مقالة منهجية

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/63136

⸱

أبريل 11, 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول تصميما بسيطا لرقاقة الموائع الدقيقة ومنهجية التصنيع الدقيق المستخدمة لزراعة C. elegans في وجود إمدادات غذائية مستمرة لمدة تصل إلى 36 ساعة. يتيح جهاز النمو والتصوير أيضا تصويرا متقطعا عالي الدقة طويل المدى للعمليات الخلوية وشبه الخلوية أثناء التطوير لعدة أيام.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثبت Caenorhabditis elegans (C. elegans) أنه نظام نموذجي قيم لدراسة العمليات البيولوجية التنموية والخلوية. غالبا ما يتطلب فهم هذه العمليات البيولوجية تصويرا طويل الأمد ومتكررا لنفس الحيوان. أوقات التعافي الطويلة المرتبطة بطرق التثبيت التقليدية التي تتم على منصات أجار لها آثار ضارة على صحة الحيوان مما يجعل من غير المناسب تصوير نفس الحيوان بشكل متكرر على مدى فترات طويلة من الزمن. تصف هذه الورقة تصميم رقاقة الموائع الدقيقة ، وطريقة التصنيع ، وبروتوكول زراعة C. elegans على الرقاقة ، وثلاثة أمثلة للتصوير طويل المدى لدراسة العمليات التنموية في الحيوانات الفردية. الرقاقة ، المصنعة من polydimethylsiloxane والمستعبدين على غطاء زجاجي ، تشل حركة الحيوانات على ركيزة زجاجية باستخدام غشاء مرن ينحرف باستخدام غاز النيتروجين. يتيح التثبيت الكامل ل C. elegans تصويرا قويا بفاصل زمني للأحداث الخلوية وشبه الخلوية بطريقة خالية من التخدير. تسمح هندسة القناة ذات المقطع العرضي الكبير للحيوان بالتحرك بحرية داخل غشاءين معزولين مغلقين جزئيا مما يسمح بالنمو في القناة مع إمدادات غذائية مستمرة. باستخدام هذه الشريحة البسيطة ، يمكن إجراء تصوير الظواهر التنموية مثل نمو العملية العصبية ، وتطور الفرج ، والتشجير المتغصن في الخلايا العصبية الحسية PVD ، حيث ينمو الحيوان داخل القناة. تعمل رقاقة النمو والتصوير على المدى الطويل بخط ضغط واحد ، ولا توجد صمامات خارجية ، ومستهلكات سائلة غير مكلفة ، وتستخدم بروتوكولات معالجة الديدان القياسية التي يمكن تكييفها بسهولة من قبل المختبرات الأخرى باستخدام C. elegans.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثبت Caenorhabditis elegans أنه كائن نموذجي قوي لدراسة بيولوجيا الخلية والشيخوخة وبيولوجيا التنمية وبيولوجيا الأعصاب. أدت مزايا مثل جسمها الشفاف ، ودورة حياتها القصيرة ، وسهولة الصيانة ، وعدد محدد من الخلايا ، والتماثل مع العديد من الجينات البشرية ، وعلم الوراثة المدروس جيدا إلى أن تصبح C. elegans نموذجا شائعا لكل من اكتشافات البيولوجيا الأساسية والبحوث التطبيقية 1,2. يمكن أن يكون فهم العمليات البيولوجية والتنموية للخلية من الملاحظة المتكررة طويلة المدى للحيوانات الفردية مفيدا. تقليديا ، يتم تخدير C. elegans على منصات أجار وتصويرها تحت المجهر. الآثار الضارة للتخدير على صحة الحيوانات تحد من استخدام الحيوانات المخدرة للتصوير المتقطع على المدى الطويل والمتكرر لنفس الحيوان 3,4. تتيح التطورات الحديثة في تقنيات الموائع الدقيقة وتكييفها مع الاصطياد الخالي من التخدير ل C. elegans مع مخاطر صحية ضئيلة التصوير عالي الدقة لنفس الحيوان على مدى فترة زمنية قصيرة وطويلة.

تم تصميم رقائق الموائع الدقيقة لفحص C. elegans'5 عالي الإنتاجية6،7،8 ، ومحاصرة وتوزيع9 ، وفحص المخدرات 10،11 ، وتحفيز الخلايا العصبية مع تصوير عالي الدقة 12 ، وتصوير عالي الدقة للحيوان 12،13،14. كما تم تطوير صفائح الموائع الدقيقة الرقيقة للغاية للتثبيت على الشرائح15. تم إجراء دراسات طويلة الأجل على C. elegans باستخدام صور منخفضة الدقة للحيوانات التي تنمو في الثقافة السائلة لمراقبة النمو وديناميكيات الكالسيوم وتأثيرات الدواء على سلوكها16،17،18،19 ، وطول عمرها ، والشيخوخة20. تم إجراء دراسات طويلة الأجل باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة لتقييم التطور المشبكي21 ، وتجديد الخلايا العصبية 22 ، وإضافة الميتوكوندريا23. تم إجراء تصوير عالي الدقة على المدى الطويل وتتبع مصير الخلية والتمايز في أجهزة متعددة القنوات24,25. تحدث العديد من الأحداث الخلوية وشبه الخلوية على مدى نطاقات زمنية لعدة ساعات وتتطلب محاصرة نفس الفرد في نقاط زمنية مختلفة أثناء تطورها لتوصيف جميع الخطوات الوسيطة في العملية لفهم الديناميات الخلوية في الجسم الحي. لتصوير العملية البيولوجية مثل تكوين الأعضاء ، وتطور الخلايا العصبية ، وهجرة الخلايا ، يحتاج الحيوان إلى تجميد الحركة في نفس الاتجاه في نقاط زمنية متعددة. لقد نشرنا سابقا بروتوكولا للتصوير عالي الدقة ل C. elegans لأكثر من 36 ساعة لتحديد مكان إضافة الميتوكوندريا على طول الخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات اللمس (TRNs)23.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء منهجية قائمة على الموائع الدقيقة للتصوير المتكرر عالي الدقة. هذا الجهاز ، مع قناة تدفق واحدة ، هو الأنسب للتصوير المتكرر لحيوان واحد لكل جهاز. لتحسين الإنتاجية وتصوير العديد من الحيوانات في وقت واحد ، يمكن توصيل أجهزة متعددة بنفس خط الضغط ولكن مع موصلات ثلاثية منفصلة تتحكم في واحد في كل جهاز. التصميم مفيد للدراسات التي تتطلب صورا ذات فاصل زمني عالية الدقة مثل عمليات النمو بعد الجنين ، وهجرة الخلايا ، ونقل العضيات ، ودراسات التعبير الجيني ، وما إلى ذلك. يمكن أن تكون التكنولوجيا مقيدة لبعض التطبيقات مثل دراسات العمر والشيخوخة التي تتطلب نموا متوازيا وتصويرا للعديد من الحيوانات في المرحلة المتأخرة. تم استخدام المطاط الصناعي Polydimethylsiloxane (PDMS) لتصنيع هذا الجهاز بسبب ثباته الحيوي 26 ، والتوافق الحيوي 27،28 ، ونفاذية الغاز 29،30 ، ومعامل المرونة القابل للضبط 31. يسمح هذا الجهاز المكون من طبقتين بنمو الحيوانات ذات الإمدادات الغذائية المستمرة في قناة الموائع الدقيقة ومحاصرة C. elegans الفردية عبر ضغط غشاء PDMS باستخدام غاز النيتروجين. هذا الجهاز هو امتداد للجهاز المنشور سابقا مع ميزة زراعة وتصوير نفس الحيوان في القناة الدقيقة تحت إمدادات غذائية مستمرة3. تتيح شبكة غشاء العزل الإضافية وغشاء الاصطياد بعرض 2 مم تثبيت الحيوانات النامية بكفاءة. تم استخدام الجهاز لمراقبة تطور الخلايا العصبية ، وتطور الفرج ، والتشجير الشجيري في الخلايا العصبية الحسية PVD. تنمو الحيوانات دون آثار صحية ضارة في الجهاز ويمكن تجميدها بشكل متكرر لتسهيل تصوير الأحداث دون الخلوية في نفس الحيوان أثناء تطوره.

ينقسم البروتوكول بأكمله إلى خمسة أجزاء. يصف الجزء 1 تصنيع الجهاز لشريحة النمو والتصوير. يصف الجزء 2 كيفية إعداد نظام ضغط لانحراف غشاء PDMS لشل حركة وعزل C. elegans الفردية. يصف الجزء 3 كيفية مزامنة C. elegans على لوحة وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) لتصوير الجهاز. يصف الجزء 4 كيفية تحميل واحد في الجهاز وتنمية الحيوان داخل جهاز الموائع الدقيقة لعدة أيام. يصف الجزء 5 كيفية شل حركة فردي في نقاط زمنية متعددة ، والتقاط صور عالية الدقة باستخدام أهداف مختلفة ، وتحليل الصور باستخدام فيجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع جهاز النمو والتصوير

  1. تصنيع قوالب SU8
    1. أنماط التصميم 1 (طبقة التدفق) و 2 (طبقة التحكم) باستخدام أشكال مستطيلة في برنامج معالجة النصوص (أو برنامج CAD للتصميم بمساعدة الكمبيوتر) وطباعة الأقنعة الضوئية بمساعدة راسمة ليزر بحد أدنى لحجم الميزة 8 ميكرومتر على فيلم قائم على البوليستر (الشكل 1).
    2. قطع رقائق السيليكون في قطع 2.5 سم × 2.5 سم وتنظيفها بنسبة 20٪ KOH لمدة 1 دقيقة. شطف الرقائق في الماء منزوع الأيونات (DI). استخدم رقاقة واحدة لكل من التدفق وطبقة التحكم.
      تحذير: KOH مادة أكالة ويجب التعامل معها بحذر.
    3. جفف القطع بغاز النيتروجين المضغوط 14 رطل / بوصة مربعة متبوعا بالجفاف على طبق ساخن عند 120 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قبل المتابعة إلى الخطوة التالية ، قم بتبريد القطعتين إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. خذ إحدى قطع السيليكون وضعها على ظرف طلاء الدوران وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية لتثبيت الرقاقة في مكانها. على قطعة السيليكون ، ضع ~ 20 ميكرولتر من سداسي ميثيل ديسيلان (HMDS) وقم بتغطيته باستخدام طبقة الدوران عند 500 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لمدة 5 ثوان متبوعة ب 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
      تنبيه: يجب تنفيذ هذه الخطوة في الضوء الأصفر. لا تستخدم الضوء الأبيض في الغرفة.
    5. للحصول على سمك موحد مقاوم للضوء يبلغ ~ 40 ميكرومتر (خاص بطبقة التدفق ؛ مناسب لتصوير اليرقات المبكرة من المرحلة 1 إلى المرحلة 3 (L1 - L3)) ، قم بتغطية رقاقة السيليكون ب ~ 1.5 مل من مقاومة الضوء السلبية -1 باستخدام طبقة تدور عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان متبوعة ب 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    6. كرر الخطوتين 1.1.4 و 1.1.5 مع الرقاقة الثانية للحصول على سمك موحد مقاوم للضوء يبلغ ~ 40 ميكرومتر خاص بطبقة التحكم.
    7. بدلا من ذلك ، لزيادة سمك طبقة التدفق إلى ~ 80 ميكرومتر للحيوانات الأكبر سنا ، قم بتغطية رقائق السيليكون ب ~ 1.5 مل من المقاومة الضوئية السلبية -2 باستخدام طبقة الدوران عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان متبوعة ب 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. هذه السماكة مناسبة لمرحلة L3 للحيوانات البالغة.
      تنبيه: أمسك رقائق السيليكون من جوانبها لتجنب أي ضرر للطبقات المطلية بالدوران. أبق الأضواء البيضاء مطفأة أثناء هذه الخطوة.
    8. تخبز قطع السيليكون المطلية بالمقاومة للضوء (لطبقات التدفق والتحكم) على طبق ساخن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تبريد القطع المخبوزة إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تخزين قطع السيليكون المخبوزة لمدة يوم واحد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. تخزينها في الظلام ولا تعرض للضوء الأبيض.
    9. ضع قطع السيليكون المخبوزة ناعما في مرحلة التعرض لمصباح الأشعة فوق البنفسجية مع السطح المطلي بمقاومة الضوء الذي يواجه مصباح الأشعة فوق البنفسجية. قم بتعريض القطعتين بشكل منفصل للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية ، باستخدام مصباح 200 واط ، من خلال قناع ضوئي بأنماط 1 و 2 للحصول على طبقات التدفق والتحكم ، على التوالي.
      تنبيه: ارتد نظارات واقية وتجنب التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية. لا تقم بتشغيل الضوء الأبيض في الغرفة خلال هذه المرحلة.
    10. تخبز قطعتا السيليكون المكشوفتان بطبقة مغلفة متجهة لأعلى ، عند 65 درجة مئوية تليها 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 10 دقائق على التوالي. قم بتبريد القطع إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    11. قم بتطوير الأنماط عن طريق نقع قطع السيليكون في محلول المطور المقاوم للضوء (تخفيف 1: 3 للمطور في الأيزوبروبانول) لمدة 20 دقيقة. بمجرد أن يصبح النمط مرئيا ، اشطف القطع بكحول أيزو بروبيل النقي (IPA) وجففها برفق باستخدام غاز النيتروجين (14 رطل / بوصة مربعة).
      تنبيه: استخدم بيئة جيدة التهوية لهذه المعالجة الكيميائية لتجنب التعرض البشري. استخدم الضوء الأبيض فقط بعد تطوير الميزات وشطفها باستخدام IPA.
    12. احتفظ بقطع السيليكون في مجفف مع توجيه السطح المطلي لأعلى. قم بتعريض القطع لأبخرة السيلان عن طريق سكب 50 ميكرولتر من ثلاثي كلورو النقي (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على كوب بلاستيكي صغير أو شريحة زجاجية. ضع الكوب / الشريحة داخل مجفف واحتضانها لمدة 2 ساعة.
      تنبيه: تجنب التعرض المباشر لبخار السيلان. استخدم دائما غرفة محكمة الغلق لمعالجة بخار السيلان.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين قطع السيليكون المطورة لمدة 1-2 أيام قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  2. تصنيع رقاقة PDMS
    1. اصنع PDMS في كوب بلاستيكي عن طريق خلط قاعدة المطاط الصناعي مع عامل المعالجة بنسبة 10: 1. اخلطي المحتويات جيدا عن طريق التحريك المستمر لمدة 3 دقائق. سيخلق الخلط الكثير من فقاعات الهواء في مزيج PDMS.
    2. قم بإزالة غاز PDMS المزيج في مجفف لمدة 30 دقيقة لإزالة جميع فقاعات الهواء.
      تنبيه: تأكد من إزالة فقاعات الهواء من مزيج PDMS قبل سكبها على الميزات لأن الفقاعات يمكن أن تسبب أجهزة معيبة وغير وظيفية.
    3. ضع رقائق السيليكون مع طبقة التحكم (النمط 2) في طبق بتري. صب برفق طبقة خلط PDMS بسمك 5 مم على قطعة السيليكون لتجنب أي تشكيل فقاعة.
    4. قم بإزالة مزيج PDMS في مجفف لإزالة الفقاعات الإضافية التي تتشكل أثناء عملية صب PDMS.
    5. ضع رقاقة السيليكون مع طبقة التدفق (النمط 1) على ظرف الدوار مع تطبيق ضغط فراغ 200-500 mTorr لتثبيت الرقاقة. صب ~ 1 مل من PDMS على رقاقة السيليكون وقم بتغطيتها باستخدام طبقة تدور عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان متبوعة ب 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للحصول على طبقة سميكة ~ 80 ميكرومتر.
    6. اخبز رقاقتي السيليكون مع PDMS المطلي بالدوران وطبقات PDMS المصبوبة عند 50 درجة مئوية في فرن حراري بالهواء الساخن لمدة 6 ساعات. بعد الخبز ، انتظر حتى تبرد القطع في درجة حرارة الغرفة.
    7. اقطع طبقة PDMS بسمك 5 مم من قطعة السيليكون حول طبقة التحكم (النمط 2) باستخدام شفرة حادة وقشرها من ركيزة السيليكون.
    8. قم بثقب فتحتين بقطر ~ 1 مم باستخدام مثقاب هاريس في خزان كتلة PDMS لتوصيل قناة التثبيت ومداخل قناة العزل بخطوط الغاز لانحرافات غشاء PDMS.
    9. ضع قطعة السيليكون مع طبقة PDMS المطلية بالدوران على النمط 1 (طبقة التدفق) ، مع توجيه السطح المطلي ب PDMS لأعلى ، على صينية بلاستيكية. احتفظ بكتلة PDMS المثقوبة بالنمط 2 (طبقة التحكم) على الدرج بحيث يكون الجانب المصبوب متجها لأعلى.
    10. احتفظ بالدرج البلاستيكي داخل منظف البلازما وعرض سطحي PDMS لبلازما هواء 18 واط لمدة 2 دقيقة تحت فراغ منخفض (200-600 mTorr). ضع الفراغ حتى تتحول الغرفة إلى اللون البنفسجي الفاتح. نفذ هذه الخطوة تحت الإضاءة المنخفضة لرؤية تغير لون البلازما.
    11. أخرج الكتلتين المعالجتين بالبلازما واربط الكتل برفق عن طريق الضغط على الأسطح المعالجة بالبلازما للنمطين 1 و 2 معا. تخبز الأنماط المستعبدة عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في فرن حراري بالهواء الساخن.
    12. أخرج الجهاز المستعبدين من الفرن. اقطع الجهاز المستعبدين من رقاقة السيليكون بالنمط 1 والنمط 2 ، وقم بعمل ثقوب في خزانات مدخل ومخرج طبقة التدفق باستخدام أداة ثقب Harris.
    13. ضع كتلة PDMS المستعبدة بحيث تكون طبقة التدفق متجهة لأعلى على صينية بلاستيكية. احتفظ بغطاء زجاجي نظيف (# 1.5) على نفس الدرج. تعريض الكتل وغطاء الزجاج إلى 18 واط بلازما الهواء لمدة 2 دقيقة. اضبط ضغط الفراغ لرؤية غرفة بنفسجية.
      ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة في الإضاءة المنخفضة لرؤية تغير لون البلازما. لتنظيف غطاء الزجاج ، اغسله باستخدام IPA وجففه باستخدام غاز النيتروجين عند 14 رطل / بوصة مربعة.
    14. ضع كتلة PDMS المكشوفة للبلازما فوق غطاء الزجاج واخبز الهيكل المستعبدين في فرن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. قم بتخزين الجهاز في غرفة نظيفة لأي تجربة مستقبلية.

2. PDMS غشاء فتيلة

  1. خذ الجهاز وضعه على مجهر مجسم وقم بتوصيل الأنابيب. قم بتوصيل الأنبوب المرن الصغير (القطر الداخلي ~ 5 مم ، القطر الخارجي ~ 8 مم) بخط غاز النيتروجين المضغوط في أحد طرفيه. قم بتوصيل موصل ثلاثي الاتجاهات على الطرف الآخر. سيتم توصيل الأنابيب 1 و 2 من الموصلات ثلاثية الاتجاهات بالمصيدة والأغشية العازلة ، على التوالي.
  2. قم بتوصيل أنبوبين مرنين صغيرين (القطر الداخلي ~ 1.6 مم ، القطر الخارجي ~ 5 مم) بمنفذي مخرج محبس ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوبين بإبرة بطول 8 مم 18 جم.
  3. املأ طبقة التدفق بمخزن M9 باستخدام ماصة صغيرة عبر منفذ المدخل. املأ كلا الأنبوبين بماء DI من خلال النهاية المتصلة بالإبرة. أدخل الإبرتين في الثقوب المثقوبة ، وربط غشاء العزل والحصار ، على التوالي.
  4. افتح منظم غاز النيتروجين عند 14 رطل / بوصة مربعة وقم بتدوير الصمام ثلاثي الاتجاهات من الأنبوب 1 لدفع الماء إلى الجهاز عبر قنوات الموائع الدقيقة في طبقات التحكم وهي أغشية المصيدة والعزل.
  5. انتظر حتى يملأ الماء القناة دون وجود أي قطرة هواء في كلتا القناتين. بمجرد ملء القنوات بالكامل بالماء ، تعتبر القنوات جاهزة.
  6. حرر الضغط باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات بمجرد ملء القنوات بالماء وتجهيزها. يمكن أن يؤدي التحضير إلى فقاعات في طبقة التدفق ، وإزالة الفقاعات عن طريق تدفق وسائط إضافية عبر قناة التدفق.

3. C. صيانة وتزامن ايليجانس

ملاحظة: سلالات C. elegans: استخدمت الدراسة الجينات المحورة التالية PS3239 (dpy-20 (e1282) syIs49 IV [MH86p (dpy-20 (+) + pJB100 (ZMP-1::GFP)]) لتطور الفرج 32 ، jsIs609 (mec7p :: MLS (إشارة توطين مصفوفة الميتوكوندريا) ::GFP) 33 لتطوير الخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات اللمس (TRN) وتصوير نقل الميتوكوندريا ، و wdIs51 (F49H12.4::GFP + unc-119 (+)) لتتبع تطور PVD 34. تم اتباع بروتوكول الاستزراع والصيانة القياسي C. elegans 35.

  1. تنمو C. elegans على وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) لوحات بتري مع E. coli OP50 كمصدر للغذاء عند 22 درجة مئوية. حافظ على سلالات C. elegans عن طريق نقل عدد قليل من الخنثى بشكل متكرر أو تقطيع كمية صغيرة من الآجار مع عدد قليل من الحيوانات إلى صفيحة NGM جديدة مع عشب OP50.
  2. بعد 3-5 أيام ، تحقق من لوحة NGM لنمو الحيوانات وبيض C. elegans. اجمع وانقل ما يقرب من 30 بيضة من طبق إلى طبق NGM طازج مع عشب OP50.
  3. لمزامنة الحيوانات للتصوير ، انقل جميع البيض غير المفقس من الطبق كل 2 ساعة إلى طبق طازج واحتفظ به عند 22 درجة مئوية. سوف يفقس ما يقرب من 15-20 بيضة على كل طبق.
  4. اختر الحيوانات بين 14-16 ساعة و 28-30 ساعة بعد الفقس لمراحل اليرقات 2 (L2) واليرقات 3 (L3) ، على التوالي. نقل الحيوانات إلى جهاز الموائع الدقيقة للتصوير. أضف الإمدادات الغذائية كما هو موضح في القسم التالي للحفاظ على الحيوان داخل الجهاز للنمو على المدى الطويل وتجارب التصوير.

4. نمو C. elegans داخل جهاز النمو والتصوير الموائع الدقيقة

  1. قم بتركيب جهاز موائع دقيقة للنمو والتصوير على مجهر مقلوب وعرض النمط 2 ، بعد توصيل أغشية العزل وغشاء التثبيت ، بتكبير منخفض (4x أو 10x). تأكد من ملء القنوات بالماء المقطر النظيف.
  2. تحضير محلول جديد سعة 1 لتر من وسط S باستخدام 10 مل من 1 M سترات البوتاسيوم درجة الحموضة 6.0 ، 10 مل من محلول المعادن النزرة ، 3 مل من 1 M CaCl2 ، 3 مل من 1 M MgSO4. تحضير الحل في ظل ظروف معقمة. لا الأوتوكلاف المتوسطة S.
  3. املأ قناة التدفق بوسائط النمو (S المتوسطة) قبل 10 دقائق من التجربة. تجنب أي فقاعات هواء في قناة التدفق. تدفق وسيط إضافي إذا لزم الأمر لإزالة فقاعات الهواء.
  4. اختر حيوانا واحدا من مرحلة النمو المطلوبة من لوحة NGM في 10 ميكرولتر من وسط S باستخدام ماصة دقيقة وادفع الحيوان إلى قناة التدفق عبر فتحة المدخل.
  5. راقب موضع الحيوان في قناة التدفق باستخدام هدف تكبير منخفض. تدفق وسيط إضافي عبر المدخل أو المخرج لدفع الحيوان ووضعه داخل قناة التدفق المقيدة بين غشاءي العزل.
  6. افتح المحبس ثلاثي الاتجاهات لتطبيق ضغط 14 رطل لكل بوصة مربعة في قنوات العزل وادفع الأغشية لأسفل في قناة التدفق.
    ملاحظة: يغلق الغشاء جزئيا قناة التدفق ويقيد حركة الحيوانات إلى المنطقة الواقعة بين غشاءي العزل.
  7. استخدم مستعمرة واحدة من E. coli OP50 من صفيحة مخططة لتلقيح 250 مل من مرق L (2.5 جم باكتو تريبتون ، 1.25 جم خميرة باكتو ، 1.25 جم كلوريد الصوديوم في H2O). تنمو الثقافة الملقحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
  8. حاصل 500 ميكرولتر من ثقافة OP50 في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 مل وتخزين المخزون والقسمة لمدة أسبوعين عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بتقطيع ثقافة OP50 عن طريق الطرد المركزي بمعدل 1.3 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإذابة الحبيبات ب 1 مل من وسط S الطازج (تخفيف 0.5x) وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أيام. استخدم OP50 المخفف لتغذية C. elegans داخل أجهزة الموائع الدقيقة.
  10. اترك قطرة من وسط S أعلى خزانات المدخل والمخرج لتقليل تبخر الوسط S في قناة التدفق.
  11. خذ محلول OP50 المخفف في ماصة دقيقة 10 ميكرولتر. قم بإزالة الطرف الصغير المملوء بمحلول OP50 من الماصة واضغط على الطرف في خزان المدخل. ثم ضع طرف ماصة صغير آخر مع 10 ميكرولتر من محلول الطعام وأدخله في خزان المخرج.
  12. أغلق رأس الطرف بالضغط باستخدام إصبع لضمان استمرارية المحاليل الغذائية دون أي فجوة هوائية. قم بتغيير طرف الماصة الدقيقة بمحلول OP50 كل يوم لا يزيد عمره عن 3-4 أيام.
  13. املأ 20-30 ميكرولتر إضافية من محلول الطعام في كلا النصيحتين. أضف أو أزل محلول الطعام من وإلى طرف الماصة الدقيقة لضبط التدرج لدفع الحيوان في قناة التدفق ولضبط موضع الحيوان تحت غشاء الاصطياد للتصوير.
  14. راقب تدفق البكتيريا للتأكد من استمراره عبر أغشية العزل المغلقة جزئيا في قناة التدفق باستخدام صور المجال الساطع.
    ملاحظة: في حالة عدم تدفق البكتيريا ، قد تأكل الحيوانات البكتيريا المتاحة في قناة التدفق بين غشاءي العزل. في حالة عدم وجود بكتيريا أو عدم وجود تدفق في القناة ، استبدل طرفي الماصة الدقيقة عند المدخل والمخرج بأطراف ماصة جديدة مملوءة بإمدادات غذائية طازجة.

5. C. تجميد ايليجانس والتصوير

  1. C. تجميد elegans تحت غشاء الاصطياد
    1. حدد موقع واحد في قناة النمو بتكبير منخفض. اضبط ارتفاعات محلول الطعام في طرفي الماصة الدقيقة المتصلين بخزانات المدخل والمخرج. ادفع الحيوان في الاتجاه المطلوب باستخدام اختلافات الضغط الهيدروستاتيكي في قناة التدفق.
    2. ضع الحيوان في مركز غشاء الاصطياد وراقب سلوك السباحة باستخدام هدف تكبير منخفض (4x).
    3. أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لزيادة الضغط في قناة المصيدة ببطء. شل حركة الحيوان تحت غشاء المصيدة في وضع مستقيم على طول الجدار الحدودي لقناة النمو.
      تنبيه: تجنب محاصرة الحيوان عبر قناة التدفق في وضع الانحناء Z أو U. يؤدي هذا إلى ضغط جسم الحيوان بضغط أكبر ويسبب ضررا دائما لصحته.
  2. تصوير C. elegans وإطلاقها من الغشاء
    1. احمل الجهاز وقم بتحميله على مرحلة المجهر. قم بإعداد مجهر مقلوب في إعدادات التصوير المطلوبة مع جميع المكونات البصرية الضرورية (الهدف ، ومصدر الضوء ، ومرشحات التألق ، وكاشف) للمجال الساطع عالي الدقة ، أو تباين التصوير التفاضلي (DIC) ، أو التصوير الفلوري (الشكل التكميلي 1).
    2. احصل على صورة مضان بفاصل زمني واحد أو عدة صور لالتقاط الأحداث الخلوية وشبه الخلوية.
    3. الحصول على صور مضان للخلايا العصبية C. elegans كدالة لتطورها باستخدام هدف 60x ، 1.4 فتحة عددية (NA) ، ليزر بطول موجة 488 نانومتر مع طاقة ليزر 7٪ -10٪ ، كاميرا CCD ، على مجهر قرص دوار. قم بإجراء تصوير الفاصل الزمني باستخدام البرنامج المزود بالمجهر واحصل على صور بسرعة 4 إطارات في الثانية (الشكل التكميلي 1).
    4. بعد الحصول على الصور ، حرر ضغط الاصطياد وراقب حركة الحيوان بتكبير منخفض - 4x و 10x. حافظ على تقييد الحيوان داخل المنطقة المحددة عن طريق عزل الأغشية (أبقى أقل من 14 رطل / بوصة مربعة طوال التجربة).
    5. اضبط حجم محلول الطعام في طرفي الماصة الدقيقة لمواصلة تدفق الطعام البطيء المدفوع بالجاذبية في قناة النمو. يتم الحصول على تدفق الطعام هذا عن طريق ضبط مستويات المحاليل الغذائية في الماصات الدقيقة عند المدخل والمخرج (عادة فرق الارتفاع 1-5 مم).
    6. تصور التدفق تحت مجال ساطع من نمط تدفق البكتيريا في قناة النمو.
      ملاحظة: في حالة عدم وجود تدفق ، يأكل الحيوان بكتيريا OP50 المتاحة ، وتظهر القناة واضحة ، ويتضور الحيوان جوعا على مدى بضع ساعات. عادة ما يصاب الحيوان الجائع بتألق ذاتي عالي ، يمكن ملاحظته بسهولة عند الحصول على صور مضان بفاصل زمني. مثل هذه الأحداث لها آثار ضارة على فسيولوجيا الحيوان وتم تجنبها في التجارب.
    7. كرر الخطوات 5.2.1-5.2.3 بعد فاصل زمني محدد مسبقا للحصول على صور مضان / مدينة دبي للإنترنت / المجال الساطع لنفس الفرد في نقاط زمنية متعددة.
    8. بعد الحصول على الصور في نقاط زمنية متعددة مرغوبة من نفس الحيوان الفردي ، حرر ضغط العزل والمحاصرة. اغسل القناة بمخزن M9 وادفع الحيوان عبر خزان المدخل. استرجع الحيوان من الخزان وضع الحيوان على طبق NGM جديد لمزيد من المراقبة الصحية.
    9. اغسل القناة بالمخزن المؤقت M9 عدة مرات لإزالة البكتيريا. شطف قناة التدفق مع 70 ٪ من الكحول الإيثيلي (المخفف في الماء المقطر). جفف القنوات عن طريق دفع الهواء باستخدام حقنة. قم بتخزين الجهاز في مكان جاف خال من الغبار للاستخدام المتكرر في المستقبل.
  3. تحليل الصور والإحصاءات
    1. استخدم برنامج FIJI ImageJ لتحليل الصور. افتح صور tiff لصور الفاصل الزمني PVD من wdIs51 في فيجي ImageJ. استخرج أفضل المستويات من مكدس طائرات z التي تعرض العمليات الأساسية عن طريق تحديد علامة التبويب صورة > مكدسات > مشروع Z.
    2. افحص سلسلة الصور بأكملها وابحث عن إطارات صور محددة تغطي بنجاح العمليات العصبية بأكملها باستخدام أقسام متداخلة من إطارات صور الحيوانات. حدد المكون الإضافي > تحليل عداد الخلايا > من شريط أدوات فيجي. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة لترقيم الفروع المختلفة والاحتفاظ بعدد كل خلية عصبية مختارة.
    3. حدد تهيئة عدادات > > Type1، ثم حدد الفروع الثانوية. ثم حدد النوع 2 ووضع علامة رباعي ، انقر فوق النتائج نافذة تعرض أعداد جميع الفروع (الشكل التكميلي 2). ستعرض هذه الطريقة الفروع التي تم حسابها بالفعل.
    4. افتح الصورة المتداخلة التالية وعد الفروع المتبقية. ستمنع هذه العملية العد المزدوج وتضمن حساب كل عملية. تحديد وحساب العدد الإجمالي للفروع الأولية الموجودة في المراحل اليرقية المبكرة من C. elegans. إجراء تحليل مماثل للصور للعمليات الثانوية والرباعية في الحيوانات الأكبر سنا.
      ملاحظة: يظهر البالغون العديد من العمليات التي تعصب عضلات جدار الجسم ويمكن أن يكون من الصعب عدها. تأكد من حساب كل عملية مرة واحدة فقط.
    5. احسب المسافة بين أجسام خلايا PVD في wdIs51 عن طريق رسم خط مجزأ من جسم خلية PVD (CB) إلى PVC CB. بالنسبة لحيوانات المرحلة 4 (L4) ، تكون أجسام الخلايا متباعدة وليست في نفس الإطار عند تصويرها بهدف 60x.
    6. حدد الصور المتداخلة من المكدس لتغطية طول الحيوان بالكامل من الرأس إلى الذيل باستخدام علامة تبويب الصورة > مشروع Stacks > Z من ImageJ. ارسم خطوطا مجزأة على طول العملية العصبية بين PVD و PVC CBs.
    7. قم بقياس أطوال كل الخطوط المجزأة باستخدام ImageJ > تحليل > قياس. أضف أطوال جميع الأجزاء لحساب المسافة الإجمالية بين PVD و PVC CBs لكل نقطة زمنية.
    8. بالنسبة لطول الخلايا العصبية ل TRNs في jsIs609 ، قم بتحميل الصور في فيجي. ارسم خطا مجزأ على طول الأنابيب الدقيقة الجانبية الخلفية (PLMs ؛ مرئية مع GFP القابل للذوبان) من جسم الخلية إلى النقطه الوسطى للميتوكوندريون الأول. احسب طول الخط لقيمة المسافة الأولى.
    9. ارسم خطا مجزأ من مركز الميتوكوندريا الأول إلى الثاني. كرر هذه العملية لكل زوج من الميتوكوندريا حتى نهاية طول العملية العصبية. أضف كل الأطوال لحساب إجمالي طول العملية العصبية.
    10. لتحليل نسب الخلية ، قم بتحميل جميع صور الفرج في فيجي واستخرج أفضل صورة تركيز للخلايا من صور الفاصل الزمني لطائرات z المتعددة.
    11. تمثيل البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). احسب الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه لأكثر من عينتين أو اختبار t لعينتين لزوج من العينات. تشير إلى الأهمية بالقيمة p < 0.05 (*) ، والقيمة p < 0.005 (**) ، والقيمة p > 0.05 (ns ، ليست مهمة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف الجهاز: يتكون جهاز النمو والتصوير من طبقتين PDMS مرتبطتين معا (الشكل 1) باستخدام رابطة بلازما لا رجعة فيها. تسمح لنا طبقة التدفق (النمط 1) التي يبلغ طولها 10 مم وارتفاعها 40 ميكرومتر أو 80 ميكرومتر بزراعة الحيوان في الثقافة السائلة (الشكل 1 أ). تحتوي طبقة الاصطياد (النمط 2) على غشاء بعرض 2 مم (الشكل 1B) لشل حركة الحيوان للتصوير عالي الدقة. يخلق قناع طبقة الاصطياد أيضا زوجا من أغشية العزل لتقييد حركة الحيوانات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة ، تم وصف بروتوكول لتصنيع واستخدام جهاز الموائع الدقيقة البسيط لزراعة C. elegans مع إمدادات غذائية ثابتة وتصوير عالي الدقة لحيوان واحد أثناء تطوره. عملية التصنيع هذه بسيطة ويمكن إجراؤها في بيئة غير معقمة. تعد البيئة الخالية من الغبار أمرا بالغ الأهمية أثناء خطوات التصنيع. قد يؤدي وجود جزيئات الغبار إلى اتصال غير صحيح بين سطحي الترابط ، مما يؤدي إلى ضعف الترابط وتسرب الجهاز أثناء تطبيق الضغط العالي أثناء تجميد C. elegans. من بين جميع الأجهزة المصنعة ، 95٪ من الأجهزة مناسبة للتجارب. يفشل عدد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. و S.P.K. هما مؤلفا براءة اختراع معلقة على جهاز نمو الموائع الدقيقة والتصوير (طلب براءة الاختراع رقم 640 / CHE / 2011).

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مرفق التصوير CIFF ، NCBS لاستخدام المجاهر متحدة البؤر التي يدعمها DST - مركز تكنولوجيا النانو (No. SR/55/NM-36-2005). نشكر تمويل الأبحاث من DBT (SPK) ، CSIR-UGC (JD) ، DST (SM) ، DBT (SM) ، قرص الغزل المدعوم من DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK و Gautam Menon) ، ورقم منحة HHMI-IECS 55007425 (SPK). تم توفير سلالات HB101 و PS3239 و wdIs51 من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). صنع SPK jsIs609 في مختبر مايك نونت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
18 إبر GSigma-Aldrich ، بنغالور ، الهندمقياس 18
محبس ثلاثي الاتجاهاتCole-ParmerWW-30600-02تركيب Masterflex مع قفل لور
كاميرا CCDAndor TechnologyEMCCD C9100-13no
فيلم لوحةالدوائر Fine Line Imaging ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكيةتتم طباعة التصاميم ب 65،024 نقطة في البوصة (DPI)
فرن الحملMeta-Lab الصناعات العلمية ، الهندMSI-5
Coverslipsغطاء مجهري22 مم × 10 جرام
إيثانولمرحبا وسائل الإعلام
هاريس المثقاب أحادي النواة 1 ممQiagenZ708801
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich ، بنغالور ، الهند440191
لوحةساخنة  IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
Laser Scanning MicroscopeZEISSLSM 5 LIVE
Micropipette TipsTarsons0.5-10 & micro ؛ تستخدم أطراف الماصات الدقيقة L للإمدادات
الغذائية السلبي Microresist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
سلبي مقاوم للضوء -2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
غاز النيتروجينالمورد المحلي حجمأسطوانة غاز النيتروجين التجاري7 متر
مكعب PDMS (محلول معالجة)شركة داو كورنينج ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية  ؛ سيلجارد علاج محلولعلاج عامل
بتري لوحاتبرافين العلمية كوربوريشن
منظف البلازماهاريك بلازما ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية  ؛ PDC-32G
ماكينة حلاقة وشفرات ليسترشفرة
مطاط من السيليكون (قاعدة)شركة داو كورنينج كورنينج ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيلجارد 184 قاعدةقاعدة مطاطية
أنابيب فيشر العلميةالبلاستيكية بقطر داخلي 1.59 مم والقطر الخارجي 3.18 مم
رقاقة السيليكونجامعة ويفر ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية[100] الاتجاه ، 4 بوصة القطرصغيرة (2 مم ومرات ؛ 2 مم) تم قطعها من رقاقة قطرها 100 مم
Spin CoaterSPS-Europe BV ، مجهر قرص الغزل الهولنديSPIN 150
Perkin Elmer نظام VOX فائق الرؤيةCSU-X1-A3 Nتم تجهيز النظام بأربعة ليزر (405/488/561/640 نانومتر) وتم التحكم فيه باستخدام حزمة برامج Volocity.
مطور SU8Microchem ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةSU8 المطور
Trichloro (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silaneSigma-Aldrich ، بنغالور ، الهند448931Trichloro (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) بخار السيلان هو
مصباح الأشعة فوق البنفسجيةOriel Instruments ، بنغالور ، الهند200 واط ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية الموازاة
VolocityPerkin-ElmerImage تحليل
الحراري أزرق جراحية أنابيب سيليكون ذات قطع السام برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037(2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023(2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530(2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192(2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500(2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499(2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansLong Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

مقالات ذات صلة