يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكشف عن المتصورة Sporozoites في بعوض الأنوفيليس باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم

2.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63158

⸱

سبتمبر 30, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 2Department of Molecular Tropical Medicine & Genetics, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 3Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 4Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش للكشف عن سبوروزويتات الغدد اللعابية في البعوض. وباستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة بسهولة، تتيح هذه الطريقة الكشف الفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية عن البعوض الذي يحمل المتصورة المنجلية أو المتصورة النشيطة. وهذه الطريقة مناسبة لبحوث انتقال الملاريا، بما في ذلك مسوحات النواقل.

الملخص

المتصورة sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا التي تصيب البشر. تنتقل الأسبوغات الموجودة في الغدد اللعابية لأنثى بعوض الأنوفيليس إلى البشر عن طريق لدغات البعوض أثناء تغذية الدم. وبالتالي فإن وجود sporozoites في الغدد اللعابية للبعوض يحدد عدوى البعوض. لتحديد ما إذا كانت بعوضة الأنوفيليس تحمل المتصورة sporozoites ، كانت طريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) هي الأداة القياسية للكشف عن بروتين Plasmodium circumsporozoite (CSP) ، وهو البروتين السطحي الرئيسي لل sporozoites. في هذه الطريقة ، يتم فصل الرأس مع الصدر لكل بعوضة عن البطن ، وتجانسها ، وتعريضها لشطيرة ELISA للكشف عن وجود CSP خاص بالمتصورة المنجلية وكل من النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من المتصورة النشيطة. وقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة انتقال الملاريا، بما في ذلك الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وأنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في مواقع الدراسة.

المقدمة

Plasmodium sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا في البعوض. يتم تسليم sporozoites إلى البشر عن طريق لدغات البعوض. في البعوض ، تتشكل sporozoites أولا داخل البويضات على جدار الأمعاء الوسطى. بمجرد أن تصبح جاهزة ، يتم إطلاقها في الهيموكول والسفر إلى الغدد اللعابية البعوض. هناك ، تنضج وتصبح جاهزة للانتقال إلى البشر أثناء تغذية الدم. في البشر ، يتم ترسيب sporozoites في الأدمة. ثم يدخلون الأوعية الدموية ويسافرون على طول الدورة الدموية للوصول إلى الكبد لإثبات العدوى في خلايا الكبد 1,2.

تم استخدام ثلاث طرق مختلفة لتحديد عدوى sporozoite للغدد اللعابية البعوضية. الطريقة الأولى هي تشريح الغدد اللعابية متبوعا بالفحص المباشر للسبوروزويتات تحت المجهر الضوئي. هذه الطريقة هي المعيار الذهبي للكشف عن الأسبوغية وقياسها في الغدد اللعابية للبعوض Anopheles 3. ومع ذلك ، فإنه يتطلب فنيا مدربا جيدا في كل من التشريح والفحص المجهري. علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدامه لتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP (ل P. vivax)4,5. تستخدم الطريقة الثانية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للكشف عن الحمض النووي للبلازميوم في الجزء العلوي من جسم البعوض6. بالنظر إلى خصوصية PCR ، فإن كلا من الأنواع والأنواع الفرعية للطفيلي ممكنة7،8،9،10. على الرغم من استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل متزايد ، إلا أنه يتطلب معدات باهظة الثمن نسبيا وموظفين مدربين تدريبا جيدا. الطريقة الأخيرة ، ELISA للكشف عن بروتين محيطي البلازموديوم المحدد (CSP) ، كانت الدعامة الأساسية لمدة ثلاثة عقود11،12،13. يوجد CSP في كل من البويضات sporozoites و sporozoites الغدد اللعابية12،14. باستخدام أجسام مضادة محددة ، تسمح هذه الطريقة بتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP ل P. vivax sporozoites. الأساس المنطقي لهذا الفحص هو اشتراط اختبار بسيط عالي الإنتاجية لفحص عدد كبير من البعوض البري لفهم انتقال الملاريا (أي تحديد معدل الإصابة بالأسبوروزويت).

تتميز طريقة ELISA بميزتين رئيسيتين على الفحص المجهري. أولا ، يسمح للباحثين بالاحتفاظ بعينات البعوض حتى تصبح جاهزة لمعالجة العينات. ثانيا ، يمكن استخدام طريقة ELISA للتمييز بين أنواع البلازموديوم من خلال الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بالأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تستوعب ELISA عددا أكبر من عينات البعوض ، مما يسمح بإنتاجية أعلى بكثير15. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الذي يكتشف الحمض النووي للسبوروزويت ، يستغرق إجراء ELISA وقتا أطول ولكنه يكلفأقل 16. تم تطوير اختبار ELISA الموصوف هنا لتحديد عدوى البعوض والكشف بشكل منفصل عن CSP من P. falciparum وكل من متغيري CSP من P. vivax و VK210 و VK247. تم استخدام طريقة ELISA هذه في العديد من الدراسات لتحديد الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وتحديد أنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في الحقل12،13،17،18. لإجراء هذا الفحص ، يكفي وجود مختبر قياسي مجهز بقارئ لوحة ELISA.

يتم تلخيص النهج العام في الشكل 1. في شطيرة ELISA هذه ، يتم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة الأساسي (التقاط) (mAb) الخاص بكل نوع / نوع فرعي من البلازموديوم لأول مرة لتغليف لوحة ELISA. كل لوحة مغلفة بالتقاط واحد mAb. وظيفة mAb هي التقاط مستضد CSP المقابل في متجانسات البعوض. بعد التقاط المستضد وغسل الصفيحة ، يتم استخدام جسم مضاد ثان خاص ب CSP يحمل علامة البيروكسيديز للكشف عن وجود CSP مرتبط ب mAb الملتقط. ينتج عن التفاعل الكيميائي الذي يحفزه البيروكسيديز تطور اللون في الآبار الإيجابية ل CSP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف

ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالمعدات والكواشف والمواد الاستهلاكية الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول وإلى الجدول 1 للحصول على قائمة بالحلول وتكوينها.

  1. التقاط و mAbs مترافق البيروكسيديز
    1. لإعادة تكوين mAb ، أعد تعليق mAb المجفف بالتجميد في خليط 1: 1 من الماء المقطر: الجلسرين عند 0.5 مجم / مل. قم بعمل الحصص حسب الحاجة لتجنب تكرار ذوبان الجليد ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. حظر المخزن المؤقت (BB)
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للحظر عن طريق إذابة 5 جم من الكازين بدرجة ELISA في 100 مل من 0.1 N NaOH. أضف 900 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1) ليصل الحجم النهائي إلى 1.0 لتر.
    2. أضف 0.02 جم من الفينول الأحمر كمؤشر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. قم بتخزين BB في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، أو القسمة إلى 50 مل للتخزين طويل الأجل عند -20 درجة مئوية.
  3. الضوابط الإيجابية
    1. لإعادة تكوين الضوابط الإيجابية ، أعد ترطيب البروتينات المجففة بالتجميد بإضافة 1000 ميكرولتر من BB. قم بعمل حصص من حلول التحكم الإيجابي في المخزون حسب الحاجة ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. للتخفيف التسلسلي ، قم بتخفيف كل عنصر تحكم إيجابي إلى تركيز العمل النهائي في BB على النحو التالي: Pf ، 2 بيكوغرام / ميكرولتر ؛ الكهروضوئية (VK210) ، 182 (بيكوغرام / ميكرولتر) ؛ الكهروضوئية (VK247) ، 89 بيكوغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: قد يختلف بالضبط تركيزات الضوابط الموجبة من دفعة إلى أخرى. راجع ورقة معلومات المنتج لمعرفة التركيز الدقيق المطلوب. تركيزات التحكم الإيجابية ، بدءا من تركيز العمل أعلاه ، هي 2 ، 1 ، 0.5 ، 0.25 ، 0.13 ، 0.06 بيكوغرام / ميكرولتر ل Pf ؛ 182 ، 91 ، 46 ، 23 ، 11 ، 5.7 بيكوغرام / ميكرولتر ل PV210 ؛ و 89 ، 45 ، 22 ، 11 ، 5.6 ، 2.8 بيكوغرام / ميكرولتر PV247.
  4. الضوابط السلبية
    ملاحظة: السيطرة السلبية المثالية هي تجانس الرأس والصدر لإناث بعوض الأنوفيلة المحضرة بشكل مماثل لعينات الاختبار. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام BB كعنصر تحكم سلبي.
    1. مع BB كعنصر تحكم سلبي ، استخدم عتبة الامتصاص 2 أضعاف للحصول على قراءات إيجابية موثوقة.

2. إعداد عينة البعوض

  1. افصل الرأس والصدر لكل بعوضة بالغة تم جمعها عن البطن بشفرة حلاقة معقمة. ضع الرأس والصدر في أنبوب طحن بالطرد المركزي سعة 1.5 مل محدد مسبقا. تجمع الرؤوس والصدر لما يصل إلى 10 بعوض إذا رغبت في ذلك.
    ملاحظة: لإعداد العينة ، عادة ، سيتم تشريح الغدة اللعابية من البعوض المصاب وتعريضها ل CS-ELISA. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام رأس وصدر البعوض الذي تم جمعه لأداء CS-ELISA مباشرة (دون تشريح الغدد اللعابية)12،13،19.
  2. أضف 50 ميكرولتر من محلول الطحن (GB) في كل أنبوب وقم بتجانس العينة بمدقة نظيفة (مغسولة بالصابون). شطف المدقة المستخدمة مع 250 ميكرولتر من GB في الأنبوب الذي يحتوي على البعوض (البعوض) متجانسة إلى حجم نهائي من ~ 300 ميكرولتر.
  3. احتفظ بالعينة في المجمد (-20 درجة مئوية) حتى الاستخدام أو تابع على الفور لإجراء ELISA.

3. سبوروزويت إليسا

  1. املأ ورقة عمل sporozoite ELISA (انظر المادة التكميلية 1). قم بإعداد لوحة ELISA واحدة لكل CSP (Pf أو Pv-210 أو Pv-247).
  2. تحضير محلول عمل mAb عن طريق إذابة الجسم المضاد في PBS: 4 ميكروغرام / مل Pf ؛ 2 ميكروغرام / مل PV-210 ؛ 2 ميكروغرام / مل من PV-247. احسب الأحجام المطلوبة بناء على إضافة 5 مل لكل لوحة. دوامة الحل بلطف.
  3. ماصة 50 ميكرولتر من كل محلول mAb عامل من الخطوة 3.2 في كل بئر من لوحة ELISA. غطي الطبق بغطاء بلاستيكي واحتضانه لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  4. استنشق محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات على الأقل لإزالة كل السوائل.
    ملاحظة: في حالة عدم توفر نظام شفط (شفط فراغ متعدد القنوات متصل بأطراف نظيفة) ، فقم بتفريغ الأجسام المضادة في الحوض ثم انقر فوق اللوحة الموجودة على مناشف ورقية.
  5. أضف 200 ميكرولتر من BB لملء جميع الآبار في اللوحة. غطي اللوحة بغطاء بلاستيكي. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نضح أو تفريغ محتويات البئر. اضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات لإزالة كل السوائل.
  6. تحميل متجانسة البعوض والسيطرة على لوحة على النحو التالي.
    1. أضف 50 ميكرولتر من التحكم الإيجابي إلى الآبار H1 و H2.
    2. أضف 50 ميكرولتر من BB إلى الآبار في العمودين 1 و 2 من الصف C إلى G. ثم أضف 50 ميكرولتر من التحكم الإيجابي في الآبار G1 و G2. قم بإجراء تخفيف تسلسلي للتحكم الإيجابي بدءا من G1 و G2 متبوعا ب F1 و F2 حتى C1 و C2.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع آبار التحكم الإيجابي على 50 ميكرولتر.
    3. أضف 50 ميكرولتر من BB (التحكم السلبي) إلى الآبار A1 و A2 و B1 و B2.
    4. أضف 50 ميكرولتر من كل عينة متجانسة إلى بئر غير معروف (Unk).
    5. غطي اللوحة واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. بعد حوالي 2 ساعة ، ابدأ في تحضير الركائز. بالنسبة لمجموعة الركيزة المكونة من 2 مكون من ABTS ، امزج الركيزة A والركيزة B بنسبة 1: 1.
    ملاحظة: تتطلب اللوحة الكاملة المكونة من 96 بئرا 5 مل من الركيزة A و 5 مل من الركيزة B.
  8. قم بإعداد حلول العمل ل mAbs المسمى بالبيروكسيديز ل Pf و Pv-210 و Pv-247 عن طريق إضافة BB إلى mAb المترافق المعاد تشكيله للحصول على تركيز عمل قدره 1 ميكروغرام / مل.
    1. احسب الأحجام المطلوبة بناء على إضافة 5 مل من محلول mAb المترافق العامل لكل لوحة.
    2. اختبر نشاط البيروكسيديز عن طريق خلط 5 ميكرولتر من mAb المسمى بالبيروكسيديز المصنوع في الخطوة 3.8 مع 100 ميكرولتر من الركيزة المصنوعة في الخطوة 3.7 في أنبوب منفصل 1.5 مل. دوامة بلطف.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك تغيير سريع في اللون من واضح إلى أخضر ، مما يشير إلى أن إنزيم البيروكسيديز والركائز تعمل.
  9. قم بشفط أو تفريغ محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات لإزالة كل السوائل.
  10. اغسل الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS-Tween ، واستنشق محتويات البئر ، واضغط على اللوحة 5 مرات لكل منهما.
  11. أضف 50 ميكرولتر من mAb المسمى بالبيروكسيديز المصنوع في الخطوة 3.8 إلى كل بئر. غطي اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. نضح أو تفريغ محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية 5 مرات.
  12. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS-Tween ، واستنشق محتويات البئر ، واضغط على اللوحة 5 مرات لكل منها.
  13. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة المحضر في الخطوة 3.7 إلى كل بئر. غطي الطبق واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  14. بعد 30 دقيقة ، اقرأ الامتصاص عند 405-414 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ELISA.
    ملاحظة: اتبع التعليمات المحددة لقارئ لوحات ELISA المستخدم. للحصول على تفاصيل حول التعليمات الخاصة بالبرنامج المستخدم لهذا البروتوكول ، راجع المواد التكميلية S2. يجب أن يكون هناك تغيير ملحوظ في اللون من واضح إلى أخضر في آبار التحكم الإيجابية.

4. التحليل

  1. الكشف عن العينات الإيجابية.
    1. قم بتسمية العينات ذات قيم الامتصاص أعلى من الحد الفاصل (ضعف متوسط قيمة الامتصاص للعينات السالبة) على أنها موجبة.
  2. القياس الكمي للطاقة الشمسية المركزة
    1. قم بتقدير تركيز CSP في العينة باستخدام المنحنى القياسي المبني من سلسلة تخفيف التحكم على النحو التالي.
      1. قم بإنشاء المنحنى القياسي عن طريق رسم قيم الامتصاص (المحور الصادي) لعناصر التحكم المخففة بشكل متسلسل مقابل تركيزاتها (المحور السيني).
      2. قم بإجراء الانحدار الخطي لتحديد أفضل ملاءمة باستخدام y = A + Bx ، حيث A و B معلمات مجانية.
      3. أوجد تركيز الطاقة الشمسية المركزة لكل عينة موجبة عن طريق حل معادلة قيمة امتصاص معطاة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تظهر نتائج ELISA التمثيلية في الشكل 2. في هذه التجربة ، اكتشفت P. falciparum ELISA عدوى sporozoite في البئر A7. يمكن اكتشاف البئر الموجب بصريا من خلال لونه الأخضر الباهت (الشكل 2 أ). كانت قيمة امتصاص هذا البئر أعلى من عتبة القطع (ضعف القيمة المتوسطة لآبار التحكم السلبية الأربعة) (الشكل 2 ب). يوضح الشكل 2 ج توزيع قيم الامتصاص لجميع الآبار ال 80 غير المعروفة. يشير القياس الكمي ل CSP للبئر A7 بواس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر CSP-ELISA طريقة محددة للغاية وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن البلازموديوم CSP. يسمح بالتمييز بين P. falciparum و P. vivax sporozoites وكذلك بين النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من P vivax11،13،14،15. يجب النظر في بعض النقاط الحرجة للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. يجب أن تبقى جميع الحلول في الثلاجة لمدة تقل عن 1 أسبوع لمنع نمو الميكروبات. يجب حفظ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نشكر السيد كيراكورن كياتيبوتر ، MVRU ، على التدريب والتوجيه. ونشكر أيضا السيدة بينيابات كونغنغين، MVRU، على مساعدتها التقنية في إعداد الشكل 2. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعهد الوطني للصحة (U19 AI089672).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> المعدات< / قوي>
قارئ لوحة ELISABioTek Instrument، Inc.التآزر H1باستخدام وضع الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية VIS
مدقة المطحنةAxygenPES-15-B-SIلتجانس رأس البعوض / الصدر
< قوي > الكواشف < / قوي >
ABTS ركيزة 2 مكونKPL50-62-00للكشف عن البيروكسيداز
المخزن المؤقت للحجب (BB)ملاحظة: محلول
الالتقاط والأجسام المضادة وحيدة النسيلة المترافقة بالبيروكسيداز (mAbs)ملاحظة: يمكن الحصول على mAbs في شكل مجفف بالتجميد كجزء من مجموعات كاشف Sporozoite ELISA (MRA-890 ل P. falciparum و MRA-1028K ل P. vivax) من BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
CaseinSigma aldrich9000-71-9لمنع تحضير العازلة
العازلة الطحن (GB)ملاحظة: الحل
Igepal CA-630Sigma aldrich9002-93-1لإعداد المخزن المؤقت للطحن
KClSigma aldrich7447-40-7لتحضير محلول ملحي للفوسفات عازلة
KH2< / sub>PO4< / sub> سيجما ألدريتش7778-77-0لتحضير محلول ملحي عازل للفوسفات
Na2< / sub>HPO4< / sub>Sigma aldrich7558-79-4لتحضير محلول ملحي عازل للفوسفات
NaClSigma aldrich7647-14-5لتحضير محلول ملحي عازل للفوسفات
NaOHSigma aldrich1310-73-2لمنع تحضير المخزن المؤقت
PBS-Tween
Pf التقاط mAbCDCPf-CAPلالتقاط بروتين Pf circumsporozoite
Pf بيروكسيداز mAbCDCPf-HRPللكشف عن بروتين Pf circumsporozoite
Pf التحكم الإيجابيCDCPf-PCPf التحكم الإيجابي
الفينول الأحمرسيجما ألدريتش143-74-8لمنع تحضير العازلة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ملاحظة: محلول
الضوابطملاحظة: محلول
Pv210 التقاط mAbCDCPv210-CAPلالتقاط بروتين Pv210 circumsporozoite
Pv210 بيروكسيداز mAbCDCPv210-HRPللكشف عن بروتين Pv210 circumsporozoite
Pv210 التحكم الإيجابيCDCPv210-PCالتحكم الإيجابي Pv210
Pv247 التقاط mAbCDCPv247-CAPلالتقاط Pv247 حول بروتين البوروزويت
Pv247 بيروكسيداز mAbCDCPv247-HRPللكشف عن Pv247 حول بروتين البوروزويت
Pv247 التحكم الإيجابيCDCPv247-PCPv247 التحكم الإيجابي
Tween20Sigma aldrich9005-64-5لإعداد PBS-Tween
< قوي > مستهلكات < / قوي >
خزانات ماصة يمكن التخلص منهاعامللكواشف العاملة
لوحات ELISA: 96 قاع دائري واضح جيدا PVSCorning Life Science2797لقفازات ELISA
: قفازات وقفازات فريزر يمكن التخلص منهاعامللحماية الشخصية
ثوب المختبرعامللحماية الشخصية
متعددة القنوات الماصة P30-300Genericلنقل الحلول
مجموعة الماصات ، P2 ، P20 ، P200 ، و P1000Genericلنقل الحلول
أطراف الماصة 10 & micro ؛ لتر ، 200 وميكرو ؛ L ، و 1000 & LGenericلنقل
المحلول الماصات المصلية 5 مل ، 10 ملGenericلنقل المحلول
ماصات نقلGenericلنقل المحلول
يتم قياس امتصاص الإيجابية

المراجع

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , Geneva. (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224(2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الكشف عن المتصورة Sporozoites في بعوض الأنوفيليس باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.