يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نظام زراعة الأعضاء لتقييم سمية السواغات والمستحضرات الصيدلانية للعلاج داخل العين

947 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63176

⸱

يناير 7, 2022

 ,  ,  , 
1School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Ocular Research & Education, School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 3Tonomed Inc

في هذه المقالة

ملخص

الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم التغيرات في نشاط التمثيل الغذائي والوظيفة الانكسارية للعدسة استجابة للعلاج التجريبي.

الملخص

باعتباره السبب الرئيسي للعمى ، فإن إعتام عدسة العين يمثل عبئا كبيرا على عشرات الملايين من الأشخاص المصابين بهذه الحالة على مستوى العالم. يعد التعرض للمواد الكيميائية ، من بين العوامل البيئية الأخرى ، سببا ثابتا لإعتام عدسة العين. يمكن لاختبار سمية العين تقييم ما إذا كانت المستحضرات الصيدلانية ومكوناتها قد تساهم في تلف العدسة التي قد تؤدي إلى إعتام عدسة العين أو تساعد في علاج إعتام عدسة العين.

يمكن استخدام الدراسات في المختبر والتجارب على في الجسم الحي لتقييم سلامة المواد الكيميائية قبل الدراسات السريرية. تم انتقاد اختبار Draize - المعيار الحالي في الجسم الحي لاختبار سمية العين والتهيج - لافتقاره إلى الحساسية والقياسات الموضوعية لتحديد سمية العين. المقايسات القائمة على الخلايا في المختبر محدودة لأن مزارع الخلايا لا يمكنها نمذجة عدسة وظيفية سليمة بشكل مناسب.

الطريقة الموضحة هنا هي بديل حساس في المختبر للتجارب على ، وهي مصممة لتقييم استجابة عدسة البقر السليمة للعلاج على مستوى النشاط الخلوي والأداء الانكساري العام. يتم استقلاب الكاشف غير السام ريزازورين بما يتناسب مع مستوى نشاط الخلية. يقيس اختبار الماسح الضوئي بالليزر قدرة العدسة على انكسار أشعة الضوء الساقطة إلى نقطة واحدة بأقل قدر من الخطأ ، ذات صلة مباشرة بوظيفتها الطبيعية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد كل من التغييرات الحادة والمتأخرة في العدسة ، وكذلك استعادة العدسة من التعرض الكيميائي أو البيئي.

المقدمة

يؤثر إعتام عدسة العين على أكثر من 20 مليون شخص ، وهو السبب الأكثر انتشارا للعمى في جميع أنحاءالعالم 1،2. يكون إعتام عدسة العين ناتجا بشكل شائع عن التغيرات المرتبطة بالعمر في العدسة ولكنه ناتج أيضا عن الصدمات أو الحالات الوراثية أو المرض أو التعرض للسموم2. في الوقت الحالي ، يتضمن العلاج تدخلا جراحيا لاستبدال العدسة ، وهو إجراء مكلف وجراحي يمكن الوصول إليه بشكل أساسي لأولئك الموجودين في البلدان المتقدمة. وجه العبء الكبير لإعتام عدسة العين عقودا من البحث نحو الوقاية من إعتام عدسة العين وتطوير العلاج غير الجراحي. في كلتا الحالتين ، تعتبر أهمية الاختبار قبل السريري للسمية والفعالية والحركية الدوائية لأدوية العيون أمرا بالغ الأهمية. تعتمد عملية تطوير الأدوية هذه بشكل كبير على المعلومات التي توفرها الدراسات التي أجريت على.

المعيار الحالي لاختبار سمية العين في الجسم الحي هو اختبار Draize ، الذي يتضمن توصيل مركب اختبار إلى كيس الملتحمة لحيوان حي. تم انتقاد الاختبار بشكل كبير ، لا سيما فيما يتعلق بأخلاقيات ، والذاتية ، وضعف التكرار ، والتباين3. بالإضافة إلى ذلك ، لا يوجد مكون في اختبار Draize يراقب بشكل مباشر تأثيرات مواد الاختبار على العدسة. تم استثمار جهد كبير في تطوير نماذج بديلة في المختبر 4. ومع ذلك ، لم يتم التحقق من صحة أي منها بشكل كاف ليحل محل اختبار Draize5. وبالمثل ، تواجه العديد من هذه النماذج قيودا فيما يتعلق بالتطبيق المباشر على إعتام عدسة العين والأمراض المعقدةالأخرى 6. على سبيل المثال ، الطرق التي تصنف شفافية العدسة عند وضعها على شبكة هي ذاتيةبطبيعتها 7. دراسات زراعة الخلايا موثوقة ومستخدمة بشكل كبير ، على الرغم من أن خصائص الخلية أحادية الطبقة قد تختلف عن زراعة الأنسجة الأولية8.

يمكن تشريح العدسات الكاملة من عيون وتربيتها للحفاظ على هيكلها ووظيفتها الأصلية. أحد المقايسات المفيدة لتقييم وظيفة العدسة مع الحفاظ على حالة العضو هو فحص الماسح الضوئي بالليزر للعدسة الذي يتضمن ماسحا ضوئيا تم تطويره في جامعة واترلو في كندا. الاختبار هو نظام مسح يستخدم سلسلة من إسقاطات الليزر لقياس الجودة البصرية أو الأداء الانكساري للعدسة. يتم مسح العدسات ضوئيا في غرف الاستزراع المخصصة المكونة من جزأين ، مما يسمح للحزم بالمرور من الأسفل عبر العدسة (الشكل 1 أ). تلتقط الكاميرا المثبتة داخل الماسح الضوئي صورة الليزر الذي يمر عبر العدسة في نقاط عديدة. يحسب برنامج الماسح الضوئي المسافة خلف العدسة التي تتقاطع عندها مع محور مركزي (مسافة الرأس الخلفي ، BVD) ، مما ينتج عنه سلسلة من القياسات التي تشير إلى مدى ثبات تركيز العدسة للضوء على نقطة واحدة (الشكل 1).

تساعد الخصائص الخلوية للعدسة ، مثل الترتيب المحكم والمنظم لخلاياها ، في الحفاظ على الشفافية وتقليل التشتت حتى تتمكن العدسة من التركيز الوظيفي على الضوء9. يمكن استخدام هذا المقياس لتفسير مدى أهمية تعطيل المادة الكيميائية للبنية الأساسية للعدسة ، مثل معامل الانكسار المتدرج ، ومقدار الوظيفة التي تتعرض للخطر بسبب العتامة المستحثة. تشير الدراسات الأخرى التي اتبعت استجابة العدسات المزروعة وحويصلات العدسات إلى أن تشتت الضوء هو نتاج التغيرات الهيكلية ، مقارنة بالتغيرات الأيضية ، وأن الاضطرابات في دهون العدسة والبروتينات قد تؤثر على معامل الانكسار وبالتالي زيادة التشتت10،11.

يمكن استخدام الماسح الضوئي بالليزر للعدسة جنبا إلى جنب مع الكواشف الأيضية في المقايسات لتحديد المقاييس الكيميائية الحيوية لسمية الخلية. Resazurin هو كاشف كيميائي غير سام يتم استقلابه بواسطة الخلايا النشطة ، مما ينتج عنه منتج مخفض (ريسوروفين) مع مضان قابلللقياس 12. العدسة خالية إلى حد كبير من العضيات ، باستثناء الميتوكوندريا النشطة الأيضية المركزة داخل الظهارة الأمامية وخلايا الألياف القشرية السطحية ، مما يفي بمتطلبات طاقةالعدسة 13،14. قد يؤدي تلف العدسة على المستوى الخلوي إلى تعطيل عملية التمثيل الغذائي وغالبا ما يسبق ظهور التغيرات الهيكلية المسببة للأمراض وإعتام عدسة العين15.

الغرض من هذه الطريقة هو تقييم تأثير التعرض الحيوي والبيئي على العدسة ، مما قد يساهم في تطور إعتام عدسة العين. يتضمن البروتوكول مقياسين لتقييم تأثير العلاج باستخدام عدسة الأبقار المستنبتة. تتمثل ميزة هذا النهج في أنه يوفر تقييما خلويا ووظيفيا لكيفية استجابة العدسة كنسيج أولي للعلاج. إنه تقييم حساس وموضوعي للعدسة مقارنة بالطرق الشائعةالأخرى 16،17،18.

تم استخدام النموذج بنجاح لتقييم تأثيرات التعرض المختلفة ، بما في ذلك المواد الخافضة للتوتر السطحي والمنتجات الاستهلاكية والكحول والأشعة فوق البنفسجية17،19،20. التغييرات في الجودة البصرية موجودة باستمرار في العدسات المستنبتة استجابة للتعرض للمواد السامة21. إن قدرة هذه الطريقة على الحفاظ على ثقافة العدسة على المدى الطويل مناسبة تماما لمراقبة التأثير المتأخر المحتمل للمركب ، واستعادة العدسة من التلف المستحث أو إعتام عدسة العين22،23. يمكن استخدام النتائج الناتجة عن تطبيق هذا البروتوكول لتقليل الاعتماد على التجارب على في تطوير منتجات طب العيون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع البروتوكولات التجريبية وفقا لسياسات أخلاقيات جامعة واترلو للبحث باستخدام الأنسجة الحيوانية. تم توفير عيون الأبقار للدراسة الحالية من المسلخ ، وتم الحصول عليها من أبقار غير حلوب في غضون ساعات قليلة من الموت ، وتم تشريحها على الفور ، وهي عملية تستغرق ما يصل إلى 8 ساعات من الحصول على العينين. يجب تشريح العيون على الفور للحفاظ على جودة العقم والتشريح. يتم تحضير وسط الاستزراع إلى درجة حموضة 7.4 ويتم ترشيحه معقم قبل المكملات مع FBS21. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة ، مع إدراج مصادر المواد والمعدات في جدول المواد.

1. ثقافة العدسات البقرية

  1. قم بتشريح العدسات عن طريق إزالة العضلات والأنسجة خارج العين من الصلبة ، وإزالة النصف الخلفي من الكرة الأرضية والجسم الزجاجي ، وإزالة القزحية والجسم الهدبي مع العدسة ، ثم قطع المرفقات النطاقية ، مع وضع القطع النهائي بحيث تسقط العدسة في غرفة الثقافة المملوءة بالمتوسط.
  2. استزراع العدسات التي تم تشريحها في غرف مخصصة بقاعدة مكيفة لتناسب نظام المسح الضوئي بالليزر، مع 21 مل من الوسط المصفى المعقم، عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. استخدم 3٪ وسط استزراع مكملات مصل الأبقار الجنينية (FBS) مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين، 9.4 جم/لتر M-199، 0.1 جم/لتر ل-جلوتامين، 5.96 جم/لتر هيبلس هيبسول، 2.2 جم/لتر بيكربونات الصوديوم، 7 مل/لتر هيدروكسيد الصوديوم. قم بتخزين وسط الاستزراع غير المستخدم في الثلاجة لمدة تصل إلى 7 أيام.
  3. استبدل وسط الثقافة كل 1-2 أيام. قم بتسخين وسط المزرعة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. استخدم ماصة باستور معقمة متصلة بالشفط لشفط الوسط من غرفة الاستزراع الفردية وتجديدها على الفور بالوسط الإضافي.
  4. قم بزراعة العدسات لمدة 48 ساعة بعد التشريح لإتاحة الوقت لظهور الضرر المادي. فحص العدسات ومسحها ضوئيا للتأكد من جودتها البصرية وفقا للقسم 4 قبل إدراجها في التجربة.
    ملاحظة: يتم توجيه العدسات ووجهها لأسفل استعدادا لمقايسة الماسح الضوئي بالليزر.

2. إجراء التحكم

  1. قم بإعداد محلول بالتركيز المطلوب لعامل الذوبان المتوافق مع المركب الكيميائي ووسط الاستزراع.
  2. قم بإعداد محلول التحكم في السيارة عن طريق إضافة عامل الذوبان إلى الوسط التكميلي. قم بتسخين محلول التحكم لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التجريب.
  3. استخدم ماصة باستور متصلة بالشفط لشفط وسط المزرعة من غرف عدسة التحكم. تجديد الغرف بمحلول التحكم. إذا لزم الأمر ، قم بتنفيذ هذه الخطوة مع عينات في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: مطلوب حجم لا يقل عن 7 مل لتغطية العدسة بالكامل في وضع الوجه الأمامي لأعلى. كانت شروط الضوابط في الدراسة الحالية 21 مل من وسيط التحكم غير المعالج ، و 21 مل من وسط التحكم في السيارة ، و 7 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
  4. استزراع العدسات في وسط التحكم لمدة يومين ، ثم استبدلها بوسيط تحكم جديد وفقا للقسم 1. بالنسبة للتعرضات قصيرة المدى، قم بشفط محلول التحكم من الغرف وقم بشطف ثلاث مرات على الأقل باستخدام وسط مزرعة غير مكمل قبل استئناف بروتوكول زراعة العدسة كما هو موضح في القسم 1.0.
  5. اسمح للعدسات بالتأقلم في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 3.5 ساعة على الأقل قبل تقييم الجودة البصرية.

3. إجراء التعرض

  1. قم بإعداد محلول بالتركيز المطلوب لعامل الذوبان المتوافق مع المركب الكيميائي ووسط الاستزراع. امزج المادة الكيميائية مع عامل الذوبان ، مما يتيح الوقت المناسب للتفاعل إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: تم استخدام 2-هيدروكسي بروبيل-β-سيكلودكسترين في الدراسة الحالية لتعزيز قابلية ذوبان اللانوستيرول (0.033 جم / لتر) في المتوسط. تم تحضير محلول كلوريد البنزالكونيوم (BAK 0.0075٪) باستخدام PBS.
  2. ادمج المادة الكيميائية القابلة للذوبان في وسط الاستزراع. قم بإعداد حجم إجمالي كاف لتوفير 21 مل من عينات العدسة المتوسطة لجميع العينات. قم بتسخين الوسط التجريبي لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التجريب.
  3. استخدم ماصة باستور متصلة بالشفط لشفط وسط المزرعة من غرف العدسة. قم بتجديد الغرف على الفور بمحلول الاختبار. بعد فترة التعرض ، استبدلها بوسط مزرعة مكمل ، وقم بشطف أولا إذا لزم الأمر. إذا لزم الأمر ، قم بتنفيذ هذه الخطوة مع عينات في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: في الدراسة الحالية ، كانت ظروف الاختبار 21 مل من الوسط المكمل باللانوستيرول و 7 مل من محلول BAK 0.0075٪. مطلوب حجم لا يقل عن 7 مل لتغطية العدسة بالكامل. في هذه الحالة ، يجب أولا توجيه العدسات الأمامية لأعلى. يمكن استخدام ماصة باستور لإنشاء تيار في غرفة الاستزراع مع بعض وسط الاستزراع المحيط لإعادة وضع العدسة.
  4. أعد العدسات إلى الحاضنة لمدة 3.5 ساعة على الأقل للتأقلم قبل تقييم الجودة البصرية.
    ملاحظة: يتم توجيه العدسات ووجهها لأسفل استعدادا لمقايسة الماسح الضوئي بالليزر.

4. فحص الجودة البصرية (عدسة الماسح الضوئي بالليزر)

  1. تأكد من توجيه العدسات بحيث يكون وجهها الأمامي لأسفل ومستويا بصريا في غرفة المزرعة، باستخدام التقنية من الخطوة 3.3 لضبط موضع العدسة إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يضمن هذا الموضع أن ينعكس الشعاع الساقط لأعلى عبر قاع الغرفة ويمر عبر العدسة من السطح الأمامي إلى السطح الخلفي.
  2. ضع حجرة ثقافة العدسة في الماسح الضوئي بالليزر بحيث يتناسب دبوس حامل الغرفة مع الفتحة الموجودة في قاعدة الغرفة.
  3. حدد العدسة ونقطة المسح التي تريد إجراء المسح لها، وانقر بزر الماوس الأيمن على عدسة المسح الضوئي، وانتظر حتى يطالب الماسح الضوئي بالعثور على الشعاع ومحاذاته. حدد البداية ونقاط النهاية البعيدة جيدا للحزمة الموجودة خلف العدسة. تأكد من محاذاة الشعاع المركزي باستخدام أزرار الضبط الإجمالية والدقيقة في برنامج الماسحة الضوئية ومقبض الضبط على الماسحة الضوئية. عند محاذاة الشعاع ، انقر فوق معايرة وأدخل مجموعة مناسبة من الخطوات الشعاعية وفصل الحزمة.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة باستخدام عدسة البقر ، تم ضبط إعدادات الخطوات الشعاعية وفصل الحزمة على 10 خطوات و 0.5 مم على التوالي. يعمل الفحص الأول الذي يقوم به الماسح الضوئي على معايرة الماسح الضوئي بالليزر. هذا مطلوب مرة واحدة ، ويمكن إجراء جميع عمليات مسح العدسة الإضافية مباشرة بعد المحاذاة.
  4. بمجرد معايرة الماسح الضوئي، انقر فوق مسح ضوئي. انتظر حتى يتم إنشاء قيم لمتوسط BVD والانحراف المعياري والخطأ على طول محور واحد بعد الانتهاء من مسح العدسة ، وتم تعيين نطاق الحزمة. اضبط النطاق من حيث تخرج الحزم من العدسة إلى نقطة النهاية المطلوبة، وحدد المسافة القصوى خلف العدسة مع استبعاد أي تداخل واضح.
  5. استخدم المخطط الذي تم إنشاؤه لعرض مسافات الرأس الخلفي الفردية لكل حزمة.
    ملاحظة: استبعاد الحزم التي تمر عبر خيوط العدسة. لاستبعاد شعاع، استخدم وسيلة الإيضاح التي تظهر على الشاشة للنقر بزر الماوس الأيمن على شعاع فردي وتحديد استبعاد.
  6. قم بتدوير موضع قاعدة غرفة الاستزراع يدويا داخل الماسحة الضوئية بمقدار 90 درجة، بحيث يكون المسح الثاني على طول سطح العدسة الأمامي عموديا على الفحص السابق. تأكد من محاذاة الحزمة المركزية كما هو مفصل في الخطوة 4.3، ثم امسح العدسة ضوئيا.

5. فحص النشاط الأيضي (ريزازورين)

  1. تحضير وسط بدون FBS. قم بتسخين الوسط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تحضير 50 مل من كاشف ريزازورين 8٪ في وسط غير مكمل.
    ملاحظة: يكفي تحضير 50 مل لملء جميع الآبار في صفيحة من 12 بئرا. يجب تحضير المحلول معقما في ظل ظروف معتمة في حاوية معتمة ، لأن الريزازورين حساس للضوء.
  2. أضف 3.8 مل من محلول ريزازورين بنسبة 8٪ إلى كل بئر داخل صفيحة شفافة القاع ومعقمة مكونة من 12 بئرا لتغطية العدسة.
  3. استخدم مجارف معدنية معقمة لرفع العدسات بعناية من تحت السطح الخلفي وإجراء الشطف باستخدام ماصة باستور لغسل العدسة بحجم صغير من وسط المزرعة غير المكملة. ضع العدسات بشكل فردي في كل بئر.
  4. احتضان لوحة البئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة العدسات ذات المجارف المعدنية من الآبار وضعها في حاوية التخلص من فضلات. انقل عينة سعة 100 ميكرولتر من كل بئر إلى صفيحة معقمة ذات قاع شفاف وسعة 96 بئرا.
    ملاحظة: يمكن تقييم العدسات عدة مرات باستخدام مقايسة النشاط الأيضي. في هذه الحالة ، أعد العدسات إلى غرف الثقافة بوسط جديد للحضانة. من الأفضل إجراء فحص النشاط الأيضي بمجرد اكتمال جميع عمليات المسح ، حيث قد تؤثر الصبغة على قياسات BVD.
  5. قم بقياس مضان نقطة النهاية للعينات سعة 100 ميكرولتر باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت ، مع ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث عند 560 نانومتر و 590 نانومتر ، على التوالي.

6. تحليل البيانات

  1. بالنسبة لمقايسة الجودة البصرية ، احسب متوسط القيم المحسوبة بواسطة البرنامج لخطأ BVD24 من فحصي الفحص اللذين تم إجراؤهما في كل نقطة زمنية. قم بإجراء هذا الحساب لجميع العدسات وجميع نقاط الفحص.
  2. بالنسبة لمقايسة النشاط الأيضي ، اجمع قيم التألق النسبي لنقطة النهاية التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ اللوحة. تطبيع البيانات عن طريق تعيين متوسط جميع قيم التحكم عند نقطة المسح الضوئي إلى 100٪. احسب نشاط كل عدسة كنسبة مئوية من متوسط قيمة التحكم لنقطة المسح هذه.
  3. قم بإجراء اختبار الوضع الطبيعي لجميع مجموعات التجارب. بافتراض أن البيانات طبيعية ، قم بتحليل اختلافات خطأ BVD بين عدسات التحكم والعدسات التجريبية باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء اختبار المقارنات المتعددة اللاحق ل Tukey. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه واختبار Dunnett اللاحق لبيانات نشاط التمثيل الغذائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 2 والشكل 3 (ن = 6) نتائج دراسة تختبر تأثير العلاج الكيميائي (اللانوستيرول) على عدسة الأبقار. اللانوستيرول هو ستيرول طبيعي في العدسة أظهر ذات مرة نتائج واعدة كتدخل صيدلاني محتمل لإعتام عدسة العين25 ، على الرغم من أن هذا لم يثبتبعد 26. تضمن تصميم الدراسة وسيطا وتحكم في المركبة للمجمع. لم يكن هناك فرق كبير بين المركبة (2-هيدروكسي بروبيل-β-سيكلودكسترين) والتحكم المتوسط (ص > 0.05)، مما يشير إلى أن أي تأثير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الغرض من هذا البروتوكول هو التقييم المباشر لتأثيرات المواد الكيميائية أو التعرض البيئي على العدسة في زراعة الأنسجة الأولية. أولا ، يتم تشريح العدسات ومسحها ضوئيا للحصول على الجودة البصرية. الوقاية من التلوث وضمان جودة التشريح أمران بالغان الأهمية. يتم مسح العدسات ضوئيا على فترات دورية لمراقبة التغيرات في وظيفة الانكسار باستمرار فيما يتعلق بمجموعة التحكم أو حالة ما قبل التعرض. يمثل اختبار النشاط الأيضي نقطة نهاية لتحديد ما إذا كان التعرض قد أثر على التمثيل الغذائي الخلوي. هذه هي الخطوات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

شكرا لمجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة (NSERC) والصندوق الاستئماني الكندي لتعليم البصريات (COETF) على الأموال المخصصة لهذا المشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(2-هيدروكسي بروبيل) - بيتا سيكلودكسترينسيجما-ألدريتشH107مسحوق
1 لتر نظام ترشيح أعلى الزجاجةVWR97066-204تجميع كامل ، زجاجة أعلى ، 0.2 مو ؛ م
100 مم طبق بتريVWR89022-320قابل للانزلاق ، نمط موفر للوسائط ، معقم
12 لوحبئر Corning353043معقم ، قاع شفاف
35 مم طبق بتريVWR25373-041أطباق بتري فالكون التي تستخدم لمرة واحدة ، معقمة ، Corning
96 لوحة بئرVWR29442-072معقمة ،
صفيحة شفافة من Alamar Blue (ريزازورين)فيشر العلميDAL1100المجسات الجزيئية كاشف صلاحية الخلية
محلول كلوريد البنزالكونيومSigma-Aldrich6324950٪ في H2< / sub>0
خزانة
الحيوية Cytation 5 قارئ لوحةBioTekCYT5MPVCell Imaging قارئ متعدد الأوضاع
مصل الأبقار الأبقار الجنينThermoFischer Scientific12484028مؤهل ، معطل بالحرارة ، كندا
HEPESSigma-AldrichH3375لزراعة الخلايا ،
حاضنة
LanosterolSigma-AldrichL5768& ge ؛ 93٪ ، مسحوق
L-glutamineSigma-Aldrichلزراعة الخلايا ، مسحوق
متوسط (M-199)Sigma-AldrichM3769معدل ، مع Earle & Prime ؛ أملاح s ، بدون L-glutamine ، بيكربونات الصوديوم ، وأحمر الفينول ، مسحوق ، مناسب لزراعة الخلايا
ماصات5 3/4 '' ، مع وبدون قطن
Penicillin-StreptomycinThermoFischer15140122(10،000 U / mL) محلول
ملحي للفوسبات (PBS)سائل ، معقم ، مناسب لزراعة الخلايا
أطراف الماصة (100 & micro; لتر ، 1,000 وميكرو ؛ لتر ، 5,000 وميكرو ؛ L)VWRSterile
ScanTox (عدسة ماسح ضوئي ليزر)/ Aداخليا مطورة خصيصاتقوم بالمسح الضوئي باستخدام الليزر لتحديد الجودة البصرية للعدسة
غرفة ثقافة ScanToxتم تطويرها داخلياN / Aمطورة خصيصا لتثبيت عدسة البقر في مكانها أثناء الاختبار والاستزراع
بيكربونات الصوديومSigma-AldrichS5761لزراعة الخلايا والمسحوق
هيدروكسيد الصوديومSigma-AldrichS27701.0 N ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
السلامة مسحوق باستور سائل علمي N

المراجع

  1. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  2. Priority eye diseases. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/blindness/causes/priority/en/index1.html (2014).
  3. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Survey of Ophthalmology. 45 (6), 493-515 (2001).
  4. Jester, J. V. Extent of corneal injury as a biomarker for hazard assessment and the development of alternative models to the Draize rabbit eye test. Cutaneous and Ocular Toxicology. 25 (1), 41-54 (2006).
  5. Vinardell, M. P., Mitjans, M. Alternative methods for eye and skin irritation tests: an overview. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (1), 46-59 (2008).
  6. Bonneau, N., Baudouin, C., Reaux-Le Goazigo, A., Brignole-Baudouin, F. An overview of current alternative models in the context of ocular surface toxicity. Journal of Applied Toxicology. , (2021).
  7. Bree, M., Borchman, D. The optical properties of rat, porcine and human lenses in organ culture treated with dexamethasone. Experimental Eye Research. 170, 67-75 (2018).
  8. Leist, C. H., Meyer, H. P., Fiechter, A. Potential and problems of animal cells in suspension culture. Journal of Biotechnology. 15 (1-2), 1-46 (1990).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Alghamdi, A. H. S., Mohamed, H., Sledge, S. M., Borchman, D. Absorbance and light scattering of lenses organ cultured with glucose. Current Eye Research. 43 (10), 1233-1238 (2018).
  11. Tang, D., et al. Light scattering of human lens vesicles in vitro. Experimental Eye Research. 76 (5), 605-612 (2003).
  12. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  13. Bantseev, V., Sivak, J. G. Confocal laser scanning microscopy imaging of dynamic TMRE movement in the mitochondria of epithelial and superficial cortical fiber cells of bovine lenses. Molecular Vision. 11, 518-523 (2005).
  14. Remington, L. A., McGill, E. C. Clinical Anatomy of the Visual system. , Butterworth-Heinemann. Boston. (1998).
  15. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-44 (2000).
  16. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high through-put screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  17. Bantseev, V., et al. Mechanisms of ocular toxicity using the in vitro bovine lens and sodium dodecyl sulfate as a chemical model. Toxicological Sciences. 73 (1), 98-107 (2003).
  18. Sivak, J. G., Herbert, K. L., Segal, L. Ocular lens organ culture as a measure of ocular irritancy: The effect of surfactants. Toxicology Methods. 4 (1), 56-65 (1994).
  19. Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology In Vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
  20. Sivak, J. G., Stuart, D. D., Herbert, K. L., Van Oostrom, J. A., Segal, L. Optical properties of the cultured bovine ocular lens as an in vitro alternative to the Draize eye toxicity test: Preliminary validation for alcohols. Toxicology Methods. 2 (4), 280-294 (1992).
  21. Wong, W., Sivak, J. G., Moran, K. L. Optical response of the cultured bovine lens; testing opaque or partially transparent semi-solid/solid common consumer hygiene products. Toxicology In Vitro. 17 (5-6), 785-790 (2003).
  22. Sivak, J. G., Stuart, D. D., Weerheim, J. A. Optical performance of the bovine lens before and after cold cataract. Applied Optics. 31 (19), 3616-3620 (1992).
  23. Stuart, D. D., Sivak, J. G., Cullen, A. P., Weerheim, J. A., Monteith, C. A. UV-B radiation and the optical properties of cultured bovine lenses. Current Eye Research. 10 (2), 177-184 (1991).
  24. Dovrat, A., Sivak, J. G. Long-term lens organ culture system with a method for monitoring lens optical quality. Photochemistry and Photobiology. 81 (3), 502-505 (2005).
  25. Zhao, L., et al. Lanosterol reverses protein aggregation in cataracts. Nature. 523 (7562), 607-611 (2015).
  26. Daszynski, D. M., et al. Failure of oxysterols such as lanosterol to restore lens clarity from cataracts. Scientific Reports. 9 (1), 8459(2019).
  27. Baudouin, C., Denoyer, A., Desbenoit, N., Hamm, G., Grise, A. In vitro and in vivo experimental studies on trabecular meshwork degeneration induced by benzalkonium chloride (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 110, 40-63 (2012).
  28. Schartau, J. M., Kroger, R. H., Sjogreen, B. Short-term culturing of teleost crystalline lenses combined with high-resolution optical measurements. Cytotechnology. 62 (2), 167-174 (2010).
  29. Truscott, R. J. Age-related nuclear cataract-oxidation is the key. Experimental Eye Research. 80 (5), 709-725 (2005).
  30. Deeley, J. M., et al. Human lens lipids differ markedly from those of commonly used experimental animals. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (6-7), 288-298 (2008).
  31. Bantseev, V., et al. Effect of hyperbaric oxygen on guinea pig lens optical quality and on the refractive state of the eye. Experimental Eye Research. 78 (5), 925-931 (2004).
  32. Choh, V., Sivak, J. G. Lenticular accommodation in relation to ametropia: the chick model. Journal of Vision. 5 (3), 165-176 (2005).
  33. Oriowo, O. M., et al. Evaluation of a porcine lens and fluorescence assay approach for in vitro ocular toxicological investigations. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 30 (5), 505-513 (2002).
  34. van Doorn, K. L., Sivak, J. G., Vijayan, M. M. Optical quality changes of the ocular lens during induced parr-to-smolt metamorphosis in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Ocular lens optical quality during induced salmonid metamorphosis. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 191 (7), 649-657 (2005).
  35. Herbert, K. L., Sivak, J. G., Bell, R. C. Effect of diabetes and fructose/non-fructose diet on the optical quality (cataracts) of the rat lens. Current Eye Research. 19 (4), 305-312 (1999).
  36. Wormstone, I. M., Collison, D. J., Hansom, S. P., Duncan, G. A focus on the human lens in vitro. Environmental Toxicology and Pharmacology. 21 (2), 215-221 (2006).
  37. Oyster, C. W. The human eye: structure and function. Sinauer Associates. , Sunderland, Massachussetts. (1999).
  38. Xu, M., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

السمية العينيةتقييم الساداختبار سمية العدسةالمقايسة المختبريةعدسة بقريةاستقلاب الريسازورينالماسح الليزري للعدسةالأداء الانكساري

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.