مقالة منهجية

التشريح المجهري وتفكك قناة المبيض المورينية: تحديد الجزء الفردي وعزل الخلية الواحدة

DOI:

10.3791/63168

⸱

نوفمبر 4, 2021

 ,  ,  , 
1Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California, Riverside, 2Microscopy and Imaging Core Facility, University of California, Riverside

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم طريقة للتشريح المجهري لقناة بيض الفأر تسمح بجمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف إجراء تفكك الخلايا البيضوية غير الأنزيمية. الطرق مناسبة لتحليل الجينات والبروتين اللاحق للقطاعات البيضية المختلفة وظيفيا والخلايا البيضوية المنفصلة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنظمة نماذج الفئران لا مثيل لها لتحليل عمليات المرض بسبب قابليتها للتلاعب الجيني وانخفاض تكلفة العلاجات التجريبية. ومع ذلك ، بسبب صغر حجم الجسم ، أثبتت بعض الهياكل ، مثل قناة البيض التي يبلغ قطرها 200-400 ميكرومتر ، أنه من الصعب نسبيا دراستها إلا عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. في الآونة الأخيرة ، كشفت الدراسات الكيميائية النسيجية المناعية عن اختلافات أكثر تعقيدا في قطاعات قناة البيض مما كان معترفا به سابقا. وبالتالي ، تنقسم قناة البيض إلى أربعة أجزاء وظيفية بنسب مختلفة من سبعة أنواع متميزة من الخلايا الظهارية. من المحتمل أن تجعل الأصول والنسب الجنينية المختلفة لأنواع الخلايا الظهارية المناطق الوظيفية الأربع عرضة للأمراض بشكل مختلف. فعلى سبيل المثال، تنشأ آفات السلائف للسرطان المصلي داخل الظهارة من الإنفونديبولوم في نماذج الفئران ومن المنطقة الفيمبرية المقابلة في قناة فالوب البشرية. يفصل البروتوكول الموصوف هنا طريقة للتشريح المجهري لتقسيم قناة البيض بطريقة تنتج كمية كافية ونقاء من الحمض النووي الريبي الضروري للتحليل النهائي مثل النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq). كما وصفت طريقة تفكك الأنسجة غير الأنزيمية في الغالب المناسبة لقياس التدفق الخلوي أو تحليل RNAseq أحادي الخلية للخلايا البيضية المتمايزة تماما. ستسهل الطرق الموصوفة إجراء مزيد من الأبحاث باستخدام قناة البيض الفئرانية في مجال التكاثر والخصوبة والسرطان والمناعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتشابه قناة البيض الفئرانية في وظيفتها ومورفولوجيتها مع قناة فالوب البشرية1. يتكون كلاهما من ظهارة هدبية زائفة ، تتكون من خليتين مقيمتين ظهاريتين موصوفتين تاريخيا: الخلايا الهدبية والخلايا الإفرازية1,2. تحتوي قناة البيض على ثلاثة أجزاء معترف بها كلاسيكيا: infundibulum و ampulla و isthmus. في دراسة حديثة ، Harwalkar et al. 3 بحث في مورفولوجيا قناة البيض والتعبير الجيني مما أدى إلى توسيع تصنيف الخلايا الظهارية المقيمة إلى سبع مجموعات سكانية متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأوا تقاطع البرزخ الأمبولاري كجزء متميز من قناة البيض3. يمكن بسهولة توسيع الطريقة الموصوفة هنا ، والتي تركز على infundibulum و ampulla و برزخ ، لتشمل التقاطع الأمبولاري البرزخي أيضا2,3. تحتوي المنطقة القاعية على ostium ، أو فتحة قناة البيض ، وتشمل المنطقة fimbrial وكذلك الساق القريبة. بالانتقال نحو الرحم ، التالي هو الأمبولا ، ثم البرزخ. الخلايا الهدهدية هي الأكثر بروزا في الطرف البعيد من المنطقة ، بالقرب من المبيض ، أو infundibulum ، في حين أن الخلايا الإفرازية هي الأكثر بروزا في الطرف القريب أو جزء البرزخ 1. على عكس قناة فالوب البشرية ، فإن قناة البيض الفئران هي بنية ملفوفة مدعومة من الميزوسالبينكس ، وهو امتداد للرباط العريض الصفاق 1,4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغليف قناة بيض الفأر في كيس جرابي يزيد من احتمال نقل البويضات إلى قناة البيض4. يتم تحديد الأمبولا على أنها موقع الإخصاب ، الذي تمر منه الأجنة النامية إلى البرزخ قبل دخول الرحم5. يبلغ قطر الأجزاء البوقية 200-400 ميكرومتر ويبلغ طول المناطق الأطول من الأمبولاري والبرزخ حوالي 0.5-1.0 سم4. تتوزع قناة البيض خلال دورة الاستروس والأمبولا و infundibulum أكثر قابلية للتمدد من البرزخ1.

إن الإفراط في انتشار الخلايا، وخاصة الخلايا الإفرازية، يميز آفات السلائف إلى الأورام المصلية الموجودة في تجويف الحوض6. تنشأ هذه الآفات المصلية داخل الظهارة السلائف في ظهارة قناة البيض فقط في المنطقة الفيمبرية. من غير المعروف لماذا يقتصر تكوين الآفة على هذه المنطقة حيث عادة ما يكون نوع الخلايا السائد مهدبا ، وليس إفرازيا2،7،8. تؤكد الإقليمية من حيث الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية ، وكذلك الاهتمام المتزايد بالأصل القضوي لسرطان المبيض 9،10،11،12،13 ، على أهمية التقييم المنفصل لقطاعات قناة البيض.

تفصل الطريقة الموصوفة هنا جمع شرائح قنوات البيض المنفصلة للتحليلات اللاحقة في المصب للتعبير الجيني الخاص بالشرائح ووظيفة الخلايا المنفصلة. تقليديا ، تتم معالجة العديد من الأنسجة لاستخراج الحمض النووي الريبي بالكامل باتباع إما الفينول: طريقة الكلوروفورم أو طريقة الاستخراج الكامل على العمود. ومع ذلك ، وجدنا أنه تم الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي مع إنتاج عائد كاف باستخدام طريقة الجمع الموصوفة. باستخدام هذه الطريقة، يمكن معالجة أجزاء وظيفية صغيرة جدا من قناة البيض للتحليلات النهائية بدلا من التحقيق في قناة البيض ككل، والتي يمكن أن تخفي النتائج التي تمثل القطاعات المختلفة14.

نادرا ما تم التحقيق في الخلايا المبيضية الفئرانية المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، على الأرجح بسبب الحد من إنتاجية الخلايا من هذا الأنسجة. كان أحد الأساليب للتغلب على هذه المشكلة هو فصل الخلايا ، وتنميتها في الثقافة ، ثم تحفيز إعادة التمايز في المختبر للحصول على أرقام الخلايا المناسبة لتحليل الخلايا في المراحل النهائية15،16،17،18. أحد القيود المفروضة على هذا النهج هو الوقت خارج الجسم الحي والبيئة الدقيقة المتغيرة في الثقافة ، وكلاهما من المحتمل أن يغير التعبير الجيني. هناك أيضا افتراض بأن إعادة التمايز المورفولوجي لها نفس التوقيع النسخي والبروتيني كما كان موجودا في الحيوان السليم. تم تصميم طريقة التفكك الحالية لتحقيق أكبر عدد من الخلايا الظهارية في مجموعة خلايا القنوات البيضاوية غير المتجانسة مع الحفاظ على تمايز الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يحد النهج غير الأنزيمي في الغالب من فقدان بروتينات سطح الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات ومناولة الحيوانات من قبل جامعة كاليفورنيا ، لجنة ريفرسايد المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها ، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن الجمعية الأمريكية لرعاية المختبر ، ووزارة الزراعة الأمريكية ، والمعاهد الوطنية للصحة. استخدمت الطريقة الموصوفة C57BL/6 من الفئران البالغة والإناث. تم قتل جميع الحيوانات عن طريق قطع الرأس قبل حصاد الأنسجة.

ملاحظة: يرد في الشكل الأول (الشكل 1) نظرة عامة على البروتوكول، الذي يستخدم صبغة زرقاء للمساعدة في تشريح قناة البيض وتفكيكها بكفاءة.

هيكل قناة البيض: سليمة ، مصبوغة ، إزالة ما بعد المبيض ؛ غير ملفوف مع infundibulum ، ampulla ، مخطط البرزخ.
الشكل 1: نظرة عامة على طريقة التشريح المجهري. (أ) تظهر اللوحة اليسرى البنية السليمة التي تمت إزالة معظم وسادة الدهون المبيضية منها وبقايا النسيج الضام المحيط بقناة البيض. بعد ذلك ، تساعد إضافة toluidine blue على تمييز ملفات قناة البيض (اللوحة الوسطى). تظهر اللوحة اليمنى الهياكل بعد إزالة المبيض. (ب) قناة بيض غير ملفوفة مع منعطفات داخلية لتحديد أين يبدأ كل جزء وينتهي. (ج) رسم كاريكاتوري للتجزئة المستخدمة (غير مرسوم على نطاق واسع). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. إعداد سطح التشريح

  1. ضع قطعة من شمع الأسنان على طبق بتري مع مادة لاصقة واتركها تجف (الشكل 2A). قم بتعقيم الطبق بنسبة 70٪ من الإيثانول. السطح جاهز للتشريح.

2. التشريح الكلي للمبيض وقناة البيض والرحم

  1. شل حركة طبق بتري الذي يحتوي على شمع الأسنان على منصة باردة من اختيارك (على سبيل المثال، كيس ثلج محفوظ عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام) تحت مجهر تشريح عندما يكون جاهزا للتشريح (الشكل 2A).
  2. تطهير السطح البطني للحيوان مع 70 ٪ من الإيثانول. افتح تجويف البطن والحوض بمقص تشريح معقم وحرك الجهاز الهضمي إلى جانب واحد لتحديد موقع الرحم الظهري ثنائي القرنين. اتبع كل قرن رحمي على السطح لتحديد موقع كل قناة بيض ومبيض مغلف في وسادة الدهون في الرحم ، الموجودة أسفل الكلى مباشرة (الشكل 2B ، C).
  3. استئصال كل من قنوات البيض الجانبية مع المبيضين وجزء من قرن الرحم البعيد لا يزال متصلا باستخدام مقص التشريح. قطع كل قرن رحمي جانبي مع ما يقرب من 1-2 سم من القرن لا يزال متصلا بقناة البيض الملفوفة والمبيض (الشكل 2D). غمر الأنسجة على الفور في 2 مل من وسط التشريح البارد (انظر جدول المواد).

إعداد المنصة الباردة في إجراء التلقيح الاصطناعي ؛ إبرة ، مخطط طبق بتري ؛ توضيح هيكل المبيض.
الشكل 2: التشريح الكلي للمبيض وإعداد التشريح. تقع قناة البيض ظهريا في تجويف الحوض عند قاعدة الكلى داخل وسادة الدهون المبيضية (B). حدد موقع تشعب الرحم في تجويف الحوض (C) واتبع قرن الرحم الجانبي لتحديد موقع سلسلة الرحم وقناة البيض والمبيض (B). إزالة هذه الهياكل عن طريق قطع من خلال قرن رحم واحد والتشريح الخشن. ضعيه على منصة التشريح (A) ووضعي جزء الرحم على شمع الأسنان بإبرة (A و D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: اتركي ما يكفي من قرن الرحم سليما ومتصلا بقناة البيض للسماح بالالتصاق بمنصة التشريح (الشكل 2D).

  1. قم بتثبيت أنسجة الرحم على شمع الأسنان بإبرة معقمة 25 جم لتأمين الأنسجة للتشريح (الشكل 2A و D والشكل 3A). العمل تحت مجهر التشريح ، وتنظيف وتشريح وسادة الدهون المبيض والنسيج الضام للسماح بتصور واضح لقناة البيض (الشكل 3B).

مخطط عملية تشريح قناة البيض ؛ يشمل المبيض ، قرن الرحم ، إنفونديبولوم ، تحديد الأمبولة.
الشكل 3: التشريح المجهري لقناة البيض خطوة بخطوة. بعد إزالة الدهون المتبقية والنسيج الضام (A ، B) ، أضف التولويدين الأزرق إلى الأنسجة (C) ، ثم اغسلها لتسهيل التصور والإزالة اللاحقة للمبيض وفك لفائف الأنبوب (D-H). يمكن العثور على infundibulum بجانب البرزخ القريب والتقاطع الرحمي البوقي (UTJ). اسحب الطرف البعيد برفق أثناء القطع عند الميزوسالبينكس لفك لفائفه والكشف عن المنعطفات الداخلية لقناة البيض (H) للتوجيه من أجل التقسيم المناسب. شريط مقياس A-C = 500 ميكرومتر ، شريط مقياس D-H = 400 ميكرومتر (I) رسم كاريكاتوري للأجزاء المختلفة (غير مرسوم على المقياس). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. باستخدام حقنة 1 مل ، قم بتوزيع واحتضان قناة البيض الملصقة على الرحم في 1-2 قطرات من محلول صبغة تولويدين الأزرق المعقم بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية s-1 دقيقة. اشطفيه بمحلول دولبيكو الملحي المخزن بالفوسفات البارد (DPBS) وأزيلي كل السائل (الشكل 3C).
  2. اسحب المبيض برفق من قناة البيض الملفوفة واقطعه بعيدا عن الغشاء الجراب والرباط العريض لإزالة المبيض من قناة البيض دون المساس بأنسجة البوق (الشكل 3D ، E).
    ملاحظة: المبيض غير متصل بقناة البيض ولكنه مغلف في الغشاء الجراب مع قناة البيض (الشكل 2D) ومتصل بالجانب الجانبي من الرحم عبر الرباط العريض.

3. التشريح المجهري وتجزئة قناة البيض

  1. حدد موقع الطرف البعيد من قناة البيض الموجودة جانبيا للتقاطع الرحمي البوقي (UTJ). لفائف قناة البيض مرة أخرى على نفسها. وبالتالي يمكن وضع نهاية fimbrial جانبية إلى النهاية القريبة وهي نقطة انطلاق مناسبة للتوجيه لفك قناة البيض (الشكل 3F ، I).
    1. أثناء سحب الأنبوب بلطف ، قم بقطع الميزوسالبينكس (الشكل 3I) باستخدام مقص دقيق على شكل زنبرك لفك قناة البيض (الشكل 3G).
  2. بمجرد فك الأنبوب ، اقطع الأنبوب لإنتاج المناطق القاعدية والأمبولية والبرزخية (الشكل 3H).
    1. بعد استئصال infundibulum (نهاية fimbrial وساق قريب) ، قم باستئصال المنطقة الأمبولية عن طريق القطع بعد المنعطف البارز الثاني للأنبوب (قطع بين الدورتين الثانية والثالثة ، بطول 1 سم تقريبا). أخيرا ، اقطع الجزء المتبقي إلى UTJ ، وهي المنطقة البرزخية (الشكل 3H).
      ملاحظة: لن يتم فك قناة البيض بالكامل في بنية مستقيمة. سيحافظ الأنبوب على دوراته (الشكل 3H)3. واستنادا إلى المنعطفات اللاحقة التي تلي المنطقة الأمبولية، يمكن للمرء أن يقسم الأنبوب المتبقي إلى التقاطع الأمبولاري البرزخي والبرزخ3. بعد استئصال الأمبولة ، قطع بين الدورتين الخامسة والسادسة للحصول على تقاطع الأمبولاري البرزخي ؛ الأنبوب المتبقي (بدوره السادس إلى بداية UTJ) هو البرزخ3.
  3. قم على الفور بتجميد أجزاء الأنسجة المشوهة في النيتروجين السائل لعزل الحمض النووي الريبي أو إصلاح ومعالجة كل جزء للتضمين الموجه والتحليل النسيجي المناعي.
    1. أضف 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي البارد ومزيج خرزة التجانس 1: 1 (انظر جدول المواد) إلى الأنسجة إذا كنت تتابع استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الخطوة 5.1).

4. انفصال قناة البيض

  1. تابع من الخطوة 3.1.1 أعلاه) من أجل الانفصال الأمثل للظهارة ، افتح شق قناة البيض في المناطق حيثما أمكن (أي infundibulum و ampulla) لفضح الظهارة المضيئة (الشكل 4A).

مخطط المقطع العرضي لقناة فالوب ، استخراج العينة الظهارية ، إعداد التشريح ، معدات المختبر.
الشكل 4: تفكك خلايا قناة البيض ، الجزء 1. رسم كاريكاتوري يوضح كيفية كشف الظهارة البعيدة لتفكك الخلايا الأمثل (A) وصورة توضح أسهل طريقة لاستخدام شبكة 1 مم 2 (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. بدءا من منطقة فيمبرال ، باستخدام ملقط كرافعة مالية ، شق الأنبوب طوليا باستخدام مقص على شكل نابض.
  1. قم بطل الأجزاء المفتوحة الشقية وقناة البيض المتبقية إلى شرائح (~ 1-2 مم في الحجم) وأضف 5 مل من العازل الدافئ غير الأنزيمي (انظر جدول المواد) واحتضنها عند 37 درجة مئوية.
    1. أعد تعليق قطع الأنسجة والخلايا المنفصلة باستخدام ماصة لمبة كل 3 دقائق لمدة 9-10 دقائق. قم بتخفيف المخزن المؤقت للتفكك بنسبة 1: 1 باستخدام وسط تشريح بارد.
  2. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (350 × غرام ، 3 دقائق ، 4 درجات مئوية). أعد تعليق الخلايا في 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل RBC لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتخفيف 1:1 باستخدام وسط تشريح بارد.
  3. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (350 × غرام ، 3 دقائق ، 4 درجة مئوية) وإعادة تعليق في 5 مل من محلول pronase الباردة.
    1. احتضان في وسط الهضم pronase وإعادة تعليق كتل الخلايا مع ماصة لمبة كل 3-5 دقائق حتى يتم تحقيق تعليق خلية واحدة (~ 25-30 دقيقة).
      ملاحظة: من الأفضل تنفيذ هذه الخطوة في صفيحة أو قارورة زراعة الأنسجة للسماح بالمراقبة المستمرة لمنع التعرض المفرط غير الضروري للبروناس.
  4. مرر الخلايا عبر شبكة ماكرو معقمة (شبكة 1 مم × 1 مم مثبتة على أنبوب مخروطي مع شريط مطاطي (الشكل 4B)) لإزالة أي قطع أنسجة غير منفصلة متبقية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (350 × جم ، 3 دقائق ، 4 درجات مئوية) وإعادة تعليقها في وسط بارد مناسب للتحليل في اتجاه المصب (على سبيل المثال ، المخزن المؤقت FACS إذا استمر في تلطيخ التدفق الخلوي).

5. استخراج الحمض النووي الريبي من شرائح القنوات البيضاوية

  1. قم بتجانس العينات المجمدة في 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي في مجانس أنسجة خلاط رصاصة الخرز على المستوى 12 لفترتين (3 دقائق لكل منهما) عند 4 درجات مئوية باستخدام مزيج خرز الفولاذ المقاوم للصدأ.
    ملاحظة: للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، يجب نقل العينات على الفور من حالة التجميد المفاجئة إلى كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وعدم وزنها.
  2. تجانس جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 100-200 × g في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 5 ثوان تقريبا في درجة حرارة الغرفة لفصل السائل عن الخرز. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد.
  3. أضف 200 ميكرولتر أخرى من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي إلى الخرز لاستعادة المزيد من العينات ، تليها الطرد المركزي (100-200 × جم ، 5 ثوان ، درجة حرارة الغرفة). الجمع بين supernatants.
    ملاحظة: استخدم طرف ماصة صغير (معظم أطراف p200 مناسبة) لمنع ترحيل الخرز عند إزالة السوبرناتانت.
  4. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لفصل الحمض النووي الريبي وترسيبه تدريجيا. تم ترسيب العينات التمثيلية بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية مع 100٪ isopropanol (حوالي 2: 1 حجم ، isopropanol: المرحلة المائية المستردة).
  5. انقل راسب الحمض النووي الريبي الكامل مع المحلول إلى عمود دوران ملزم بالحمض النووي الريبي وأجهزة طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 9500 × جم. قم بتنقية الحمض النووي الريبي على العمود وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ، ثم قم بتمييع الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. تقييم الجودة / الكمية على مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم و / أو المحلل الحيوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينتج بروتوكول التفكك الموصوف 100،000-120،000 خلية لكل فأر مع تجميع كل من قنوات البيض. هذه الطريقة لطيفة بما يكفي لترك حدود الخلايا متعددة الأهداب سليمة ، مما يسمح بالتمييز بين الخلايا متعددة الأهداب والخلايا الإفرازية ، والتحقق من أن طريقة الهضم لطيفة بما يكفي لمنع إزالة التمايز. تظهر صور التألق المناعي التمثيلي في الشكل 5 كتلا صغيرة من الخلايا بعد الخطوة 4.2.1 ، ثابتة لمدة 3 دقائق في 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) / DPBS ، مغسولة بألبومين مصل البقر بنسبة 1٪ (BSA) / توين محلول ملحي مخزن مؤقتا (BT...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأجزاء الثلاثة من قناة البيض متميزة نسيجيا ومورفولوجيا ووظيفيا1،2،3. تختلف الظهارة اختلافا كبيرا من أحد طرفي قناة البيض إلى الطرف الآخر. تهيمن الخلايا الهدبية في الطرف الوهمي/القاعي، بينما تهيمن الخلايا الإفرازية في المنطقة البرزخية1. في حين تم الاعتراف بهذا التدرج العام لبعض الوقت ، فقد كشفت الأعمال الأخيرة عن المزيد من الفروق بين قطاعات القنوات البيضاء. وهكذا، في حين أن الخلايا الهدبية تصبح أقل تواترا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جائزة وزارة الدفاع للاختراق إلى AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). تم دعم KCR جزئيا من خلال زمالات داخلية: زمالة Pease Cancer Pre-PhD وزمالة Mary Galvin Burden Pre-PhD في العلوم الطبية الحيوية وجامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، الجوائز الداخلية: منحة أبحاث أطروحة لجنة زمالة مجلس الدراسات العليا وجائزة برنامج سنة أطروحة قسم الدراسات العليا. يشكر المؤلفون جيليان م. رايت وأليسا م. كوماري على المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها في وقت مبكر لهذه الطريقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مم مزيج حبة الفولاذ المقاوم للصدأNext AdvanceSSB05Mix 1: 1 مع 1.4 مم SSB14B ، معقم
1.4 مم مزيج حبة الفولاذ المقاومNext AdvanceSSB14BMix 1: 1 مع 0.5 مم SSB05 ، معقم
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A ، درجة الحموضة 7.4 (DPBS)Gibco21600-010إبرة باردة ومعقمة
25GBD305122
أطباق بتري معقمة 60 ممCorning430166
70 & mu ؛ شبكات الخلايا mFisherbrand22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 طقم Pico ChipAgilent 2100 Bioanalyzer5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue HomogenizerNext AdvanceBBY24M
BioanlyzerAgilent 2100 Bioanalyzer
الألبومين المصل البقريSigma AldrichA7906
Cold لوحة / حزمة / سطح من الاختيارN / AN / Aمحفوظة عند -20 &# 176 ؛ C لتشريح
شمع الأسنانPolysciences Inc.403
دولبيكو s النسر المعدل s متوسط (DMEM) / لحم الخنزير s F12Corning10-090-CVتحضير وسط التشريح: DMEM / Ham ' s F12 ، 10٪ FBS ، 25 ملي هيبس ، 1٪
مصل الأبقار الجنينيCorning 35-015CV
ملقط دقيق من الاختيارN / A
GlycineSigma AldrichG712bصور التحقق من صحة الخلايا المناعية
الماعز المضادة للفأر IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422صور التحقق من صحة الخلايا المناعية
الماعز المضادة للأرانب IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001صور التحقق من صحة الخلايا المناعية
HepesSigma AldrichH-3784
Hoescht 33342تقنيات إشارات الخلايا4082Sالتحقق من الصحة الكيميائية المناعية
المجهر المركب المقلوبKeyence BZ-X700
الفأر المضاد للفأر OccludinInvitrogen33-1500صور التحقق من الصحة الكيميائية المناعية
المخزن المؤقت للتفكك غير الأنزيميN / A5 ملي مولار EDTA ، 1 جم / لتر جلوكوز ، 0.4٪ BSA ، 1X DPBS
نايلون ماكرو 1 مم × 1 ممتوماس سينتيفيك1210U04
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتشP-6148صور التحقق من صحة الخلايا المناعية
Pen-StrepMP Biomedicals10220-718
إطالة تقنيات إشارات خلية كاشف الذهب المضاد للتلاشي9071Sالتحقق من صحة الخلايا المناعية: وسيط تركيب مضاد للبهتان
PronaseSigmaAldrich 10165921001تحضير وسط هضم البروناز: 0.15٪ بروناز في DMEM / Ham's F12 ، معقم
بروبيديوم يوديدروش11 348 639 001صور التحقق من صحة الجدوى
أرنب مضاد للفأر أسيتيل توبولينAbcamab179484صور التحقق من صحة الخلايا المناعية
عازلة تحلل كرات الدمالحمراء BD Biosciences555899
RNeasy Mini KitQiagen74134تستخدم لتنقية العمود في النص
مقص تشريح مجهري على شكل زنبركيRoboz SurgicalRS-5610
ماصات لمبة معقمة 3 ملGlobe Scientific137135
تولويدين الأزرقألفا إيسارJ66015تحضير محلول التولودين الأزرق: 1٪ في 1X DPBS ، معقم
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)N / AN / Aصور التحقق من الصحة الكيميائية المناعية ؛ 0.1 N كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 7.5 ، 1٪ Tween 20
Triton-X-100Mallinckrodt Inc.3555صور التحقق من الصحة الكيميائية المناعية
يشار إلى كاشف استخراج الحمض النووي الريبي TrizolInvitrogen15596026باسم كاشف استخراج الحمض النووي الريبي. الماء الخالي من النوسيلاز والكلوروفورم والأيزوبروبونال مطلوبان في تكملة لإجراء استخراج Trizol وفقا لإرشادات الشركة المصنعة
للصدأ صور صور

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
  2. Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).
  3. Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
  4. Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1(1927).
  5. Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
  6. Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
  7. Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
  8. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
  9. Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
  12. Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
  13. Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
  14. Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
  15. Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
  16. Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102(2015).
  17. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660(2020).
  18. Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298(2017).
  19. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565(2010).
  20. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  21. McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة