Method Article

الكشف عن Epitopes الحساسة للتحييد في المستضدات المعروضة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP) المستندة إلى اللقاحات باستخدام م المقايسة التقاط

DOI:

10.3791/63137

⸱

February 10th, 2022

 ,  , 
1Research Group Pharmaceutical Biotechnology, TH Köln - University of Applied Sciences, 2Institute of Technical Chemistry, Leibniz University Hannover

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا للكشف عن إزالة الأسطح المحايدة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تعرض المستضدات (VLPs). يتم إجراء التكاثر المناعي لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) المشتقة من VLPs باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالجظرات المظروفة إلى جانب الخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G. يتم إخضاع VLPs الملتقطة في وقت لاحق إلى SDS-PAGE والتحليل الغربي لللطخة باستخدام الأجسام المضادة للبروتين الأساسي الفيروسي Gag-specific.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLP) التقاط المقايسة هو أسلوب المناعة، والمعروفة باسم "المقايسة المنسدلة" المستخدمة لتنقية وعزل VLPs عرض مستضد سطح الأجسام المضادة الخاصة بالمستضدات تقترن، وبالتالي شلت على مصفوفة صلبة وغير قابلة للحل مثل الخرز. نظرا لتقاربها العالي مع المستضد المستهدف ، يمكن لهذه الأجسام المضادة التقاط VLPs مزينة مستضد cognate الراسية في مغلف غشاء VLPs. يصف هذا البروتوكول ربط الأجسام المضادة الخاصة بالمضاد للبروتين A- أو G-الخرز المغناطيسي المترافق. في دراستنا، يتم فحص فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) المشتقة من VLPs التي شكلتها مستضد مجموعة محددة (Gag) البروتين السلائف الأساسية الفيروسية p55 Gag وعرض البروتينات الجليكوبروتين المغلف (Env) من فيروس نقص المناعة البشرية. يتم التقاط VLPs باستخدام الأجسام المضادة المحايدة على نطاق واسع (bNAbs) الموجهة ضد epitopes الحساسة للتحييد في Env. يمثل فحص التقاط VLP المبين هنا طريقة حساسة وسهلة الأداء لإثبات أن (1) تم تزيين VLPs بالمستضد المستهدف المعني ، (2) احتفظ المستضد السطحي بسلامته الهيكلية كما يتضح من الربط الخاص ب bNAbs المستخدم في المقايسة و (3) السلامة الهيكلية ل VLPs التي كشف عنها الكشف عن بروتينات Gag في تحليل لطخة غربي لاحق. وبالتالي، فإن استخدام ال bNAbs للوقاية المناعية يسهل التنبؤ بما إذا كانت لقاحات VLP ستكون قادرة على الحصول على استجابة خلايا B المحايدة لدى البشر الملقحين. ونتوقع أن يزود هذا البروتوكول الباحثين الآخرين بنهج تجريبي قيم ومباشر لدراسة اللقاحات المحتملة القائمة على VLP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشبه الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) بنية جزيئات الفيروس الأصلية بينما تفتقر إلى الجينوم الفيروسي ، مما يوفر صورة أمان عالية1،2. وتمثل اللقاحات المضادة للأفراد فئة فردية من اللقاحات التي تتطور بصورة متزايدة بسبب ارتفاع مستوى المناعة فيها3,4,5,6,7. هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة لVLPs المغلفة بالغشاء ، مما يسمح بعرض مستضدات سطحية فيروسية متجانسة ليس فقط ولكن أيضا مستضدات heterologous مثل مستضدات الورم8،9،10. الشكل 1 يقدم لمحة عامة مثالية عن هيكل VLP المغلفة مستضد مزينة. خلال عملية تطوير اللقاحات القائمة على VLP ، لا غنى عن المقايسات التي تمكن من تحليل المستضد المستهدف المعني المعروض على سطح VLP. وينبغي أن تكون هذه المقايسات مفيدة لتوضيح تكوين لقاح الجسيمات: '1' هل المصابيح المزينة بالمضاد السطحي المعني؟ '2' هل احتفظ المستضد السطحي بهيكله الأصلي كما يتضح من الاعتراف بالأجسام المضادة المحايدة (bNAbs) و(3) هل يمكن تأكيد السلامة الهيكلية للأجسام ذات الأجسام المضادة للفلوروس بسبب الكشف عن البروتين الفيروسي الذي يتوسط في تكوين VLP؟

figure-introduction-1
الشكل 1: رسم تخطيطي ل VLP مغلف بالغشاء. تتكون VLPs من البروتينات الأساسية السلائف Gag غير ناضجة وتحيط بها غشاء الدهون المستمدة من الخلية المضيفة. يتم دمج المستضدات ، على سبيل المثال ، البروتينات الجليكوبروتين المغلفية ، في الغشاء الدهني وعرضها على سطح VLP (على اليمين). تتعرف الأجسام المضادة الخاصة بالمضاد على المستضد. على اليسار، يظهر VLP أصلع دون زخرفة مستضد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولا سيما VLPs التي شكلتها مجموعة الفيروسية محددة مستضد (Gag) البروتين السلائف الأساسية p55 من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (فيروس نقص المناعة البشرية-1) هي السقالات المفضلة لعرض مستضد في تطوير لقاح والعديد من الأجسام المضادة، ومجموعات ELISA متوفرة، مما يتيح تحديد كمي لهذه VLPs11،12. يتم دمج البروتينات الجليكوبروتين المغلف HIV-1 (Env) ، وهي gp41 بروتين ترانسميمبران (gp41-TM) ووحدة السطح القابلة للذوبان gp120 (gp120-SU) التي تشكل التروديمرات ، في مغلف غشاء الجسيمات وهي مستضدات مستهدفة حاسمة لتطوير لقاحات ضد عدوى فيروس نقص المناعة البشرية13،14،15 . إن عرض الأسطح الحساسة للتحييد في هذه المستضدات المستهدفة هو شرط أساسي للحصول على استجابة للأجسام المضادة لتحييد الأجسام المضادة على نطاق واسع في اللقاحات. وإلى جانب استجابة الخلية التائية الموجهة ضد بروتينات Gag ، يعتبر هذا ارتباطا مهما للحماية من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية16. وبالتالي، وعند تصميم وإنتاج الVLPs المزينة بمرشحات مستضد مستهدفة، يمثل التحليل اللاحق لنوعية المستضدات المعروضة خطوة حاسمة في عملية تطوير اللقاح.

إن التكفير المناعي (IP) هو تقنية تستخدم على نطاق واسع للكشف عن التفاعلات البروتينية البروتينية وتنقية مجمعات البروتين على نطاق صغير17. باريت وآخرون. وقد أبلغ عن تطور الملكية الفكرية لأول مرة في عام 1960، ومع ذلك، فقد تم تحسين هذه الطريقة باستمرار. الملكية الفكرية تمكن من التقاط وعزل مستضد الهدف (فريسة) من الحل عن طريق استخدام الأجسام المضادة الخاصة مستضد (الطعم) شلت عن طريق اقتران إلى الخرز18،19. في هذا البروتوكول، ونحن نظهر الاختلاف من تطبيق الملكية الفكرية الكلاسيكية باستخدام غشاء المغلفة P55 Gag شكلت VLPs كفريسة وbNAbs التي تعترف epitopes حساسة للتحييد في البروتينات المغلف المعروضة على سطح VLPs كبروتينات الطعم. التطبيق الناجح لهذا الفحص التقاط VLP يسهل التنبؤ ما إذا كان اختبار مستضد إيجابية VLPs سوف تكون قادرة على الحصول على استجابة الخلية B تحييد في الأشخاص الذين تم تطعيمهم. وكثيرا ما تظهر هذه الخصائص المناعية لمرشحي اللقاح القائم على VLP في نماذج الحيوانات الصغيرة20,21,22.

من أجل تقييم نوعية المرشح لقاح VLP المطورة حديثا، وقد استخدمت بنجاح مقايسات التقاط VLP5،23،24. ومع ذلك، عدد الأساليب المنشورة محدودة. يبدأ فحص التقاط VLP المعروض هنا بشل حركة bNAbs الخاصة ب Env على حبات البروتين G-المقترنة ، والتي ترتبط بمنطقة Fc للأجسام المضادة المشتقة من الثدييات. المصفوفات النموذجية لشل حركة الجسم المضاد المفضل هي الآغاروز أو الخرز المغناطيسي. ومع ذلك، الخرز المغناطيسي مواتية للتطبيقات عالية الإنتاجية25. في الخطوة التالية، يتم التقاط VLPs عرض مستضد الهدف من قبل الخرز المغلفة bNAb. يتم إثراء المجمعات المناعية المكونة من VLPs إيجابي Env وbNAbs غير المشل الحركة بسهولة باستخدام مغناطيس. يتم تعاويك المجمعات المناعية المعزولة في الخطوة النهائية. في وقت لاحق، يمكن أن تكون مميزة كيميائيا بيولوجيا VLPs. هنا ، قمنا بإجراء تحليل لطخة الغربية توظيف p55 Gag الأجسام المضادة الأساسية الفيروسية البروتين محددة لإثبات أن المستضدات Env الهدف عجلت لم تكن تؤوي فقط epitopes حساسة للتحييد ولكن تم عرضها أيضا على VLPs شكلت هفوة. وعلاوة على ذلك، فإن الكشف عن البروتينات الهفوة الأساسية الفيروسية يزيد من حساسية المقايسة التقاط منذ بروتينات الكمامة هي أكثر وفرة من Env في VLP. في فيروس نقص المناعة البشرية-1، بروتينات Env موجودة فقط في رقم واحد أو رقمين26، في حين أن أكثر من 3500 جزيء Gag تشكل جوهر جسيم27.

بالمقارنة مع التقنيات الأخرى لفحص التفاعلات البروتين البروتين28،29، يوفر اختبار التقاط VLP طريقة بديلة لمختبرات البحوث التي لا يمكن الوصول إلى الأدوات التحليلية باهظة الثمن. على سبيل المثال، يمكن أن يكون التحليل المجهري للإلكترون الإرسالي (TEM) والتنظير الطيفي لرنين البلازمون السطحي (SPR) وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) كثيفة التكلفة. كما يسمح فحص الالتقاط المعروض هنا بالخضوع اللاحق لعينات VLP الملتقطة الموجبة للمضاد لمزيد من توصيف البروتين ، على سبيل المثال ، استخدام الكهروفوريسيس الهلامي ، والمناعة ، والمجهر الإلكتروني ، وقياس الطيف الكتلي (MS) ، على التوالي. وبالنظر إلى أن يتم الحفاظ على الهيكل الأصلي للمضاد الهدف أثناء الفحص التقاط VLP، ويمكن أيضا أن تستخدم أداء PAGE الأصلي وتقنيات immunoblotting اللاحقة.

يمثل اختبار التقاط VLP طريقة سهلة الاستخدام وحساسة لفحص زخرفة VLPs مع مستضدات مستهدفة تعرض الأسطح الحساسة للتحييد ، وبالتالي فائدتها كمرشحين للقاح في المستقبل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد العينة

  1. البذور خطوط الخلية تعليق منتج VLP المستمدة من 293-F الخلايا التي تعبر عن الجينات الهيكلية فيروس نقص المناعة البشرية هفوة وحدها أو بالتنسيق مع env 30 في كثافة خلية منخفضة من 0.5 × 106 خلايا لكل مل في 293-F التعبير المتوسطة.
  2. دعهم يتوسعون لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية و 8٪ من ثاني أكسيد الكربون في دوران حاضنة شاكر بمدار 5 سم و 135 طلقة في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
  3. بيليه الخلايا المنتجة عن طريق الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 5 دقائق. تصفية supernatant أوضح لإزالة الخلايا المتبقية وحطام الخلية باستخدام 0.45 ميكرومتر فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) مرشحات حقنة غشاء للحصول على الخلايا الخالية من الخلايا ثقافة supernatant (CFSN).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين CFSN بين عشية وضحاها عند 4 °C .
  4. إما استخدام CFSN مباشرة للتجربة أو بيليه VLPs من 35 مل من CFSN توظيف الطرد الفائق (112700 × ز، 4 درجة مئوية، 1.5 ساعة).
  5. عند الطرد الفائق، تجاهل supernatant وتعليق الكريات VLP في 200 ميكرولتر من 15٪ (ث / v) محلول تريهالوز في أنبوب الطرد المركزي.
    ملاحظة: غالبا ما لا تكون بيليه VLP مرئية للعين المجردة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين VLPs عند -80 درجة مئوية.
  6. قبل إجراء فحص التقاط VLP، حدد تركيزات البروتين الأساسية الفيروسية في VLP التي تحتوي على عينات باستخدام ELISA. هذه الخطوة مهمة لتوحيد إدخال المقايسة التقاط.

2. VLP التقاط المقايسة

ملاحظة: يتم تصوير نظرة عامة على سير العمل في الشكل 2.

  1. تعليق الخرز المغناطيسي إما pipetting صعودا وهبوطا أو خلط على الدوار في 50 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل.
  2. وفي الوقت نفسه، وإعداد حل الأجسام المضادة التي تحتوي على bNAbs. استخدم 10 ميكروغرام من كل bNAb في 200 ميكرولتر من حاجز ربط الأجسام المضادة وغسلها (انظر جدول المواد) لكل تفاعل.
    ملاحظة: قد تختلف كميات الأجسام المضادة حسب تقارب bNAb وكثافة زخرفة المستضد على VLPs المستخدمة.
  3. استخدام 50 ميكرولتر من محلول حبة المغناطيسي (انظر جدول المواد) لكل رد فعل ونقل الخرز في أنبوب رد فعل 1.5 مل. ضع الأنابيب على حامل الفصل المغناطيسي.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام مغناطيس واحد قوي لكل أنبوب لفصل الخرز عن العملاق.
  4. انتظر بضع دقائق حتى تتجمع الخرز عند جدار الأنبوب لضمان جمع جميع الخرز. أزل الناتنات الفائق.
  5. إزالة المغناطيس وتعليق الخرز في 200 ميكرولتر من الحل bNAb أعدت في الخطوة 2.2. حضانة لمدة 30 دقيقة إلى 3 ساعة خلط على الدوار في 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. ضع أنابيب التفاعل في رف الفصل المغناطيسي مرة أخرى، وانتظر وأزل الناسخ الفائق.
  7. إزالة الأنابيب من المغناطيس وغسل الخرز عن طريق إعادة تعليق في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة ملزمة وغسل العازلة.
  8. كرر الخطوة 2.4. إزالة أكبر قدر ممكن من العازلة الغسيل.
  9. إضافة العينات إلى bNAbs حبة ملزمة.
    ملاحظة: يجب أن يكون إدخال VLP لإجراء فحص الالتقاط باستخدام الجسيمات المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية 15 نانوغرام على الأقل من البروتين الأساسي الفيروسي لكل تفاعل. قد تختلف كميات VLP اعتمادا على تقارب bNAb وكثافة زخرفة المستضد على VLPs المستخدمة.
  10. إذا كان حجم العينة المضافة في الخطوة 2.9 أقل من 1 مل، أضف برنامج تلفزيوني لضبط حجم العينة إلى 1 مل. تعليق الخرز بلطف عن طريق pipetting.
  11. احتضان العينات والخرز لمدة 2.5 ساعة على الدوار في درجة حرارة الغرفة. تأكد من بقاء الخرز في التعليق ويتم خلط الحل تماما أثناء الحضانة.
  12. ضع الأنابيب على المغناطيس وإزالة supernatant.
  13. غسل الخرز المغناطيسي عن طريق تعليقها في 200 ميكرولتر من العازلة الغسيل (انظر جدول المواد). كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
  14. تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من العازلة الغسيل ونقل التعليق إلى نظيفة (مقاومة للحرارة) أنبوب رد فعل.
  15. ضع الأنبوب على حامل الفصل المغناطيسي (انظر جدول المواد) وأزل الناسخة الفائقة تماما.
  16. إعداد عينات SDS-PAGE مهين باتباع الخطوات 2.16.1-2.16.2 أو عينات غير مشوهة عن طريق إزالة VLPs من الخرز المغناطيسي باتباع الخطوات 2.16.3-2.16.5.
    1. لإعداد عينات SDS-PAGE المشوهة، قم بتعليق الخرز في 20-80 ميكرولتر من المخزن المؤقت Laemmli (0.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت Laemmli لكل 1 نانوغرام من مدخلات مقايسة P55 Gag) واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. تابع مباشرة مع SDS-PAGE أو قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية.
      تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت Laemmli على 2-ميركابتوثانول وكبريتات دودسيل الصوديوم. ارتداء قفازات واقية وحماية العين. تجنب ملامسة الجلد والعينين والملابس. لا تستنشق الأبخرة. العمل في مساحة جيدة التهوية، على سبيل المثال، غطاء الدخان.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    3. بدلا من ذلك، قم بإجراء خطوة elution غير الإزالة للحصول على VLPs مع الحفاظ على بنية البروتين الأصلي.
    4. إضافة 25 ميكرولتر من العازلة elution (كثيرا ما تقدم مع الخرز) إلى الخرز المغناطيسي واحتضان لمدة 2-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. إزالة الخرز ونقل eluate إلى أنبوب نظيف. استخدم الإلواتي لإجراء الكحواس اللاحقة أو قم بتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

3. تحليل عينات VLP التي تم التقاطها

ملاحظة: لتحليل VLPs الملتقطة إجراء SDS-PAGE ثم western blot-analysis31,32.

  1. ضع أنابيب العينة على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن المحلول.
  2. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في الآبار الفردية من هلام.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم الكشف عن البروتينات الأساسية الفيروسية P55 Gag باستخدام أجسام مضادة للأرانب متعددة النسيلة موجهة ضد فيروس نقص المناعة البشرية وGIG الثانوي المضاد للأرانب من الدجاج متعدد النسيلة إلى جانب الأجسام المضادة للبيروكسيديز الفجل (HRP). تم تصور البروتينات الأساسية الفيروسية باستخدام الكشف عن الشيميلومينس.

figure-protocol-1
الشكل 2: رسم تخطيطي للخطوات الرئيسية من الفحص التقاط VLP باستخدام الخلايا الخالية من الخلايا. (1) يبدأ فحص التقاط VLP بربط BNAbs HIV-1 بالخرز المغناطيسي G-coupled البروتين. وفي الوقت نفسه، يتم إعداد حل VLP مع تركيز P55 محددة. تتكون الثقافة الخالية من الخلايا من خليط من P55 Gag VLPs وبروتينات الخلايا المضيفة والأحماض النووية. (2) يتم نقل الخرز المغناطيسي إلى جانب bNAbs والحل VLP إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل تليها الحضانة تحت التناوب. (3) يتم التقاط VLPs عرض مستضد من قبل الخرز المغلفة bNAbs. يتم فصل هذه المجمعات المناعية عن الملوثات المشتقة من الخلايا المضيفة في مجال مغناطيسي. (4) تتم إزالة supernatant عن طريق الأنابيب، ويتم غسل الخرز ثلاث مرات لإزالة VLPs غير منضم. (5) في الخطوة التالية ، يتم إضافة تقليل حاجز تحميل البروتين إلى المجمعات المناعية التي تتكون من الخرز المغناطيسي المغلفة ب bNAbs وVLPs الملتقطة. (6) يتم فصل العينة عن bNAbs واستهداف المستضد من الخرز المغناطيسي وتحلل VLPs. (7) يتم فصل الخرز المغناطيسي عن المحلول في مجال مغناطيسي. (8) تخضع عينات البروتين لSDS-PAGE. (9) يتم إجراء تحليل لطخة الغربية من أجل الكشف عن البروتينات الأساسية P55 Gag الفيروسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 3 نتيجة تمثيلية ل VLPs تم التقاطها لأول مرة من الكريات CFSN و VLP ، على التوالي ، باستخدام bNAbs وخضعت بعد ذلك لتحليل البقع الغربية للكشف عن البروتينات الأساسية الفيروسية. كانت الخرز المستخدمة في فحص الالتقاط مغلفة بثلاثة bNAbs مختلفة موجهة ضد epitopes الحساسة للتحييد من البروتينات الجليكوبروتينية Env والأجسام المضادة isotype بمثابة ضوابط سلبية ، على التوالي. باستخدام الخرز المغلف بالأجسام المضادة متساوية النوع ، لم يكن من الممكن اكتشاف بروتينات Gag في العينات التي تحتوي على Env-negative (VLPs الأصلع) أو VLPs التي تعرض Env باستخدام تحليل البقع الغربية. وهذا يدل على أن الربط غير المحدد من VLPs إلى الخرز المغلفة بالأجسام المضادة البشرية لم توسط القبض على VLP. كما لم تكن VLPs الأصلع ملزمة بالخرز المغلف ب bNAbs ، وبالتالي ، مرة أخرى ، لم يكن من الممكن اكتشاف بروتينات Gag. في المقابل ، التقطت جميع bNAbs الثلاثة VLPs التي تعرض بروتينات Env (Env VLPs) ، وبالتالي ، تم اكتشاف بروتينات Gag بسهولة في وقت لاحق. كما هو مرئي في الشكل 3، يمكن استخدام المقايسة التقاط لتحليل مستضد الهدف عرض VLPs في عينات CFSN وVLP بيليه، على التوالي.

figure-results-1
الشكل 3: الكشف عن الأسطح الحساسة للتحييد في البروتينات الجليكوبروتينية المغلفة HIV-1 المعروضة على VLPs التي شكلتها gag p55 باستخدام أجسام مضادة محايدة على نطاق واسع. النتائج التمثيلية لتحليل البقع الغربية باستخدام الأجسام المضادة الفيروسية الأساسية للبروتين الخاصة بالبروتين بعد إجراء فحص التقاط VLP باستخدام ثلاثة أجسام مضادة مختلفة محايدة على نطاق واسع (bNAb 1 و bNAb 2 و bnAb 3) تستهدف الأسطح داخل البروتينات الجليكوبروتينية المغلفة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 (Env). الأجسام المضادة البشرية Isotype تجمع من سيرا الإنسان بمثابة ضوابط سلبية. تم حصاد الخلايا التنافرات من ثقافات الخلايا المعلقة المنتجة ل VLPs مع بروتينات Env (Env VLPs) وVLPs الأصلع (Env-negative) ، على التوالي ، وكذلك من الخلايا الساذجة التي لا تعبر عن أي بروتينات فيروسية (وهمية). كل من supernatants من الأصلع VLP المنتج ثقافة الخلية وكذلك من ثقافة الخلية وهمية بمثابة الضوابط السلبية. تم تحرير الخلايا الفائقة من تلويث الخلايا باستخدام أجهزة الطرد المركزي منخفضة السرعة والترشيح اللاحق للحصول على الحيوانات الخارقة الخالية من الخلايا (CFSN) لتحليلها. عند النقص المناعي، تم إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام أجسام مضادة للأرانب متعددة النسيلة موجهة ضد Gag ومواجهات IgG-HRP الثانوية المضادة للأرانب. يتم تصوير الوزن الجزيئي الظاهر بالكيلودالتون (kDa) كما هو مرئي من علامة الوزن الجزيئي (MW) على اليسار. تشير الأسهم إلى البروتين المكتشف p55 Gag. (أ) لكل عينة، تم تطبيق CFSN التي تحتوي على 100 نانوغرام من بروتين Gag على فحص الالتقاط لتوحيد كمية مدخلات VLPs. تم احتضان CFSN مباشرة بالخرز المغلف بالأجسام المضادة. (ب) تم الحصول على الكريات VLP عن طريق الطرد المركزي للغاية من CFSN. الكريات التي تحتوي على 100 نانوغرام من بروتين Gag تم تطبيقها على المقايسة التقاط باستخدام الأجسام المضادة isotype وbNAb 3. عينات لbNAb 1 و bNAb 2 تحتوي فقط 25 نانوغرام من الغاغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قبل فحص التقاط VLP، قم بتقييم تشكيل VLPs والتعبير عن المستضد المستهدف في خطوط خلايا منتج VLP. طرق مفيدة هي تدفق التحليل الخلوي للتعبير سطح الخلية من المستضد وكذلك مستضد والفيروس الأساسية البروتين محددة ELISA من CFSN وVLPs بيليه.

الخطوات الحاسمة من المقايسة التقاط VLP هي طلاء الخرز مع التقاط الأجسام المضادة - هنا bNAbs - والقبض اللاحقة من VLPs مستضد إيجابية من قبل الخرز المغلفة بالأجسام المضادة. يعتمد الطلاء الناجح للخرزات ذات الأجسام المضادة على اختيار البروتين الملزم المناعي (Ig). الأنواع المانحة وكذلك فئة Ig من الأجسام المضادة تحديد ما إذا كان البروتين G- أو البروتين A-الخرز المترافق هي الأفضل. بالنسبة لمعظم الأنواع وفئات Ig، البروتين G هو ليغاند من choice33. كبديل للبروتين A / G - الخرز المقترنة ، والخرز streptavidin للطلاء مع الأجسام المضادة البيوتينيلات المتاحة. الخرز يمكن أيضا أن يقترن بشكل مشترك مع الأجسام المضادة.

القبض على VLPs بواسطة حبات مغلفة بالأجسام المضادة يعتمد على خلط شامل ، ووقت حضانة كاف ، وفرة مستضد ، وتقارب الجسم المضاد التقاط. في تجربتنا، يتم تحقيق الاختلاط الشامل للخرز المغلفة بالأجسام المضادة مع عينات VLP على أفضل وجه من خلال استخدام وحدات التخزين >500 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل تحت الدوران لمدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجة مئوية. وثمة عقبة محتملة أخرى هي كمية منخفضة جدا من VLPs في العينة. بالنسبة للأجسام المضادة الملزمة بقوة للمضاد المستهدف ، عادة ما تسمح مدخلات VLP منخفضة تصل إلى 15 نانوغرام من بروتين Gag بكميات يمكن اكتشافها بسهولة من البروتينات الأساسية الفيروسية باستخدام تحليل البقع الغربية. ومع ذلك، تتطلب الأجسام المضادة منخفضة التقارب كميات مدخلات أعلى، على سبيل المثال، 100 نانوغرام من بروتين Gag، للحصول على نتائج حاسمة (الشكل 3، bNAb 3).

بعض المستضدات السطحية عرضة لتدهور البروتيز. هنا، نوصي بإضافة مثبطات البروتيز إلى عينات VLP والحضانة عند 4 درجة مئوية. نادرا ما يلاحظ التصاق غير محددة من بروتينات الخلايا المضيفة وVLPs إلى الأجسام المضادة حبة ملزمة وينبغي استبعادها باستخدام الضوابط السلبية المناسبة، كما أظهرنا هنا باستخدام عينات VLP وهمية وأصلع والأجسام المضادة للسيطرة isotype. وتشمل استراتيجيات الحد من الربط غير محددة خطوات الغسيل الموسعة وإضافة كيسين في المخزن المؤقت غسل34. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تحسين المقايسة التقاط عن طريق تحديد النسبة المثلى من الأجسام المضادة إلى كمية VLP عرض مستضد.

في الخطوة الأخيرة من فحص التقاط VLP ، نصف تصغير المجمعات المناعية من الخرز عن طريق الغليان في تقليل حاجز Laemmli. خلال هذه الخطوة، يتم تفكيك VLPs، ويتم فصل الأجسام المضادة التقاط المستضدات الهدف من الخرز. وتجدر الإشارة إلى أن الأنواع المانحة للأجسام المضادة الأولية المستخدمة في التحليل الغربي اللاحق لللطخة يجب أن تختلف عن المتبرع بالأجسام المضادة للالتقاط لتجنب الكشف غير المقصود عن جسم الالتقاط من قبل الأجسام المضادة الثانوية المضادة للمانحين IgG HRP.

يوفر اختبار التقاط VLP المعروض هنا طريقة سهلة الاستخدام وحساسة للكشف عن الأسطح الحساسة للتحييد في مستضدات الهدف الهيكلية السليمة المعروضة على أسطح VLP. ومع ذلك، لا يتيح الفحص التقاط التحديد الكمي المباشر للظهارة. ELISA يؤديها مع bNAbs مفيدة لهذا الغرض، وينبغي أن تجرى بالتوازي، لا سيما إذا تم فحص VLPs يقصد أن تستخدم في الدراسات قبل السريرية التي تستخدم نماذج الحيوانات35. وهذا أمر محوري، حيث أن كمية المستضد يمكن أن ترتبط مباشرة باستخلاص استجابة الأجسام المضادة المحايدة في الحيوانات المحصنة، كما هو مبين للقاحات فيروس بورسيني سيركو من النوع 2 (PCV2).

وينبغي أن يؤدي اللقاح المثالي إلى الحصول على bNAbs التي تستهدف epitopes حساسة للتحييد على سطح الفيروس. إن تحليل هذه الأسطح يشير بشكل خاص إلى سلامتها الهيكلية الكاملة على سطح لقاح الجسيمات أمر بالغ الأهمية لتحديد المرشحين المحتملين للقاح. وهذا ليس هو الحال بالنسبة للقاحات VLPs المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية فحسب، بل أيضا بالنسبة للعديد من لقاحات VLP الأخرى في التنمية37. فاللقاحات البارزة القائمة على VLP، على سبيل المثال، مشتقة من فيروسات أبوية غير مغلفة أو ذات سقف مثل فيروس الورم الحليمي البشري. على عكس جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية-1، التي تتشكل من بروتين أساسي هيكلي واحد فقط، وهو P55 Gag، وتحيط بها الغشاء الناشئ عن الخلية المنتجة ل VLP، تتكون جزيئات فيروس الورم الحليمي البشري من بروتين أساسي هيكلي واحد أو اثنين فقط38,39. وبالمثل وكما هو معروض هنا لVLPs المغلفة، قد ينطبق أيضا على الكشف عن epitopes حساسة تحييد من VLPs غير المغلفة.

كبديل لمقايسة الالتقاط ، يمكن أن تخضع عينات VLP مباشرة إلى PAGE الأصلية تليها تحليل البقع الغربية باستخدام bNAbs والأجسام المضادة الثانوية المناسبة إلى جانب HRP40. ومع ذلك ، ولتحليل فيروس نقص المناعة البشرية ENV زينت VLPs ، وهذا المقايسة هي أقل حساسية كما يمكن توقع عدد قليل فقط من البروتينات مستضد لكل VLP. في المقابل ، يسهل فحص الالتقاط الكشف عن البروتينات الأساسية الوفيرة بكميات كبيرة لكل VLP ، في حالة VLPs المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية أكثر من 3500 بروتين Gag تشكل VLP27. وهذا يسمح للكشف غير المباشر حساسة جدا من epitopes في Env عرض حتى في كثافات منخفضة على VLPs.

عدد الطرق الراسخة لفحص epitopes حساسة للتحييد في المستضدات السطحية من VLPs محدودة. وضع العلامات على المستضدات المعروضة على VLPs ممكن مع الأجسام المضادة الخاصة بالظهارة الفلوروفورية المصاحبة والكشف اللاحق عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، مما يتيح الكشف عن VLPs وتحديد كميتها. وقد تم أيضا تطوير هذه الطريقة بنجاح وتحسينها لإكسوسومات تقديم علامات سطح الخلية41. أيضا، يسمح التحليل الطيفي لرنين البلازمون السطحي (SPR) بتحليل التفاعلات بين الأجسام المضادة المحايدة غير المترافقة والأسطح المجسدة المقدمة على VLPs. على الرغم من أنها غير مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية ، يمكن أيضا تسمية VLPs ب bNAbs إلى جانب جزيئات الذهب والإلكترونات اللاحقة المجهرية (TEM) - examination42.

وفي الختام، يوفر المقايسة الالتقاط VLP بعض المزايا الكبيرة: '1' تقييم السلامة الهيكلية للأسطح الحساسة للتحييد على سطح الأجسام ذات الأجسام المنخفضة الفلور، '2' الكشف الحساس وغير المباشر عن المستضدات حتى عند عرضها بكثافات منخفضة على الأجسام ذات الكثافة المنخفضة، و'3' لا تتطلب الطريقة معدات تحليلية كثيفة التكلفة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية، وبرنامج التمويل Forschung an Fachhochschulen، وأرقام العقود 13FH767IA6 و 13FH242PX6 إلى JS. تم إنشاء الشكلين 1 و 2 مع BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنابيب تفاعلEppendorf
10x PBSgibco70011044
4٪ & ndash ؛ 15٪ Mini-PROTEAN TGX جل البروتين الخالي من البقعBioRad4568085
الأجسام المضادة (bnAbs)Polymun Scientic Isotype
للتحكم في الأجسام المضادةinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)02-7102
نظام التصوير Chemidoc XRS +BioRad1708265
الدجاج المضاد للأرانب IgG HRP مقترنةبتقنيات الحياةA159871: 5000 في TBS-T + 2٪ (وزن / حجم) حليب مجفف
Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kitinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)10007Dيتضمن المخازن المؤقتة ومحاليل الغسيل
FreeStyle 293-F الخلاياinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)R790-07
FreeStyle 293 Expression Mediuminvitrogen (Thermo Fisher Scientific)12338026
أوراق نشاف الجلWhatmanGB005
GlycineCarl Roth0079النشاف العازلة
رف الفصل المغناطيسيNew England BiolabsS1509Sل 12 × 1.5 مل أو 6 × 1.5 مل أنابيب
الميثانولكارل روث4627اللحاف العازلة
Mini-PROTEAN Tetra Cell نظام الرحلان الكهربائيBioRad
Optima XE-90 أجهزة الطرد المركزي الفائقةبيكمان كولتر
بيجحاكم سلم البروتين الملونبالحرارة العلمية26616
مرشحات حقنة فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) ، 0.45 وميكرو ؛ مكارل روثKC89.1
حليب مجففكارل روثT145مانع عازلة
PVDF transfermembrane ، 0.45 & micro ؛ مكارل روثT830.1
QuickTiter HIV p24 ELISACell BiolabsVPK-108-H
أرنب متعدد النسيلة لفيروس نقص المناعة البشرية 1 p55 + p24 + p17abcamab639171: 2000 في TBS-T + 2٪ (وزن / حجم) حليب مجفف
دوارHeidolphREAX2
ROTI Load 1 (عازلة laemmli)Carl RothK929.14x مخزن مؤقت لتحميل هلام البروتين المختزل
ROTIPHORESE 10x SDS-PAGEكارل روث3060
كلوريد الصوديومكارل روث3957TBS-T عازلة
SuperSignal West Pico PLUS الركيزة الكيميائيةالمضيئة الحرارية العلمية34579
SW28 الدواربيكمان كولتر
ThermomixerCel Mediaالأساسية
Trans-Blot TurboBioRad
تريهالوز ثنائي هيدراتكارل روث8897.2
TRISCarl Roth5429عازلة نشاف
TRIS هيدروكلوريدكارل روث9090TBS-T عازلة
Tween-20Carl Roth9127TBS-T عازلة
أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوحبيكمانكولتر 344058
المركز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M. Virus-like particles in vaccine development. Expert Review of Vaccines. 9 (10), 1149-1176 (2010).
  2. Noad, R., Roy, P. Virus-like particles as immunogens. Trends in Microbiology. 11 (9), 438-444 (2003).
  3. Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139(2020).
  4. Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
  5. Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017(2020).
  6. Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009(2019).
  7. Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78(2019).
  8. Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488(2020).
  9. Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41(2019).
  10. Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
  11. Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251(2021).
  12. Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
  13. Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
  14. Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
  15. Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
  16. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
  17. DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
  18. Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
  19. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  20. Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865(2019).
  21. Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868(2018).
  22. Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
  23. Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
  24. Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
  25. Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877(2011).
  26. Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
  27. Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
  28. Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
  29. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
  30. Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
  31. JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  33. Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
  34. Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
  35. Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
  36. Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
  38. DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537(2017).
  39. Wang, J. W., Roden, R. B. S. L2, the minor capsid protein of papillomavirus. Virology. 445 (1-2), 175-186 (2013).
  40. Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
  41. Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295(2019).
  42. Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

VLP Capture AssayVirus Like ParticlesNeutralization EpitopesBroadly Neutralizing AntibodiesAntigen DisplayMagnetic BeadsEnvelope GlycoproteinsSDS PAGEWestern BlotImmunoprecipitation

Related Articles