توضح هذه المقالة سير عمل التقنيات المستخدمة لاختبار الوسطاء المرشحين الجدد لورم خبيث سرطان الجلد وآلية (آليات) عملهم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
منصة اكتشاف قوية لتحديد الوسطاء الجدد لورم خبيث سرطان الجلد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الانبثاث هو عملية معقدة ، تتطلب من الخلايا التغلب على الحواجز التي يتم نمذجتها بشكل غير كامل فقط من خلال الفحوصات في المختبر . تم إنشاء سير عمل منهجي باستخدام نماذج قوية وقابلة للتكرار في الجسم الحي وطرق موحدة لتحديد اللاعبين الجدد في ورم خبيث سرطان الجلد. يسمح هذا النهج باستنتاج البيانات في مراحل تجريبية محددة لتوصيف دور الجين بدقة في الانبثاث. يتم إنشاء النماذج عن طريق إدخال خلايا سرطان الجلد المعدلة وراثيا عن طريق الحقن داخل القلب أو داخل الأدمة أو تحت الجلد في الفئران ، تليها المراقبة بالتصوير التسلسلي في الجسم الحي . بمجرد الوصول إلى نقاط النهاية المحددة مسبقا ، يتم حصاد الأورام الأولية و / أو الأعضاء الحاملة للنقائل ومعالجتها لإجراء تحليلات مختلفة. يمكن فرز الخلايا السرطانية وإخضاعها لأي من منصات "omics" العديدة ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. تخضع الأعضاء للتصوير والتحليلات المرضية النسيجية المناعية لتحديد العبء الكلي للنقائل ورسم خريطة لموقعها التشريحي المحدد. يمكن اعتماد خط الأنابيب الأمثل هذا ، بما في ذلك البروتوكولات الموحدة للتطعيم والمراقبة وحصاد الأنسجة ومعالجتها وتحليلها ، للثقافات قصيرة الأجل المشتقة من المريض وخطوط الخلايا البشرية والفئرانية الراسخة لمختلف أنواع السرطان الصلبة.
المقدمة
إن ارتفاع معدل الوفيات المرتبط بسرطان الجلد النقيلي إلى جانب زيادة معدل الإصابة بسرطان الجلد في جميع أنحاء العالم1 (زيادة تقدر بنسبة 7.86٪ بحلول عام 2025) يستدعي اتباع نهج علاجية جديدة. يتوقف التقدم في اكتشاف الأهداف على نماذج قابلة للتكرار من ورم خبيث ، وهي عملية معقدة للغاية. خلال خطوات الشلال النقيلي ، يجب على خلايا سرطان الجلد التغلب على حواجز لا حصر لها لتحقيق التهرب من الجهاز المناعي واستعمار الأنسجة البعيدة2. تنشأ مرونة خلايا سرطان الجلد وقدرتها على التكيف من العديد من العوامل ، بما في ذلك عبئها الطفري الجيني العالي 3 وأصلها العصبي ، مما يمنح اللدونة الظاهرية الحاسمة3،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية المشاركة في البروتوكول التالي من قبل لجنة جامعة نيويورك المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC). يتم إجراء جميع الإجراءات في مرافق معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية المختبرات (AAALAC). ويبين الشكل 1 النهج التجريبي العام.
1. ثقافات سرطان الجلد قصيرة الأجل المشتقة من المريض (STCs)
- ضع الأنسجة في طبق بتري 60 مم مع 1 مل من RPMI الكامل (RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 2 mM L-glutamine ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، محلول أحماض أمينية غير أساسية 1x MEM ، والبنسلين (100 وحدة دولية / مل) / ستربتومايسين (100 ميكروغرا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توضح الأرقام التالية كيف تم تطبيق سير العمل الموصوف لتحديد الدوافع الجديدة لورم خبيث في سرطان الجلد. يلخص الشكل 2 نتائج دراسة منشورة تمت فيها دراسة آثار إسكات فوكوزيل ترانسفيراز FUT8 في ورم خبيث في الورم الميلانيني في الجسم الحي 26. باختصار ، كشف تحليل بيانات glycomic للمريض البشري (التي تم الحصول عليها بواسطة صفائف الليكتين) والتنميط النصفي عن زيادة مستويات ألفا 1,6-fucose المرتبطة بالتقدم من سرطان الجلد الأولي إلى النقيلي ، بما يتفق مع زيادة في fucosyltrans.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهدف من هذا التقرير الفني هو تقديم سير عمل موحد من أعلى إلى أسفل للتحقيق في الجهات الفاعلة المحتملة في ورم خبيث سرطان الجلد. كما هو الحال في التجارب الحية يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، فإن الاستراتيجيات الرامية إلى تحقيق أقصى قدر من الكفاءة وزيادة قيمة المعلومات التي يتم الحصول عليها لها أهمية قصوى.
ومن الضروري استخدام نهج تكميلية في جميع أنحاء للتحقق من صحة النتائج في إطار التجربة نفسها. على سبيل المثال ، كل من تلطيخ NuMA المناعي النسيجي الكيميائي و BLI هما طريقتان متكاملت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.
شكر وتقدير
نشكر قسم تقنيات البحوث المتقدمة (DART) في جامعة نيويورك لانغون هيلث ، وعلى وجه الخصوص ، مختبر أبحاث علم الأمراض التجريبي ، ومركز تكنولوجيا الجينوم ، ومختبر قياس الخلايا وفرز الخلايا ، ونواة التصوير قبل السريرية ، والتي يتم دعمها جزئيا من قبل منحة دعم مركز بيرلموتر للسرطان NIH / NCI 5P30CA016087. نشكر مجموعة جامعة نيويورك التعاونية متعددة التخصصات لسرطان الجلد (PI: الدكتورة إيمان عثمان) على توفير الوصول إلى ثقافات سرطان الجلد قصيرة الأجل المشتقة من المريض + (10-230BM و 12-273BM) ، والتي تم الحصول عليها من خلال بروتوكولات معتمدة من IRB (دراسة الموافقة الشاملة #s16-00122 ودراسة مجموعة سرطان الجلد التعاونية متعددة التخصصات # 10362). نشكر الدكتور روبرت كيربل (جا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | للإجراءات الجراحية |
| # 3 Scapel Handle | WPI | 500236 | للإجراءات الجراحية |
| 1 مل حقنة توبركولين ، طرف الانزلاق ؛ | حقن | BD 309626 | |
| 10 مل حقنة ، طرف انزلاق ؛ | BD | 301029 | التروية |
| 10٪ الفورمالين الصوديوم المخزنة | EK Industries | 4499-20L | للتروية / مثبت الأنسجة |
| 15 مل Corning المخروطي | ؛ | 430052 | زراعة الخلايا |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبيلين | Falcon | 352196 | زراعة الخلايا |
| 200 مختبرات الإيثانول | Deacon | 04-355-223 | علم الأنسجة |
| 22G & ndash ؛ إبرة 22 مم | BD | 305156 | التروية |
| 4-0 خياطة فيكريل | خياطة Ethicon | J464G | خياطة |
| 4٪ فوسفات كارسون مخزن بارافورمالدهايد | EMS | 15733-10 | للتروية / مثبت الأنسجة |
| 40 وميكرو ؛ م | Corning | 431750 | معالجة الأنسجة |
| 5-0 خياطة قابلة للامتصاص | Ethicon | 6542000 | إغلاق |
| 50 مل مخروطي | كورنينج | 430828 | زراعة الخلايا |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبيلين | Falcon | 352070 | زراعة الخلايا |
| 7-0 خياطة الحرير | FST | 18020-70 | الرباط |
| 70 ومايكرو ؛ م | Corning | 431751 | معالجة الأنسجة |
| وسائط التركيب المضادة للتلاشي ؛ | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Immunofluorescence Approximator تطبيق الملقط ، 10 سم & nbsp ؛ | WPI | 14189 | لإجراءات الجراحة المجهرية |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 ; | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo ملقط خياطة ، أطراف مستقيمة 5.5 مم منصة ربط ، 11 سم & nbsp ؛ | WPI | WP5025501 | لإجراءات الجراحة المجهرية |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | علم الأنسجة |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | التألق المناعي |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | التلاعب الجيني |
| DNase I | NEB | M0303L | معالجة الأنسجة |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | معالجة الأنسجة |
| شفرة أحادية الحافة غير مطلية حادة | للغاية GEM | 62-0167 | معالجة الأنسجة |
| الركيزة المصفوفة خارج الخلية | Corning | النظر في انخفاض عامل النمو (كبديل | |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | زراعة الخلايا |
| فيجي صورة J | فيجي صورة J | برنامج | التألق المناعي |
| الماعز المضادة للأرانب HRP مترافقة متعددة | Thermo Fisher | A16104 | NuMA تلطيخ |
| مصل الماعز | Gibco | PCN5000 | التألق المناعي |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | معالجة الأنسجة |
| Hematoxylin ؛ | ريتشارد آلان العلمية | 7231 | علم الأنسجة |
| Illumina III | حقنة الأنسولين PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| 28G - 8 مم إبرة | BD | 329424 | حقن |
| حقنة الأنسولين 31G - 6 مم إبرة ؛ | BD | 326730 | حقن |
| ملقط القزحية ، 10.2 سم ، منحنى كامل ، مسنن | WPI | 504478 | للتروية والعمليات الجراحية |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers # 7 ملقط تيتانيوم 11 سم 0.07 × 0.01 مم طرف | WPI | WP6570 | لإجراءات الجراحة المجهرية |
| الكيتامين هيدروكلوريك 100 مجم / مل | مايلان إند. | 1049007 | التخدير |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | التلاعب الجيني |
| Lycopersicon Esculentum (الطماطم) Lectin ، DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | علامات الخلايا البطانية الوعائية |
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية X 100 | Corning | 25-025-CI | مقص |
| Metzenbaum | WPI | 503269 للجراحة إجراءات | |
| وحدة الحقن المجهري | KOPF | 5000 | الحقن داخل القلب |
| NaCl | Fisher | S25877 ؛ | تلطيخ NuMA |
| إبرة 30 جرام × 25 مم | BD | 305128 | إبرة حقن داخل القلب |
| 33 جرام × 15 مم | هاميلتون | 7747-01 | إبرة حقن داخل الشريان السباتي |
| ، Castroviejo ، 14 سم ، مع قفل ، 1.2 مم فكين مسننة | WPI | 14137-G | لإجراءات الجراحة المجهرية |
| NOD. Cg-Prkdcscid< / sup> Il2rgtm1Wjl< / sup> / SzJ الفئران | مختبر جاكسون | 005557 | نموذج الفئران |
| NU / J | مختبر جاكسون | 002019 | نموذج الفئران |
| جهاز الانقسامي النووي البروتين الأرنب متعدد النسيلة مضاد للإنسان | Abcam | 97585 | NuMA تلطيخ |
| البنسلين الستربتومايسين 10000U / مل | جيبكو | 15140122 | زراعة الخلايا |
| Percoll | GE | 0891-01 | محلول فصل الكثافة |
| PI قفازات جراحية كلاسيكية | الكاردينال هيلث | 2D72PT75X | جراحة |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | التلاعب الجيني |
| بوفيدون اليود 10٪ محلول | جراحة MDS093943 Medline | ||
| قطرات بروباراكائين 0.5٪ | Akorn Pharma | AX0501 | مخدر موضعي للبصريات |
| Puralube Petrolatum مرهم بصري | Dechra | 83592 | شفرة الحلاقة التخدير |
| شفرات مزدوجة الحواف | EMS | 72000 | الحلاقة وتقطيع الدماغ الاهتزازي |
| منعكس 9 مم مشبك EZ | برينتري | EZC- مجموعة | إغلاق الجرح |
| RPMI 1640 ؛ | ثقافة الخلايا | Corning | 10-040 سم |
| ، زنبرك 10.5 سم Str ، شفرات 8 مم | WPI | 501235 | لإجراءات الجراحة المجهرية |
| شفرة تهتز شبه أوتوماتيكية Microtome | Leica | VT1200 | شريحة الدماغ التألق المناعي |
| نظام مبخر التخدير أحادي القناة | Kent Scientific | VetFlo-1210S & nbsp ؛ | تخدير |
| نظام غرفة منضدية Smartbox ومنفاخ العادم | أنظمة | EZ أنظمة TT4000 | CO2 القتل الرحيم |
| معقم القابل للتصرف الستارة | Medline | NON21002 | الجراحة |
| العباءات الجراحية المعقمة غير المقواة مع أكمام ثابتة | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 قارورة | Corning ؛ | 430639 | ثقافة الخلايا |
| تريس | كورنينج | 46-031-CM | NuMA تلطيخ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | ملقط ربط تراوتمان المناعي |
| ، 10 سم ، نمط G المنحني ، طرف 0.52 مم مع منصة ربط | WPI | WP505210 | لإجراءات الجراحة المجهرية |
| مقاطع الأوعية الدموية 10 جرام ضغط 5x 0.8 مم الفكين ، 5 / عبوة | WPI | 15911 | ل إجراءات الجراحة المجهرية |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA برنامج قياس الكمية |
| Xylasine 100mg / mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | التخدير |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
المراجع
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
