الأطراف المؤتلفة هي نموذج تجريبي قوي يسمح بدراسة عملية تمايز الخلايا وتوليد الأنماط تحت تأثير الإشارات الجنينية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد أطراف مؤتلفة مع خلايا الجلد المتوسط لأطراف الدجاج ، قابلة للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى التي تم الحصول عليها من كائنات حية مختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحص الأطراف المؤتلفة للدجاج لفهم التشكل والتنميط والخطوات المبكرة في تمايز الخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمايز الخلايا هو عملية مضبوطة بدقة لالتزام الخلية مما يؤدي إلى تكوين أنواع مختلفة من الخلايا المتخصصة أثناء إنشاء الأنسجة والأعضاء النامية. يتم الحفاظ على هذه العملية بنشاط في مرحلة البلوغ. تمايز الخلايا هو عملية مستمرة أثناء تطوير وتوازن الأعضاء. إن فهم الخطوات المبكرة لتمايز الخلايا أمر ضروري لمعرفة العمليات المعقدة الأخرى مثل التشكل الشكلي. وبالتالي ، فإن أطراف الدجاج المؤتلفة هي نموذج تجريبي يسمح بدراسة تمايز الخلايا وتوليد النمط تحت إشارات النقش الجنينية. هذا النموذج التجريبي يقلد بيئة في الجسم الحي . يقوم بتجميع الخلايا المعاد تجميعها في غطاء الجلد الخارجي الذي تم الحصول عليه من برعم الأطراف المبكر. في وقت لاحق ، يتم نقل الأديم الخارجي وزرعه في مستقبل جنين الفرخ للسماح بتطوره. تم استخدام هذا الفحص بشكل رئيسي لتقييم خلايا برعم الأطراف في الجلد المتوسط. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه على الخلايا الجذعية أو السلفية الأخرى من الكائنات الحية الأخرى.
المقدمة
الطرف الفقاري هو نموذج هائل لدراسة تمايز الخلايا ، وانتشار الخلايا ، وموت الخلايا ، وتكوين النمط ، والتشكل 1,2. أثناء التطور ، تظهر الأطراف على شكل انتفاخات من الخلايا المشتقة من الأديم المتوسط للصفيحة الجانبية1. تتكون براعم الأطراف من نواة مركزية من خلايا الجلد المتوسط التي تغطيها الأديم الخارجي. من هذا الهيكل المبكر ، يظهر طرف كامل وجيد التشكيل. بعد ظهور برعم الطرف ، يتم التعرف على ثلاثة محاور: (1) المحور القريب البعيد ([PD] من الكتف إلى الأصابع) ، (2) المحور الظهري البطني ([DV] من الجزء الخلفي من اليد إلى راحة اليد) ، و (3) الأمامي الخلفي ([AP] الإبهام إلى الإصبع). يعتمد المحور القري....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة هذا البحث والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لرعاية واستخدام المختبر التابع لمعهد التحقيقات الطبية الحيوية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM ، مكسيكو سيتي ، المكسيك). ويبين الشكل 1 ألف مخططا انسيابيا تخطيطيا للخطوات العامة لهذا البروتوكول.
1. حضانة الأجنة وتحديد الجدوى
- احتضان بيض الدجاج المخصب عند 38 درجة مئوية ورطوبة نسبية 60٪ لمدة ثلاثة أيام ونصف تقريبا حتى تصل إلى مرحلة 22 HH (وفقا لهاميلتون وهامبورغر ، 1951)16.
ملاحظة: يمكن تخزين بيض الدجاج المخصب الطازج على درجة حرارة 15 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.- لاحتضان ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
التعرف على طرف مؤتلف جيد الأداء
بعد التطعيم ، تم إرجاع الأجنة التي تم التلاعب بها إلى الحاضنة للسماح ل RL بالتطور. ارتبط وقت الحضانة بمتطلبات التجربة. ومع ذلك ، يمكن تمييز RL بسهولة بعد 12 ساعة من الزرع. لتحديد ما إذا كانت عملية الزرع كافية، لوحظ أن RL هو نتوء مرتبط بشكل آمن بجدار الجلد المتوسط للجنين المتبرع (الشكل 2A). على العكس من ذلك ، سواء فشلت صلاحية الخلية و / أو الكسب غير المشروع ، تم فصل RL عن جدار الجلد المتوسط أو قدم مورفولوجيا خشنة (الشكل .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بشكل عام ، يمكن تقسيم بروتوكول RL إلى خمس خطوات: (1) حضانة الأجنة ، (2) الحصول على خلايا الأطراف المتوسطة لملء الأديم الخارجي ، (3) الحصول على الأديم الخارجي ، (4) تجميع خلايا الجلد المتوسط داخل أغطية الجلد الخارجي ، و (5) زرع الأديم الخارجي المملوء في الأجنة المضيفة. القيد الرئيسي لتقنية RL هو البروتوكول الطويل والمفصل ، والذي يحتوي على العديد من النقاط الحرجة التي تتطلب الصبر لأداء الأداء المناسب. لإكمال البروتوكول بنجاح ، يجب تحديد اللحظات الحرجة. أثناء شراء خلايا الجلد المتوسط ، تعد سلامة الخلايا وقابليتها للبقاء أمر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر إستيفانيا غاراي باتشيكو على الصور في الشكل 2 وماريا فاليريا شيمال-مونتيس دي أوكا على الأعمال الفنية. وقد دعم هذا العمل المديرية العامة للأكاديمية الشخصية (DGAPA) - الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك [أرقام المنح IN211117 و IN213314] والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT) [رقم المنحة 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] الممنوحة ل JC-M. حصل JC M-L على زمالة ما بعد الدكتوراه من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ألسيان بلو 8GX | سيجما | A5268 | |
| سكين شق بزاوية | Alcon | 2.75 مم DB | |
| ملقط حاد | أدوات العلوم الدقيقة | 11052-10 | |
| كولاجيناز النوع الرابع | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| حاضنة البيض | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| مصل الأبقار الجنيني | جيبكو | 16000069 | |
| ملقط جراحي ناعم | أدوات العلوم الدقيقة | 9115-10 | |
| هانكس محلول ملح متوازن | سيجما | H6648 | |
| الطرد المركزي | الدقيقة Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| سلك البلاديوم | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| صحن بتري | 705001 | ||
| ماصة | crmglobe | PF1016 | |
| مجهر مجسم | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| إبرة التنغستن | GoodFellow | E74-15096 / 01 |
المراجع
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
