L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.
المضادة THAbcamab75875 ، RRID: AB_1310786الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد Tuj 1Abcamab78078 ، RRID: AB_2256751الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 1000 ، 1 & mu ؛ L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للفأر IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11005) كجسم مضاد ثانوي.
المضادة للتشابكAbcamab32127 ، RRID: AB_2286949الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد ل PSD-95Abcamab2723 ، RRID: AB_303248الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 100 ، 10 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.   استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 594 الماعز المضاد للدجاج IgG (1: 800 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11042) كجسم مضاد ثانوي.
مضاد TFAM مقترن بالجسم المضاد الأساسي Alexa Fluor 488Abcamab198308؛ استخدم ك 1: 400 ، 2.5 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام الماوس أحادي النسيلة IgG2b  Alexa Fluor® 488 كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
مضاد TOMM20 مترافق مع Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat # sc-17764 RRID: AB_628381الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 400 ، 2.5 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام الماوس أحادي النسيلة IgG2a  Alexa Fluor® 488 كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
المضادة NDUFB10Abcamab196019الجسم المضاد الأساسي; استخدام ك 1: 1000, 1 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للأرانب كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
المضادة ل SDHAAbcamab137040الجسم المضاد الأساسي. استخدم ك 1: 1000 ، 1 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ.   استخدام Alexa Fluor & reg ؛ 488 الماعز المضادة للأرانب IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للأرانب كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
المضادة ل COX IVAbcamab14744 ، RRID: AB_301443الجسم المضاد الأساسي ؛ استخدم ك 1: 1000 ، 1 & L في 1000 مو ؛ L حل تلطيخ. الاستخدام  أليكسا فلور & ريج; 488 الماعز المضادة للفأر IgG & nbsp ؛ (1:400 ، ثيرمو فيشر العلمي ، كتالوج # A-11001) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للماوس كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
Activin APeproTech120-14Eمكون متوسط تمايز الخلايا النجمية
ABM Basal MediumLonzaCC-3187الوسط القاعدي لثقافة الخلايا النجمية
AGM SingleQuots SupplementPack LonzaCC-4123مكمل لثقافة الخلايا النجمية
المضاد الحيوي المضاد للفطرياتالحرارية فيشر العلمي15240062مكون CDM
متقدم DMEM / F-12Thermo Fisher Scientific12634010وسيط قاعدي لألبومين مصل Geltrex
البقري المخففEuropa BioproductsEQBAH62-1000عامل حجب لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في فحوصات التلوين المناعي ومكون CDM
BDNFPeproTech450-02DA الخلايا العصبية المكون المتوسط
B-27Supplement Thermo Fisher Scientific17504044المكون المتوسط لتمايز الخلايا النجمية
BD Accuri C6 Plus مقياس التدفقBD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية
تركيز الدهونكيميائيا Thermo Fisher Scientific11905031مكون CDM
كاشف17104019العلميللتفكك اللطيف ل iPSCs البشرية
CCD مجهر كاميرا Leica DFC3000 GLeica Microsystems ، ألمانيا
أطباق الثقافة غير المعالجة CorningSigma-AldrichCLS430589ثقافة التعليق
DPBSThermo Fisher Scientific14190250تستخدم لمجموعة متنوعة من غسيل ثقافة الخلايا
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018تمايز الخلايا النجمية القاعدية المتوسطة
EDTAThermo Fisher كاشف 15575020 العلميللتفكك اللطيف من iPSCs البشرية
أساسي 8 متوسطةحرارية فيشر علميةA1516901وسيط قاعدي لثقافة iPSC
أساسي 8 مكمل غذائي (50X)A1517101علمي Thermo Fisherلثقافة iPSC
EGF بروتين بشري مؤتلفملحق PHG0314 علميلثقافة NSC
FGF-basic (AA 10 – 155) بروتين بشري مؤتلفThermo Fisherعلمي PHG0024لثقافة NSC
مصل الأبقار الجنينيSigma-Aldrich12103Cمكون متوسط
FGF-basicPeproTech100-18Bمتوسط تمايز الخلايا النجمية
FCCPAbcamab120081يزيل إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتلوين
TMREنظام شفط السوائل التحكم BVCVacuubrand ، ألمانيا
الفورمالديهايد (PFA) 16٪Thermo Fisher Scientific28908تثبيت الخلية
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302يستخدم لربط وصيانة iPSCs البشرية
GlutaMAXSupplement Thermo Fisher Scientific35050061لثقافة NSC
GDNFPeprotech450-10DA الخلايا العصبية المكون المتوسط
GlycineSigma-AldrichG8898تستخدم لمنع المخزن المؤقت
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31765027Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 البشريSigma-AldrichSRP3055المكون المتوسط لتمايز الخلايا النجمية
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399وصمة عار النوى للصورة متحدة البؤر
Heracell 150i حاضنات CO2فيشر العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكية
IMDMThermo Fisher Scientific21980032الوسط القاعدي ل CDM
الأنسولينRoche1376497مكون CDM
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261مكون متوسط الحث العصبي
عامل النمو الشبيه بالأنسولين - I الإنسانسيجما ألدريتشI3769تمايز الخلايا النجمية المكون المتوسط
KnockOut DMEM / F-12 متوسطThermo Fisher Scientific12660012الوسط القاعدي لثقافة
NSC LamininSigma-AldrichL2020يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
Leica TCS SP8 STED مجهر متحد البؤرLeica Microsystems ، ألمانيا
مونوثيوغليسرينسيجما ألدريتشM6145CDM مكون
MitoTracker الأخضر FMThermo Fisher ScientificM7514يستخدم لمؤشر حجم الميتوكوندريا
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008يستخدم لمؤشر ROS للميتوكوندريا
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250Neural المكون المتوسط التعريفي
N-2 الملحقThermo Fisher Scientific17502048تمايز الخلايا النجمية المكون المتوسط
مصل الماعزالعادي Thermo FisherScientific PCN5000يستخدم لمنع الهزازات المدارية العازلة
- SSM1Stuart Equipment ،
Sigma-AldrichP4957يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204يعزز تمايز الخلايا العصبية DA
إطالة الذهب المضاد للتلاشيThermo Fisher ScientificP36930تركيب الغطاء للصورة
متحد البؤرPBS 1xThermo Fisher Scientific18912014تستخدم لمجموعة متنوعة من الغسيل
المؤتلف للإنسان / الفأر FGF-8b بروتينR & D Systems423-F8-025 / CFيعزز تمايز الخلايا العصبية
DA SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPالحث العصبي المكون
المتوسط StemPro الملحق العصبيThermo Fisher ScientificA10508-01لثقافة NSCs
TrypLE Express إنزيمThermo Fisher Scientific12604013كاشف تفكك الخلية
TransferrinRoche652202مكون CDM
TRITON X-100VWR International9002-93-1يستخدم لنفاذية الخلايا في فحوصات التلوين المناعي
TMREAbcamab113852يستخدم في تلطيخ غشاء الميتوكوندريا
المائي حمام مائي أكاديمية Jb Basic Jba5 JBA5 أدوات منحالمنح ، الولايات المتحدة الأمريكية
الخلوي المحدد أساسية متوسطة مكمل مكمل مكون محلول Poly-L-ornithine في المملكة المتحدة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryMitochondrial ParametersInduced Pluripotent Stem CellsNeural DerivativesGlial DerivativesMitochondrial Membrane PotentialReactive Oxygen SpeciesMitochondrial VolumeMitochondrial DNA CopyMitochondrial Respiratory Chain

Related Articles