Method Article

منصة اكتشاف قوية لتحديد الوسطاء الجدد لورم خبيث سرطان الجلد

DOI:

10.3791/63186

⸱

March 8th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة سير عمل التقنيات المستخدمة لاختبار الوسطاء المرشحين الجدد لورم خبيث سرطان الجلد وآلية (آليات) عملهم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانبثاث هو عملية معقدة ، تتطلب من الخلايا التغلب على الحواجز التي يتم نمذجتها بشكل غير كامل فقط من خلال الفحوصات في المختبر . تم إنشاء سير عمل منهجي باستخدام نماذج قوية وقابلة للتكرار في الجسم الحي وطرق موحدة لتحديد اللاعبين الجدد في ورم خبيث سرطان الجلد. يسمح هذا النهج باستنتاج البيانات في مراحل تجريبية محددة لتوصيف دور الجين بدقة في الانبثاث. يتم إنشاء النماذج عن طريق إدخال خلايا سرطان الجلد المعدلة وراثيا عن طريق الحقن داخل القلب أو داخل الأدمة أو تحت الجلد في الفئران ، تليها المراقبة بالتصوير التسلسلي في الجسم الحي . بمجرد الوصول إلى نقاط النهاية المحددة مسبقا ، يتم حصاد الأورام الأولية و / أو الأعضاء الحاملة للنقائل ومعالجتها لإجراء تحليلات مختلفة. يمكن فرز الخلايا السرطانية وإخضاعها لأي من منصات "omics" العديدة ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. تخضع الأعضاء للتصوير والتحليلات المرضية النسيجية المناعية لتحديد العبء الكلي للنقائل ورسم خريطة لموقعها التشريحي المحدد. يمكن اعتماد خط الأنابيب الأمثل هذا ، بما في ذلك البروتوكولات الموحدة للتطعيم والمراقبة وحصاد الأنسجة ومعالجتها وتحليلها ، للثقافات قصيرة الأجل المشتقة من المريض وخطوط الخلايا البشرية والفئرانية الراسخة لمختلف أنواع السرطان الصلبة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن ارتفاع معدل الوفيات المرتبط بسرطان الجلد النقيلي إلى جانب زيادة معدل الإصابة بسرطان الجلد في جميع أنحاء العالم1 (زيادة تقدر بنسبة 7.86٪ بحلول عام 2025) يستدعي اتباع نهج علاجية جديدة. يتوقف التقدم في اكتشاف الأهداف على نماذج قابلة للتكرار من ورم خبيث ، وهي عملية معقدة للغاية. خلال خطوات الشلال النقيلي ، يجب على خلايا سرطان الجلد التغلب على حواجز لا حصر لها لتحقيق التهرب من الجهاز المناعي واستعمار الأنسجة البعيدة2. تنشأ مرونة خلايا سرطان الجلد وقدرتها على التكيف من العديد من العوامل ، بما في ذلك عبئها الطفري الجيني العالي 3 وأصلها العصبي ، مما يمنح اللدونة الظاهرية الحاسمة3،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية المشاركة في البروتوكول التالي من قبل لجنة جامعة نيويورك المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC). يتم إجراء جميع الإجراءات في مرافق معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية المختبرات (AAALAC). ويبين الشكل 1 النهج التجريبي العام.

1. ثقافات سرطان الجلد قصيرة الأجل المشتقة من المريض (STCs)

  1. ضع الأنسجة في طبق بتري 60 مم مع 1 مل من RPMI الكامل (RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 2 mM L-glutamine ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، محلول أحماض أمينية غير أساسية 1x MEM ، والبنسلين (100 وحدة دولية / مل) / ستربتومايسين (100 ميكروغرا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح الأرقام التالية كيف تم تطبيق سير العمل الموصوف لتحديد الدوافع الجديدة لورم خبيث في سرطان الجلد. يلخص الشكل 2 نتائج دراسة منشورة تمت فيها دراسة آثار إسكات فوكوزيل ترانسفيراز FUT8 في ورم خبيث في الورم الميلانيني في الجسم الحي 26. باختصار ، كشف تحليل بيانات glycomic للمريض البشري (التي تم الحصول عليها بواسطة صفائف الليكتين) والتنميط النصفي عن زيادة مستويات ألفا 1,6-fucose المرتبطة بالتقدم من سرطان الجلد الأولي إلى النقيلي ، بما يتفق مع زيادة في fucosyltrans.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا التقرير الفني هو تقديم سير عمل موحد من أعلى إلى أسفل للتحقيق في الجهات الفاعلة المحتملة في ورم خبيث سرطان الجلد. كما هو الحال في التجارب الحية يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، فإن الاستراتيجيات الرامية إلى تحقيق أقصى قدر من الكفاءة وزيادة قيمة المعلومات التي يتم الحصول عليها لها أهمية قصوى.

ومن الضروري استخدام نهج تكميلية في جميع أنحاء للتحقق من صحة النتائج في إطار التجربة نفسها. على سبيل المثال ، كل من تلطيخ NuMA المناعي النسيجي الكيميائي و BLI هما طريقتان متكاملت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر قسم تقنيات البحوث المتقدمة (DART) في جامعة نيويورك لانغون هيلث ، وعلى وجه الخصوص ، مختبر أبحاث علم الأمراض التجريبي ، ومركز تكنولوجيا الجينوم ، ومختبر قياس الخلايا وفرز الخلايا ، ونواة التصوير قبل السريرية ، والتي يتم دعمها جزئيا من قبل منحة دعم مركز بيرلموتر للسرطان NIH / NCI 5P30CA016087. نشكر مجموعة جامعة نيويورك التعاونية متعددة التخصصات لسرطان الجلد (PI: الدكتورة إيمان عثمان) على توفير الوصول إلى ثقافات سرطان الجلد قصيرة الأجل المشتقة من المريض + (10-230BM و 12-273BM) ، والتي تم الحصول عليها من خلال بروتوكولات معتمدة من IRB (دراسة الموافقة الشاملة #s16-00122 ودراسة مجموعة سرطان الجلد التعاونية متعددة التخصصات # 10362). نشكر الدكتور روبرت كيربل (جا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#15 Scapel Blade WPI500242للإجراءات الجراحية
# 3 Scapel HandleWPI500236للإجراءات الجراحية
1 مل حقنة توبركولين ، طرف الانزلاق   ؛حقنBD 309626
10 مل حقنة ، طرف انزلاق   ؛BD301029التروية
10٪ الفورمالين الصوديوم المخزنةEK Industries4499-20Lللتروية / مثبت الأنسجة
15 مل Corning المخروطي  ؛430052زراعة الخلايا
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبيلينFalcon352196زراعة الخلايا
200 مختبرات الإيثانولDeacon04-355-223علم الأنسجة
22G & ndash ؛ إبرة 22 ممBD305156التروية
4-0 خياطة فيكريلخياطة EthiconJ464Gخياطة
4٪ فوسفات كارسون مخزن بارافورمالدهايد EMS15733-10للتروية / مثبت الأنسجة
40 وميكرو ؛ مCorning431750معالجة الأنسجة
5-0 خياطة قابلة للامتصاص Ethicon6542000إغلاق
50 مل مخروطي  كورنينج 430828زراعة الخلايا
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبيلينFalcon352070زراعة الخلايا
7-0 خياطة الحرير FST18020-70الرباط
70 ومايكرو ؛ مCorning431751معالجة الأنسجة
وسائط التركيب المضادة للتلاشي   ؛  Vector LabsH-1000-10
Immunofluorescence Approximator تطبيق الملقط ، 10 سم & nbsp ؛WPI14189لإجراءات الجراحة المجهرية
AvanceBruker3 HDNMR Console 
Biospec 7030   ;Bruker7030Micro MRI
BSABioregA941NuMA Staining
Castroviejo ملقط خياطة ، أطراف مستقيمة 5.5 مم منصة ربط ، 11 سم & nbsp ؛WPIWP5025501لإجراءات الجراحة المجهرية
Coplin Staining JarBel-Art F44208-1000علم الأنسجة
DAPISigma-AldrichD9542-1MGالتألق المناعي
dCas9-KRABAddgene110820التلاعب الجيني
DNase INEBM0303Lمعالجة الأنسجة
DPBSCorning21-030-CMمعالجة الأنسجة
شفرة أحادية الحافة غير مطلية حادةللغاية GEM62-0167معالجة الأنسجة
الركيزة المصفوفة خارج الخلية Corningالنظر في انخفاض عامل النمو (كبديل  
FBSCytivaSH30910.03زراعة الخلايا
فيجي صورة Jفيجي صورة Jبرنامجالتألق المناعي
الماعز المضادة للأرانب HRP مترافقة متعددة  Thermo FisherA16104NuMA تلطيخ
مصل الماعزGibcoPCN5000التألق المناعي
HBSSCorning21-020-CVمعالجة الأنسجة
Hematoxylin   ؛ريتشارد آلان العلمية 7231علم الأنسجة
Illumina III حقنة الأنسولين PerkinElmerCLS136334BLI Instrument
28G - 8 مم إبرةBD329424حقن
حقنة الأنسولين 31G - 6 مم إبرة   ؛BD326730حقن
ملقط القزحية ، 10.2 سم ، منحنى كامل ، مسننWPI504478للتروية والعمليات الجراحية
Isoflurane USPCovetrus11695067772Anesthesia
Jewelers # 7 ملقط تيتانيوم 11 سم 0.07 × 0.01 مم طرفWPIWP6570لإجراءات الجراحة المجهرية
الكيتامين هيدروكلوريك 100 مجم / ملمايلان إند.1049007التخدير
lentiCRISPRv2Addgene98290التلاعب الجيني
Lycopersicon Esculentum (الطماطم) Lectin ، DyLight 649InvitrogenL32472علامات الخلايا البطانية الوعائية
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية X 100Corning25-025-CIمقص
MetzenbaumWPI503269 للجراحة إجراءات
وحدة الحقن المجهريKOPF5000الحقن داخل القلب
NaClFisherS25877   ؛تلطيخ NuMA
إبرة 30 جرام × 25 ممBD305128إبرة حقن داخل القلب
33 جرام × 15 ممهاميلتون7747-01إبرة حقن داخل الشريان السباتي
، Castroviejo ، 14 سم ، مع قفل ، 1.2 مم فكين مسننةWPI14137-Gلإجراءات الجراحة المجهرية
NOD. Cg-Prkdcscid< / sup> Il2rgtm1Wjl< / sup> / SzJ الفئرانمختبر جاكسون005557نموذج الفئران
NU / Jمختبر جاكسون002019نموذج الفئران
جهاز الانقسامي النووي البروتين الأرنب متعدد النسيلة مضاد للإنسان  Abcam97585NuMA تلطيخ
البنسلين الستربتومايسين 10000U / ملجيبكو15140122زراعة الخلايا
PercollGE0891-01محلول فصل الكثافة  
PI قفازات جراحية كلاسيكيةالكاردينال هيلث2D72PT75Xجراحة
pLKO Tet-OnAddgene21915التلاعب الجيني
بوفيدون اليود 10٪ محلولجراحة MDS093943 Medline
قطرات بروباراكائين 0.5٪Akorn PharmaAX0501مخدر موضعي للبصريات
Puralube Petrolatum مرهم بصريDechra83592شفرة الحلاقة التخدير
شفرات مزدوجة الحواف EMS72000الحلاقة وتقطيع الدماغ الاهتزازي 
منعكس 9 مم مشبك EZ برينتريEZC-  مجموعةإغلاق الجرح
RPMI 1640   ؛ثقافة الخلاياCorning10-040 سم
، زنبرك 10.5 سم Str ، شفرات 8 ممWPI501235لإجراءات الجراحة المجهرية
شفرة تهتز شبه أوتوماتيكية MicrotomeLeicaVT1200شريحة الدماغ التألق المناعي
نظام مبخر التخدير أحادي القناةKent ScientificVetFlo-1210S & nbsp ؛تخدير
نظام غرفة منضدية Smartbox ومنفاخ العادمأنظمةEZ أنظمة TT4000CO2 القتل الرحيم
معقم القابل للتصرف الستارةMedlineNON21002الجراحة
العباءات الجراحية المعقمة غير المقواة مع أكمام ثابتةMedlineDYNJP2715Surgery
T25 قارورةCorning  ؛430639ثقافة الخلايا
تريسكورنينج46-031-CMNuMA تلطيخ
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500MLملقط ربط تراوتمان المناعي
، 10 سم ، نمط G المنحني ، طرف 0.52 مم مع منصة ربطWPIWP505210لإجراءات الجراحة المجهرية
مقاطع الأوعية الدموية 10 جرام ضغط 5x 0.8 مم الفكين ، 5 / عبوةWPI15911ل إجراءات الجراحة المجهرية
VisiopharmVisiopharmVisiopharmNuMA برنامج قياس الكمية
Xylasine 100mg / mLAkorn Pharma59399-111-50التخدير
XyleneFisherX3P-1GALHistology
354234 حامل مقص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Melanoma MetastasisIn Vivo ModelsIntracardiac InjectionIntradermal InjectionSubcutaneous InjectionBioluminescence ImagingTumor Cell SortingSingle Cell RNA SequencingImmunohistopathologyMetastasis Suppressor

Related Articles