Method Article

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/63136

⸱

April 11th, 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول تصميما بسيطا لرقاقة الموائع الدقيقة ومنهجية التصنيع الدقيق المستخدمة لزراعة C. elegans في وجود إمدادات غذائية مستمرة لمدة تصل إلى 36 ساعة. يتيح جهاز النمو والتصوير أيضا تصويرا متقطعا عالي الدقة طويل المدى للعمليات الخلوية وشبه الخلوية أثناء التطوير لعدة أيام.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثبت Caenorhabditis elegans (C. elegans) أنه نظام نموذجي قيم لدراسة العمليات البيولوجية التنموية والخلوية. غالبا ما يتطلب فهم هذه العمليات البيولوجية تصويرا طويل الأمد ومتكررا لنفس الحيوان. أوقات التعافي الطويلة المرتبطة بطرق التثبيت التقليدية التي تتم على منصات أجار لها آثار ضارة على صحة الحيوان مما يجعل من غير المناسب تصوير نفس الحيوان بشكل متكرر على مدى فترات طويلة من الزمن. تصف هذه الورقة تصميم رقاقة الموائع الدقيقة ، وطريقة التصنيع ، وبروتوكول زراعة C. elegans على الرقاقة ، وثلاثة أمثلة للتصوير طويل المدى لدراسة العمليات التنموية في الحيوانات الفردية. الرقاقة ، المصنعة من polydimethylsiloxane والمستعبدين على غطاء زجاجي ، تشل حركة الحيوانات على ركيزة زجاجية باستخدام غشاء مرن ينحرف باستخدام غاز النيتروجين. يتيح التثبيت الكامل ل C. elegans تصويرا قويا بفاصل زمني للأحداث الخلوية وشبه الخلوية بطريقة خالية من التخدير. تسمح هندسة القناة ذات المقطع العرضي الكبير للحيوان بالتحرك بحرية داخل غشاءين معزولين مغلقين جزئيا مما يسمح بالنمو في القناة مع إمدادات غذائية مستمرة. باستخدام هذه الشريحة البسيطة ، يمكن إجراء تصوير الظواهر التنموية مثل نمو العملية العصبية ، وتطور الفرج ، والتشجير المتغصن في الخلايا العصبية الحسية PVD ، حيث ينمو الحيوان داخل القناة. تعمل رقاقة النمو والتصوير على المدى الطويل بخط ضغط واحد ، ولا توجد صمامات خارجية ، ومستهلكات سائلة غير مكلفة ، وتستخدم بروتوكولات معالجة الديدان القياسية التي يمكن تكييفها بسهولة من قبل المختبرات الأخرى باستخدام C. elegans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثبت Caenorhabditis elegans أنه كائن نموذجي قوي لدراسة بيولوجيا الخلية والشيخوخة وبيولوجيا التنمية وبيولوجيا الأعصاب. أدت مزايا مثل جسمها الشفاف ، ودورة حياتها القصيرة ، وسهولة الصيانة ، وعدد محدد من الخلايا ، والتماثل مع العديد من الجينات البشرية ، وعلم الوراثة المدروس جيدا إلى أن تصبح C. elegans نموذجا شائعا لكل من اكتشافات البيولوجيا الأساسية والبحوث التطبيقية 1,2. يمكن أن يكون فهم العمليات البيولوجية والتنموية للخلية من الملاحظة المتكررة طويلة المدى للحيوانات الفردية مفيدا. تقليديا ، يتم تخدير C. elegans على منصات أجار وتصويرها تحت المجهر. الآثار الضارة للتخدير على صحة الحيوانات ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع جهاز النمو والتصوير

  1. تصنيع قوالب SU8
    1. أنماط التصميم 1 (طبقة التدفق) و 2 (طبقة التحكم) باستخدام أشكال مستطيلة في برنامج معالجة النصوص (أو برنامج CAD للتصميم بمساعدة الكمبيوتر) وطباعة الأقنعة الضوئية بمساعدة راسمة ليزر بحد أدنى لحجم الميزة 8 ميكرومتر على فيلم قائم على البوليستر (الشكل 1).
    2. قطع رقائق السيليكون في قطع 2.5 سم × 2.5 سم وتنظيفها بنسبة 20٪ KOH لمدة 1 دقيقة. شطف الرقائق في الماء منزوع الأيونات (DI). استخدم رقاقة واحدة لكل من التدفق وطبقة التحكم.
      تحذير: KOH مادة أكالة ويجب التعامل معها بحذر.
    3. جفف القطع بغاز النيتروجين المضغوط 14 رطل / بوصة مربعة متبوعا بالجفاف على طبق ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف الجهاز: يتكون جهاز النمو والتصوير من طبقتين PDMS مرتبطتين معا (الشكل 1) باستخدام رابطة بلازما لا رجعة فيها. تسمح لنا طبقة التدفق (النمط 1) التي يبلغ طولها 10 مم وارتفاعها 40 ميكرومتر أو 80 ميكرومتر بزراعة الحيوان في الثقافة السائلة (الشكل 1 أ). تحتوي طبقة الاصطياد (النمط 2) على غشاء بعرض 2 مم (الشكل 1B) لشل حركة الحيوان للتصوير عالي الدقة. يخلق قناع طبقة الاصطياد أيضا زوجا من أغشية العزل لتقييد حركة الحيوانات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة ، تم وصف بروتوكول لتصنيع واستخدام جهاز الموائع الدقيقة البسيط لزراعة C. elegans مع إمدادات غذائية ثابتة وتصوير عالي الدقة لحيوان واحد أثناء تطوره. عملية التصنيع هذه بسيطة ويمكن إجراؤها في بيئة غير معقمة. تعد البيئة الخالية من الغبار أمرا بالغ الأهمية أثناء خطوات التصنيع. قد يؤدي وجود جزيئات الغبار إلى اتصال غير صحيح بين سطحي الترابط ، مما يؤدي إلى ضعف الترابط وتسرب الجهاز أثناء تطبيق الضغط العالي أثناء تجميد C. elegans. من بين جميع الأجهزة المصنعة ، 95٪ من الأجهزة مناسبة للتجارب. يفشل عدد .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. و S.P.K. هما مؤلفا براءة اختراع معلقة على جهاز نمو الموائع الدقيقة والتصوير (طلب براءة الاختراع رقم 640 / CHE / 2011).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مرفق التصوير CIFF ، NCBS لاستخدام المجاهر متحدة البؤر التي يدعمها DST - مركز تكنولوجيا النانو (No. SR/55/NM-36-2005). نشكر تمويل الأبحاث من DBT (SPK) ، CSIR-UGC (JD) ، DST (SM) ، DBT (SM) ، قرص الغزل المدعوم من DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK و Gautam Menon) ، ورقم منحة HHMI-IECS 55007425 (SPK). تم توفير سلالات HB101 و PS3239 و wdIs51 من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). صنع SPK jsIs609 في مختبر مايك نونت.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 إبر GSigma-Aldrich ، بنغالور ، الهندمقياس 18
محبس ثلاثي الاتجاهاتCole-ParmerWW-30600-02تركيب Masterflex مع قفل لور
كاميرا CCDAndor TechnologyEMCCD C9100-13no
فيلم لوحةالدوائر Fine Line Imaging ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكيةتتم طباعة التصاميم ب 65،024 نقطة في البوصة (DPI)
فرن الحملMeta-Lab الصناعات العلمية ، الهندMSI-5
Coverslipsغطاء مجهري22 مم × 10 جرام
إيثانولمرحبا وسائل الإعلام
هاريس المثقاب أحادي النواة 1 ممQiagenZ708801
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich ، بنغالور ، الهند440191
لوحةساخنة  IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
Laser Scanning MicroscopeZEISSLSM 5 LIVE
Micropipette TipsTarsons0.5-10 & micro ؛ تستخدم أطراف الماصات الدقيقة L للإمدادات
الغذائية السلبي Microresist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
سلبي مقاوم للضوء -2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
غاز النيتروجينالمورد المحلي حجمأسطوانة غاز النيتروجين التجاري7 متر
مكعب PDMS (محلول معالجة)شركة داو كورنينج ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية  ؛ سيلجارد علاج محلولعلاج عامل
بتري لوحاتبرافين العلمية كوربوريشن
منظف البلازماهاريك بلازما ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية  ؛ PDC-32G
ماكينة حلاقة وشفرات ليسترشفرة
مطاط من السيليكون (قاعدة)شركة داو كورنينج كورنينج ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيلجارد 184 قاعدةقاعدة مطاطية
أنابيب فيشر العلميةالبلاستيكية بقطر داخلي 1.59 مم والقطر الخارجي 3.18 مم
رقاقة السيليكونجامعة ويفر ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية[100] الاتجاه ، 4 بوصة القطرصغيرة (2 مم ومرات ؛ 2 مم) تم قطعها من رقاقة قطرها 100 مم
Spin CoaterSPS-Europe BV ، مجهر قرص الغزل الهولنديSPIN 150
Perkin Elmer نظام VOX فائق الرؤيةCSU-X1-A3 Nتم تجهيز النظام بأربعة ليزر (405/488/561/640 نانومتر) وتم التحكم فيه باستخدام حزمة برامج Volocity.
مطور SU8Microchem ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةSU8 المطور
Trichloro (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silaneSigma-Aldrich ، بنغالور ، الهند448931Trichloro (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) بخار السيلان هو
مصباح الأشعة فوق البنفسجيةOriel Instruments ، بنغالور ، الهند200 واط ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية الموازاة
VolocityPerkin-ElmerImage تحليل
الحراري أزرق جراحية أنابيب سيليكون ذات قطع السام برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nema....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansLong Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

Related Articles