يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 باستخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الذي يعبر عنه المراسل

2.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63127

⸱

نوفمبر 5, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Texas Biomedical Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول ديناميكيات الالتهابات الفيروسية باستخدام الفئران المؤتلفة (r) SARS-CoV-2 المعبرة عن اللوسيفيراز والتألق وأنظمة التصوير في الجسم الحي (IVIS) في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 للتغلب على الحاجة إلى النهج الثانوية المطلوبة لدراسة عدوى SARS-CoV-2 في الجسم الحي.

الملخص

تسببت جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) في فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2). وحتى الآن، كان SARS-CoV-2 مسؤولا عن أكثر من 242 مليون إصابة وأكثر من 4.9 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم. على غرار الفيروسات الأخرى ، تتطلب دراسة SARS-CoV-2 استخدام طرق تجريبية للكشف عن وجود الفيروس في الخلايا المصابة و / أو في النماذج الحيوانية. للتغلب على هذا القيد ، قمنا بإنشاء مؤتلف مختص بالنسخ المتماثل (r) SARS-CoV-2 الذي يعبر عن البروتينات الحيوية (nanoluciferase ، Nluc) أو الفلورسنت (Venus). تسمح هذه المراسلات التي تعبر عن rSARS-CoV-2 بتتبع الالتهابات الفيروسية في المختبر وفي الجسم الحي بناء على التعبير عن جينات مراسل Nluc و Venus. تصف الدراسة هنا استخدام rSARS-CoV-2 / Nluc و rSARS-CoV-2 / Venus للكشف عن عدوى SARS-CoV-2 وتتبعها في نموذج الفأر المحول للأنجيوتنسين البشري K18 الموصوف سابقا 2 (hACE2) للعدوى باستخدام أنظمة التصوير في الجسم الحي (IVIS). هذا rSARS-CoV-2 / Nluc و rSARS-CoV-2 / Venus تظهر الإمراض الشبيهة ب rSARS-CoV-2 / WT والتكاثر الفيروسي في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، أن تعبير Nluc و Venus يسمح لنا بتتبع الالتهابات الفيروسية مباشرة في الجسم الحي والجسم الحي السابق ، في الفئران المصابة. تمثل هذه rSARS-CoV-2 / Nluc و rSARS-CoV-2 / Venus خيارا ممتازا لدراسة بيولوجيا SARS-CoV-2 في الجسم الحي ، لفهم العدوى الفيروسية ومرض COVID-19 المرتبط بها ، وتحديد العلاجات الوقائية و / أو العلاجية الفعالة لمكافحة عدوى SARS-CoV-2.

المقدمة

فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) هو فيروس RNA مغلف ، إيجابي الحس ، أحادي الخيط ينتمي إلى سلالة Betacoronavirus في عائلة Coronaviridae 1. تنقسم هذه العائلة الفيروسية إلى ألفا وبيتا وجاما ودلتا فيروس كورونا1. تصيب فيروسات ألفا وبيتا كورونا الثدييات بشكل رئيسي ، في حين أن فيروس جاما ودلتا يصيب الطيور بشكل حصري تقريبا2. حتى الآن، عبرت سبعة فيروسات تاجية حواجز الأنواع وظهرت كفيروسات تاجية بشرية (HCoV): اثنان من فيروسات ألفا (HCoV-229E و HCoV-NL63) وخمسة فيروسات بيتا (HCoV-OC43 و HCoV-HKU1 و SARS-CoV وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية [MERS-CoV] و SARS-CoV-2) 3,4,5,6. SARS-CoV و MERS-CoV و SARS-CoV-2 شديدة الإمراض ، مما يسبب عدوى حادة في الجهاز التنفسي السفلي7. وقبل ظهور السارس - كوف-2، كانت هناك فاشيتان وبائيتان ناجمتان عن فيروس كورونا المستجد (سارس) في قوانغدونغ بروفيدانس، الصين، في الفترة من 2002 إلى 2003، بمعدل إماتة للحالات بلغ حوالي 9.7 في المائة؛ وفاشيات وبائية في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2002 إلى 2003، بلغ معدل إماتة الحالات حوالي 9.7 في المائة؛ وفاشيات وباء في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2002 إلى 2003، حيث بلغ معدل إماتة الحالات حوالي 9.7 في المائة؛ وفاشيات وباء في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2002 إلى 2003؛ وفاشية وباء في قوانغدونغ بروفيدانس بالصين، في الفترة من 2 وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية في الشرق الأوسط من عام 2012 إلى الوقت الحاضر، حيث بلغت نسبة CFR حوالي 34٪ 7,8. يحتوي SARS-CoV-2 على CFR إجمالي يتراوح بين 3.4٪ -49٪ ، مع مساهمة الظروف الأساسية في ارتفاع CFR 8,9. منذ اكتشافه في ديسمبر 2019 ، في ووهان ، الصين ، كان SARS-CoV-2 مسؤولا عن أكثر من 242 مليون إصابة بشرية وأكثر من 4.9 مليون حالة وفاة بشرية في جميع أنحاء العالم 7,10,11,12. ومن الجدير بالذكر أنه منذ أواخر عام 2020، أثرت المتغيرات الجديدة المثيرة للقلق من SARS-CoV-2 (VoC) والمتغيرات ذات الأهمية (VoI) على خصائص الفيروس، بما في ذلك انتقال العدوى والمستضدات 9,13، والاتجاه العام لجائحة كوفيد-19. لعلاج عدوى SARS-CoV-2 ، لا يوجد حاليا سوى ولاية أمريكية واحدة (الولايات المتحدة) إدارة الغذاء والدواء (FDA) العلاجية المضادة للفيروسات (ريمديسيفير) ودواء واحد ترخيص الاستخدام الطارئ (EUA) (baricitinib ، ليتم إعطاؤه بالاشتراك مع ريمديسيفير)14. هناك أيضا 6 أجسام مضادة وحيدة النسيلة معتمدة من EUA: REGEN-COV (casirivimab و imdevimab ، تدار معا) ، sotrovimab ، tocilizumab ، و bamlanivimab و etesevimab تدار معا15،16،17،18،19. لا يوجد حاليا سوى لقاح وقائي واحد معتمد من إدارة الأغذية والعقاقير ، Pfizer-BioNTech ، واثنين من اللقاحات الوقائية الأخرى (Moderna و Janssen) تمت الموافقة عليهما من EUA20،21،22،23،24. ومع ذلك ، مع معدل العدوى غير المنضبط وظهور VoC و VoI ، لا يزال SARS-CoV-2 يشكل تهديدا لصحة الإنسان. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى نهج جديدة لتحديد الوقاية والعلاجات الفعالة للسيطرة على عدوى SARS-CoV-2 وجائحة COVID-19 التي لا تزال مستمرة.

تتطلب دراسة SARS-CoV-2 تقنيات شاقة ومناهج ثانوية لتحديد وجود الفيروس في الخلايا المصابة و / أو النماذج الحيوانية المصادق عليها للعدوى. سمح استخدام علم الوراثة العكسي لتوليد الفيروسات المؤتلفة بالإجابة على أسئلة مهمة في بيولوجيا الالتهابات الفيروسية. على سبيل المثال، وفرت تقنيات الوراثة العكسية وسائل للكشف عن آليات العدوى الفيروسية والإمراض والمرض وفهمها. وبالمثل، مهدت مناهج علم الوراثة العكسي الطريق لهندسة الفيروسات المؤتلفة التي تفتقر إلى البروتينات الفيروسية لفهم مساهمتها في التسبب الفيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت تقنيات علم الوراثة العكسية لتوليد فيروسات مؤتلفة تعبر عن جينات مراسلة للتطبيقات المختبرية والحيوية، بما في ذلك تحديد النهج الوقائية و/أو العلاجية لعلاج الالتهابات الفيروسية. البروتينات الفلورية والمضيئة الحيوية هي الجينات الصحفية الأكثر استخداما بسبب حساسيتها واستقرارها وسهولة اكتشافها بناء على تحسين التقنيات الجديدة25,26. في المختبر ، ثبت أن البروتينات الفلورية تعمل كخيار أفضل لتوطين الفيروسات في الخلايا المصابة ، في حين أن luciferases أكثر ملاءمة لدراسات القياس الكمي27،28،29. في الجسم الحي ، يفضل luciferases على البروتينات الفلورية للتصوير الحيواني الكامل ، في حين يفضل البروتينات الفلورية لتحديد الخلايا المصابة أو التصوير خارج الجسم الحي 30،31،32. كان استخدام الفيروسات المؤتلفة التي يعبر عنها المراسلون بمثابة أداة قوية لدراسة الفيروسات في العديد من العائلات ، بما في ذلك ، من بين أمور أخرى ، فيروسات فلافي ، والفيروسات المعوية ، والفيروسات ألفا ، وفيروسات lentivirus ، وفيروسات الساحة ، وفيروسات الأنفلونزا28،33،34،35،36.

للتغلب على الحاجة إلى نهج ثانوية لدراسة SARS-CoV-2 وتوصيف عدوى SARS-CoV-2 في الوقت الفعلي في الجسم الحي ، قمنا بإنشاء مؤتلف مختص بالنسخ المتماثل (r) SARS-CoV-2 الذي يعبر عن البروتينات الحيوية (nanoluciferase ، Nluc) أو الفلورسنت (Venus) باستخدام علم الوراثة العكسي القائم على الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BAC) الموصوفة سابقا ، والتي يتم الاحتفاظ بها كنسخة واحدة في E. coli من أجل تقليل سمية تسلسل الفيروسات أثناء انتشارها في البكتيريا37,38. ومن الجدير بالذكر أن rSARS-CoV-2/Nluc و rSARS-CoV-2/Venus أظهرا إمراضا شبيها ب rSARS-CoV-2/WT في الجسم الحي. سمح المستوى العالي من تعبير الزهرة من rSARS-CoV-2 / Venus باكتشاف العدوى الفيروسية في رئتي الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 المصابة باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي (IVIS)39. ارتبطت مستويات تعبير كوكب الزهرة بشكل جيد مع العيار الفيروسي المكتشف في الرئتين ، مما يدل على جدوى استخدام تعبير الزهرة كبديل صالح لعدوى SARS-CoV-2. باستخدام rSARS-CoV-2 / Nluc ، تمكنا من تتبع ديناميكيات العدوى الفيروسية في الوقت الفعلي وتقييم عدوى SARS-CoV-2 طوليا في الجسم الحي باستخدام نفس نهج IVIS في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على البروتوكولات التي تنطوي على الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 من قبل اللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية (IBC) التابعة لمعهد تكساس للبحوث الطبية الحيوية (TBRI) واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC). تتبع جميع التجارب التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمجلس الوطني للبحوث40. معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) مطلوبة عند العمل مع الفئران.

1. استخدام K18 hACE2 الفئران المعدلة وراثيا

  1. شراء وصيانة الفئران الأنثوية B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2) في مرفق لرعاية الحيوانات على مستوى السلامة الأحيائية (BSL)-2 في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.
    1. بعد الوصول إلى مرافق BSL2 ، اسمح للحيوانات بالتأقلم لمدة 7 أيام ونقلها إلى منشأة BSL-3 الحيوانية للعدوى والإجراءات التجريبية الأخرى.
    2. باتباع بروتوكولات IACUC ، ضع 4 فئران لكل قفص. لضمان وفاة الحيوان ، بعد إصابة الفئران ب rSARS-CoV-2 والتصوير في الجسم الحي ، قم بالقتل الرحيم للحيوانات بجرعة قاتلة من Fatal-Plus (>100 مجم / كجم).

2- السلامة الأحيائية

ملاحظة: في هذه المخطوطة، يتم إنشاء rSARS-CoV-2 باستخدام الأنظمة الجينية العكسية القائمة على BAC لسلالة SARS-CoV-2 USA-WA1/2020، كما هو موضح سابقا37. يجب إجراء جميع الإجراءات في الجسم الحي التي تنطوي على عدوى rSARS-CoV-2 / Nluc أو rSARS-CoV-2 / Venus في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف BSL-3.

  1. قم بتنظيف خزانة السلامة الأحيائية باستخدام 2٪ Wexicide و 70٪ مطهر الإيثانول بالتتابع قبل وبعد تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية الموضحة في هذه المقالة.
  2. تعقيم جميع مواد التشريح (المقص ، ملقط التشريح ، إلخ) والمجانس قبل وبعد كل استخدام.
  3. قم بتنظيف غرفة العزل وتطهيرها باستخدام أقراص MB10 قبل وبعد كل استخدام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. تخلص من جميع المواد البيولوجية المنتجة أثناء الإجراءات المتبعة للمبادئ التوجيهية ل IBC و IACUC.

3. في الجسم الحي توصيف rSARS-CoV-2

  1. التهابات الفئران
    1. ضع الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 البالغة من العمر 4-6 أسابيع في أقفاص مصنفة ، وحدد الفئران في كل قفص باستخدام رمز لكمة الأذن ووضع 4 فئران لكل قفص. استخدم مجموعة من الفئران لوزن الجسم والبقاء على قيد الحياة ومجموعة أخرى من الحيوانات للمعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسي والتصوير.
    2. قبل الإصابة، حلق صدر الفئران على الجانب البطني من الحلمة الصدرية إلى منطقة الحلمة الإربية لتسهيل إشارة التلألؤ الحيوي.
    3. تحضير لقاح rSARS-CoV-2 مع 105 وحدات لتشكيل البلاك (PFU) / الماوس تحت ظروف معقمة في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر باستخدام محلول ملحي معقم 1x فوسفات عازل (PBS).
      ملاحظة: احسب كمية rSARS-CoV-2 التي سيتم استخدامها في التخفيف الفيروسي باستخدام الصيغة: الفيروس المطلوب = (105 PFU لكل فأر / 50 ميكرولتر) × الحجم النهائي) / عيار المخزون الفيروسي.
    4. حافظ على تلقيح الفيروس مبردا على الجليد.
    5. استخدم الفئران المصابة بالعدوى الوهمية (1x PBS) والفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 / WT كضوابط داخلية. ضع الفئران المصابة الوهمية في قفص منفصل عن الفئران المصابة بفيروس rSARS-CoV-2.
    6. تخدير الفئران باستخدام 5٪ من التخدير الغازي الأيزوفلوران في غرفة التخدير والحفاظ على 3٪ من الأيزوفلوران.
    7. بمجرد تأكيد رد الفعل الوضعي ومنعكس التصحيح ، ضع الماوس في وضع الاستلقاء الظهري.
    8. قشر عنق الماوس بين السبابة والإبهام وعقد الذيل ضد راحة اليد مع إصبع الخنصر لعقد الحيوان في وضع ظهري.
    9. ضع طرف الماصة الذي يحتوي على 50 ميكرولتر من لقاح الفيروس في فتحة الأنف وأخرج المحلول ببطء. تأكد من استنشاق لقاح الفيروس وعدم وجود ارتجاع من خلال مراقبة اختفاء قطرة اللقاح.
  2. رصد التلألؤ الأحيائي K18 hACE2 الفئران المعدلة وراثيا المصابة ب rSARS-CoV-2 / Nluc (الشكل 1 والشكل 2)
    ملاحظة: تتبع هذه التجربة التمثيل التخطيطي وتستخدم الفيروسات المعروضة في الشكل 1. مطلوب مرفق تخدير الأيزوفلوران لنظام التصوير في الجسم الحي (IVIS). انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل الأدوات والأنظمة المطلوبة.
    1. ابدأ تشغيل برنامج التصوير وقم بإعداد المعلمات ، وانقر فوق وضع الصورة إلى Bioluminescence ، وافتح الفلتر ، واضبط وقت التعرض على تلقائي.
    2. عند تهيئة جهاز IVIS ، ضع الفئران في غرفة العزل بينما لا تزال داخل خزانة السلامة الأحيائية. حث الفئران مع الايسوفلوران بتركيز 5 ٪. بمجرد تأكيد فقدان التفاعل الوضعي ومنعكس التصحيح ، حافظ على 3٪ من الأيزوفلوران.
    3. بمجرد تخدير الفئران ، قم بإزالتها من غرفة العزل وقم بإدارة الركيزة luciferase المخففة بنسبة 1: 10 في 1x PBS (الحجم النهائي 100 ميكرولتر / الماوس) بإبرة 25 G.
    4. بعد إعطاء الركيزة luciferase ، ضع الفئران مرة أخرى في غرفة العزل مع صدورهم متجهة لأعلى وتجويف الأنف داخل المخروط المشعب للحفاظ على تخدير الحيوان أثناء إجراء التصوير.
    5. انقل غرفة العزل إلى جهاز IVIS ، وعلى الفور بعد إغلاق باب تصوير IVIS ، حدد Acquisition في البرنامج المراد تهيئته (الشكل 2A).
    6. لتحليل صور التلألؤ الحيوي المكتسبة ، استخدم أداة ROI (منطقة الاهتمام) في البرنامج لتعيين الإشارة الدقيقة وقياس التدفق (الشكل 2B).
    7. انقر فوق قياس واسمح للنظام بالبدء في تقييم التلألؤ الحيوي في الفوتونات لتوفير انبعاث الفوتون المطلق المماثل لقياسات المخرجات التي توفرها المعلمات المختلفة.
    8. صور الفئران في 1 و 2 و 4 و 6 أيام بعد الإصابة.
    9. بعد التصوير وضع الفئران مرة أخرى في قفص.
  3. تحليل التألق في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 المصابة ب rSARS-CoV-2 / Venus (الشكل 3 والشكل 4)
    ملاحظة: تتبع هذه التجربة التمثيل التخطيطي و rSARS-CoV-2 الموضح في الشكل 3. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل الأدوات والأنظمة المطلوبة.
    1. ابدأ تشغيل برنامج التصوير وقم بإعداد المعلمات ، واضبط الإثارة (500 نانومتر) ومرشحات الانبعاثات (530 نانومتر) ، وانقر فوق وضع الصورة إلى Fluorescence واضبط وقت التعرض على تلقائي.
    2. القتل الرحيم داخل الصفاق للفئران باستخدام جرعة قاتلة من Fatal-Plus (>100 مجم / كجم). بعد القتل الرحيم ، قم بتطهير موقع الشق بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    3. باستخدام ملاقط ، اسحب الجلد ، وقم بعمل شق من القص إلى البطن وقطع الشق من الجانبين بالمقص. قطع الوريد الكبدي لتقليل كمية الدم في الرئتين وتجنب إشارات الخلفية العالية أثناء التصوير.
    4. باستخدام مقص ، قطع القص وفتح القفص الصدري. بعد ذلك ، قص نهاية القصبة الهوائية بمقص وإزالة الرئتين باستخدام ملاقط.
    5. ضع الرئتين المقتطعتين في صفيحة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من 1x PBS وشطفها لإزالة الدم الزائد. تقليل إمكانية التلوث بين العينات عن طريق تطهير وتنظيف أدوات الجراحة بين العينات باستخدام 70٪ من الإيثانول.
    6. بعد تهيئة جهاز IVIS ، ضع الرئتين في صينية سوداء وافصل الأنسجة عن بعضها البعض.
    7. ضع الدرج داخل غرفة العزل داخل خزانة السلامة الأحيائية ، ثم انقل غرفة العزل إلى IVIS. أغلق الباب وانقر على Acquisition لبدء تشغيل نظام التصوير (الشكل 4A).
    8. لتحليل التألق ، استخدم أداة عائد الاستثمار وارسم عائد الاستثمار حول كل من الرئتين الفرديتين. قم بقياس كل عائد استثمار يدويا ثم استخدم متوسط قيم كفاءة الإشعاع المعطاة واطرحها من قيم الفئران المصابة بالعدوى الوهمية (الشكل 4B).
    9. بمجرد اكتمال التصوير ، ضع الأنسجة على الجليد لتحليلها في نفس اليوم أو في أنبوب تبريد لتجميد الثلج الجاف لتخزينه عند -80 درجة مئوية للمعالجة لاحقا.
  4. التصوير الميداني الساطع للرئة وتسجيل علم الأمراض للفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 المصابة ب rSARS-CoV-2 / Nluc (الشكل 2A-C) و rSARS-CoV-2 / Venus (الشكل 4A-C)
    1. بعد تصوير التلألؤ الحيوي للفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 / Nluc و rSARS-CoV-2 / WT والمصابين الوهميين ، أعد الفئران إلى أقفاصها. المضي قدما في القتل الرحيم والتصوير الميداني المشرق خارج الجسم الحي لرئتي الفئران (الشكل 2A).
    2. بعد تصوير التألق خارج الجسم الحي لرئتي الفئران المصابة ، التقط صورا ساطعة للرئتين (الشكل 4A).
    3. تحليل الآفات الإجمالية على سطح الرئة باستخدام ImageJ (الشكلان 2C و 4C).
    4. افتح صورة الرئة ليتم تحليلها في ImageJ.
    5. احسب نسبة البكسل إلى سم ، واستخدم الأداة المستقيمة وقم بقياس الطول الفعلي للصورة.
    6. بعد التحديد ، انقر فوق تحليل > قياس لحساب طول وحدات البكسل للطول.
    7. انقر فوق تحليل > تعيين المقياس وإدخال الأرقام المحسوبة من الخطوة السابقة.
    8. استخدم أداة التحديدات اليدوية وحدد سطح الرئة بأكمله. انقر فوق تحليل > قياس لقياس إجمالي مساحة الرئة.
    9. انقر فوق تحرير > التحديد > جعل عكس لتحديد بقية منطقة الرئة ، ثم اضغط على حذف أو backspace لإزالة الخلفية.
    10. قم بإزالة المساحة المحددة، ثم انقر على الصورة > ضبط > عتبة اللون.
    11. لتحديد منطقة الآفة المرضية، اضبط السطوع على الحد الأدنى (بين 1 إلى 50) والحد الأقصى (بين 50 إلى 200)، اعتمادا على مستويات الازدحام والنزيف الموجودة.
    12. بمجرد تحديد الآفات المرضية ، انقر فوق تحديد في أسفل لوحة لون العتبة ، ثم انقر فوق تحليل > قياس لقياس المناطق المرضية.
    13. احسب النسبة المئوية للآفات الإجمالية باستخدام الصيغة: ٪ من المساحة المرضية = (قياس المساحة المرضية / إجمالي سطح الرئة) × 100.
  5. المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسي (الشكل 2D والشكل 4D)
    1. عند التصوير ، أكمل القتل الرحيم للفئران وجمع الرئتين والدماغ والغشاء المخاطي للأنف.
    2. ضع الرئتين والدماغ والغشاء المخاطي للأنف في مجانسات أنسجة معقمة منفصلة وأضف 1 مل من 1x PBS البارد.
    3. قم بتجانس العينات عن طريق الطرد المركزي عند 21,500 × g لمدة 10 دقائق لتكسير حطام الخلايا. جمع ونقل supernatants إلى أنبوب معقم جديد والتخلص من الكريات.
    4. إذا تم إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي الفيروسي في نفس اليوم ، فقم بتخزين supernatants عند 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك ، قم بتجميد supernatant من العينات المتجانسة عند -80 درجة مئوية حتى يتم تقييمها لاحقا.
    5. باستخدام supernatants التي تم الحصول عليها من متجانسات الأنسجة جعل 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية وتصيب الطبقات الأحادية المتقاربة من خلايا Vero E6 مع 1 مل من كل تخفيف من supernatant (تنسيق لوحة 6 حسنا ، 1.2 × 106 خلايا / بئر ، ثلاثية).
    6. دع الفيروس يمتص لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 رطبة.
    7. بعد الامتزاز الفيروسي ، اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS واحتضنها في 2 مل من وسائط ما بعد العدوى التي تحتوي على 1٪ Agar في حاضنة CO2 الرطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
    8. بعد الحضانة ، قم بتعطيل الألواح في الفورمالين المخزن مؤقتا المحايد بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية ، وتأكد من غمر اللوحة بأكملها.
    9. أخرج الألواح من BSL3 واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من 1x PBS وتخلل 1 مل من 0.5٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    10. قم بحظر الخلايا ب 1 مل من ألبومين مصل البقر بنسبة 2.5٪ (BSA) في 1x PBS لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، تليها الحضانة في 1 مل من 1 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد أحادي النسيلة التفاعلي لبروتين SARS-CoV (N) (1C7C7) ، المخفف في 2.5٪ BSA لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    11. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من 1x PBS وقم بتطوير اللويحات باستخدام مجموعة ABC ومجموعة ركيزة DAB Peroxidase وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
    12. احسب العيار الفيروسي على أنه PFU / mL.
      ملاحظة: احسب باستخدام الصيغة PFU/mL = عامل التخفيف × عدد اللويحات × (1 ملليلتر/حجم اللقاح).
  6. نشاط Nluc في أنسجة الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 المصابة ب rSARS-CoV-2 / Nluc (الشكل 2E)
    1. حدد كمية وجود Nluc في تجانس الأعضاء من الفئران المعدلة وراثيا الوهمية rSARS-CoV-2 / WT و rSARS-CoV-2 / Nluc المصابة K18 hACE2 باستخدام فحص luciferase باتباع تعليمات الشركات المصنعة.
  7. تقييم المراضة والوفيات (الشكل 2 واو وزاي والشكل 4 هاء وواو)
    1. تصيب داخل الأنف أنثى K18 hACE2 المعدلة وراثيا من الإناث البالغة من العمر 4-6 أسابيع مع 105 PFU من rSARS-CoV-2 / WT أو rSARS-CoV-2 / Venus أو rSARS-CoV-2 / Nluc أو المصابة الوهمية كما هو موضح في القسم 3.1.
    2. راقب الفئران ووزنها على مدار 12 يوما في نفس الوقت لتقليل اختلاف الوزن بسبب تناول الطعام. القتل الرحيم للفئران التي تفقد 25٪ من وزن جسمها الأولي لأنها وصلت إلى نقطة نهاية إنسانية ولاحظ أن هذه الفئران تستسلم للعدوى الفيروسية.
    3. بعد 12 يوما ، القتل الرحيم للفئران التي تنجو من العدوى الفيروسية وحساب النسبة المئوية لتغير وزن الجسم والبقاء على قيد الحياة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عدوى rSARS-CoV-2/Nluc في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 (الشكلان 1 و2)
ويبين الشكل 1 ألف تمثيلا تخطيطيا ل rSARS-CoV-2/WT (أعلى) و rSARS-CoV-2/Nluc (أسفل) المستخدمة لتقييم العدوى في الجسم الحي. ويبين الشكل 1 باء مخطط التدفق التخطيطي المطبق لتقييم ديناميات العدوى بفيروس كورونا المستجد (rSARS-CoV-2/Nluc) في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2. كانت الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 البالغة من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوضح هذا البروتوكول جدوى استخدام هذه الجينات rSARS-CoV-2 التي تعبر عن جينات المراسل لمراقبة العدوى الفيروسية في الجسم الحي. يوفر كل من الفيروسات المؤتلفة التي يعبر عنها المراسل أداة ممتازة لدراسة عدوى SARS-CoV-2 في الجسم الحي. تمثل أنظمة التصوير خارج الجسم الحي الموصوفة (rSARS-CoV-2 / Venus) وفي الجسم الحي (rSARS-CoV-2 / Nluc) خيارا ممتازا لفهم ديناميكيات عدوى SARS-CoV-2 ، والتسبب الفيروسي وتحديد الخلايا / الأعضاء المصابة في أوقات مختلفة بعد العدوى الفيروسية. من أجل إجراء دراسات خا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي تضارب تجاري أو مالي أو غير مالي أو شخصي في المصالح فيما يتعلق بالعمل الموصوف.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الأعضاء في معهدنا (معهد تكساس للبحوث الطبية الحيوية) على جهودهم في الحفاظ على تشغيل منشآتنا بالكامل وآمنة خلال جائحة COVID-19. ونود أيضا أن نشكر لجنتنا المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC) و spell (IACUC) على مراجعة بروتوكولاتنا بطريقة فعالة من حيث الوقت. نشكر الدكتور توماس موران في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي على توفير الجسم المضاد أحادي النسيلة للبروتين أحادي النسيلة 1C7C7 التفاعلي 1C7C7 (N). يتم دعم أبحاث SARS-CoV-2 في مختبر مارتينيز سوبريدو حاليا من خلال منح NIAID / NIH RO1AI161363-01 و RO1AI161175-01A1 و R43AI165089-01 ؛ تمنح وزارة الدفاع (DoD) W81XWH2110095 و W81XWH2110103 ؛ شراكة سان أنطونيو من أجل العلاج الدقيق؛ منتدى معهد تكساس للبحوث الطبية الحيوية؛ مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو ؛ مؤسسة سان أنطونيو الطبية؛ ومن قبل مركز البحوث المتعلقة بإمراض الأنفلونزا وانتقالها (CRIPT) ، وهو مركز للتميز في أبحاث الأنفلونزا والاستجابة لها تموله NIAID (CEIRR ، العقد رقم 75N93021C00014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5٪ Triton X-100JTBakerX198-07يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT)
1٪ DEAE-Dextran:MP Biomedicals195133
محلول فورمالين 10٪ ، مخزن محايدSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
24 بئر لوحة ثقافة الخلاياGreiner Bio-one662160
5٪ بيكربونات الصوديومSigma AldrichS-5761
6-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one657160
96-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one655-180
الخلايا الظهارية للكلى الأخضر الأفريقي (Vero E6)ATCCCRL-1586
Ami HTSpectral Instruments Imaging
Aura برنامج التصوير 3.2.0أدوات طيفية التصويربرنامج تحليل الصور
ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، 35٪Sigma-AldrichA9647Store في 4 درجات ؛ C
ثقافة الخلية الصف المياهCorning25-055-CV
Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسط (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVStore at 4 & deg; C
آلة غاز التخديرأنظمة التخدير البيطرية ، Inc.VAS 2001R
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Seradigm1500-050يخزن في -20 درجة ؛ C
أنثى الفئران المعدلة وراثيا K18-hACE2 البالغة من العمر أربعة إلى ستة أسابيعمختبر جاكسون34860
Graphpad Prism الإصدار 9.1.0GraphPad
IsofluraneBaxter1001936040Store في RT
MARS Data Analysis SoftwareBMG LABTECH
MB10 أقراصQUIP LaboratoriesMBTAB1.5Store at RT
كاشف فحص Nano-Glo LuciferasePromegaN1110يستخدم هذا الكاشف لقياس نشاط Nluc. يخزن في -20 درجة ؛ C
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine (PSG) 100xCorning30-009-CIStore at -20 & deg ؛ C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizerBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
تجانس الأنسجة الرخوة CK14 & 7 ملBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
VECTASTAIN ABC-HRP KIT ، بيروكسيدازمجموعة مختبرات ناقلاتPK-4002ABC ومجموعة ركيزة DAB بيروكسيداز

المراجع

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423(2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309(2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611(2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280(2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12(2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168(2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SARS CoV 2 K18 hACE2 SARS CoV 2
التصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 باستخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الذي يعبر عنه المراسل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.