يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في ذبابة الفاكهة المستزرعة في الدماغ

3.2K مشاهدة

DOI:

10.3791/63189

مايو 18, 2022

في هذه المقالة

ملخص

تم إنشاء طريقة لإعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الهادئة في خلايا دماغ ذبابة الفاكهة المستزرعة . باستخدام هذه الطريقة ، يمكن فصل دور الإشارات الجهازية عن الإشارات الجوهرية للأنسجة في تنظيم هدوء الخلايا الجذعية العصبية ودخولها وخروجها.

الملخص

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) لديها القدرة على التكاثر والتمايز والخضوع لموت الخلايا المبرمج وحتى الدخول والخروج من السكون. يتم التحكم في العديد من هذه العمليات من خلال التفاعل المعقد بين البرامج الجينية الجوهرية NSC مع العوامل الخارجية NSC ، المحلية والنظامية. في الكائن الحي الوراثي النموذجي ، ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، NSCs ، والمعروفة باسم الأرومات العصبية (NBs) ، تتحول من السكون إلى الانتشار أثناء الانتقال الجنيني إلى اليرقات. خلال هذا الوقت ، تخرج اليرقات من قشر البيض وتبدأ في الزحف ، بحثا عن العناصر الغذائية الغذائية. استجابة لتغذية الحيوانات ، ينتج الجسم الدهني ، وهو عضو غدد صماء يتمتع بسعة تخزين الدهون ، إشارة يتم إطلاقها بشكل منهجي في الهيموليمف المتداول. استجابة للإشارة المشتقة من الجسم الدهني (FBDS) ، يتم إنتاج الببتيدات الشبيهة بالأنسولين (Dilps) وإطلاقها من الخلايا العصبية الإفرازية العصبية في الدماغ والدبقية ، مما يؤدي إلى تنشيط المصب لإشارات نمو PI3-kinase في NBs ومكانتها الدبقية والقصبة الهوائية. وعلى الرغم من أن هذا هو النموذج الحالي لكيفية تحول الاستراتيجيات وخطط العمل الوطنية من السكون إلى الانتشار، فإن طبيعة الإشارة الخارجية ل FBDS لا تزال بعيدة المنال. لفهم أفضل لكيفية تنظيم الإشارات الجهازية الخارجية NB للخروج من السكون ، تم تطوير طريقة لزراعة أدمغة اليرقات المبكرة في المختبر قبل إطعام الحيوانات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن توفير العوامل الخارجية لوسائل الإعلام الثقافية وخروج NB من فحص السكون. وجدنا أن الأنسولين الخارجي المنشأ يكفي لإعادة تنشيط NBs من السكون في الدماغ كله explants. نظرا لأن هذه الطريقة مناسبة تماما للشاشات واسعة النطاق ، فإننا نهدف إلى تحديد إشارات خارجية إضافية تنظم هدوء NB مقابل قرارات الانتشار. نظرا لأن الجينات والمسارات التي تنظم قرارات انتشار NSC محفوظة تطوريا ، فإن نتائج هذا الفحص يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحسين العلاجات التجديدية في العيادة.

المقدمة

الخلايا الجذعية ذات أهمية كبيرة بسبب إمكانية استخدامها في الطب التجديدي 1,2. تحتفظ العديد من الحيوانات ، وخاصة تلك التي تعيش طويلا ، بالخلايا الجذعية داخل أنسجتها البالغة. تعمل هذه الخلايا الجذعية المقيمة للحفاظ على توازن الأنسجة وتستخدم للإصلاح بعد الإصابة الجسدية أو المرض 3,4. معظم الخلايا الجذعية في الحيوانات البالغة هادئة ، وهي حالة نائمة نسبيا تتميز باحتجاز دورة الخلية وتعطيل إشارات النمو5. استجابة للإشارات الخارجية ، تخرج الخلايا الجذعية من السكون ، وتدخل دورة الخلية وتبدأ في توليد ذرية ابنة خاصة بنوع أنسجتها. على سبيل الم....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جمع يرقات ذبابة الفاكهة

ملاحظة: قم بإعداد طبق الخميرة ومعجون العنب وشقة Fly قبل البدء:

  1. معجون الخميرة: في وعاء صغير ، امزج 5 غرام من الخميرة الجافة النشطة مع 10 مل من الماء لتشكيل عجينة تحتوي على اتساق زبدة الفول السوداني. قم بتغطية معجون الخميرة بغلاف بلاستيكي واستخدم شريطا مطاطيا لإرفاقه بإحكام بالحاوية.
    ملاحظة: سوف يتوسع معجون الخميرة الطازجة في حاويته وسوف ينبثق من الغطاء ما لم يتم تثبيته بإحكام. سوف يستمر معجون الخميرة لعدة أيام في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. أطباق العنب: اتبع وصفة صنع أطباق العنب (الجدول 1). في حالة استخدام ألواح مخزنة عند 4 درجات مئوية، تأكد من تسخين الأ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تشريح أدمغة أوريغون آر الطازجة من النوع البري وزراعتها لمدة 24 ساعة في وسائط شنايدر المكملة (SSM) بالأنسولين. تم إصلاح الأنسجة وتلطيخها وفقا للبروتوكول. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تم إنشاؤها ضد Deadpan (Dpn) للكشف عن NBs و Scribble لتسمية أغشية الخلايا. تمت إضافة التناظرية ثيميدين 5-إيثينيل-2′-ديوكسي يوريدين (Edu) للكشف عن دخول المرحلة S وإعادة تنشيط NB. وجدنا Edu إيجابي كبير الحجم و Dpn إيجابي NBs بعد 24 ساعة في الثقافة (الشكل 6A-C). بعد ذلك.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن تنفيذ الطريقة الموصوفة هنا لزراعة الدماغ في معظم بيئات المختبرات. الأدوات المطلوبة ، وكذلك الإجراءات وجمع البيانات ، بسيطة ومباشرة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء اختبار مجموعة متنوعة من الفرضيات ، بما في ذلك تلك المتعلقة بشلالات إشارات الخلايا والعوامل الخارجية التي تنظم إعادة تنشيط NB وانتشاره. هنا ، باستخدام أوريغون آر البرية ، وجدنا أن الأنسولين الخارجي كان كافيا لإعادة تنشيط NBs من السكون بشكل مستقل عن الإشارات الجهازية الأخرى الخاصة بالحيوانات. باستخدام نظام GAL4 / UAS ، يمكن للمرء أيضا هدم مكونات مسار الأن.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نحن نعترف ببرنامج LSAMP Bridges to Doctorate للتمويل (CNK) وكذلك NIH / NIGMS (R01-GM120421 و R35-GM141886). ونحن ممتنون للدكتور كونور سيب على الشكل 1. كما نشكر جميع أعضاء مختبر Siegrist على دعمهم المستمر وإرشادهم. ونشكر بشكل خاص تشافي سود وغاري تيترز على قراءتهما المتأنية للمخطوطة وعلى تقديمهما تعليقاتهما.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 وميكرو ؛ L نصائح الماصةDenville SciP2102
1000 & micro ؛ L نصائح الماصةDenville SciP2103-N
1000 & micro ؛ L PipettorGilsonP1000
16٪ بارافورمالدهيد (10 × 10 مل) علومالمجهر الإلكتروني2912.60.0000تستخدم لتثبيت أدمغة اليرقات
20 & L ماصةجيلسونP20
200 & micro; L نصائح الماصةDenville Sci1158U56
24 بئر لوحات ثقافة متعددة الآبارفيشر Scientific50-197-4477
35 مم أطباق بتريفيشر Scientific08-757-100Aمكونات طبق العنب
4 درجة ؛ ثلاجة CFisher Scientificتوفر درجة حرارة مثالية لمدة >24 ساعة من الحضانات في محلول الأجسام المضادة
63x ObjectiveLecia
الخميرة الجافة النشطةمعظم محلات السوبر ماركت
AgaroseFisher Scientific214010مكونات طبق العنب
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit للتصوير ، Alexa Fluor 647 صبغةThermo Fisher ScientificC10340لتسمية الخلايا المتكاثرة
المجهر متحد البؤرLeicaSP8
Coverslips 22 مم × 22 مم × 1 مم ، 10 عبوات من 4 أوقيةFisher Scientific12-544-10يتم لصق اثنين من الغطاء بشكل كبير على نهايات شريحة المجهر. هذا يخلق مساحة تسمح للأدمغة بالطفو في مضاد للتلاشي أثناء التصوير.
أغطية ، 22 مم × 50 مم × 1 ممFisher Scientific12-545Eيتم وضع الغطاء على غطاءين مربعين على شريحة المجهر لضمان عدم تحرك الدماغ في مضاد التلاشي أثناء التصوير.
تشريح المجهرZeissStemi 2000
الإيثانول 200 دليل (100٪) ، مختبرات Decon ، زجاجة 1 جالونFisher Scientific2701تستخدم لغسل اليرقات قبل 24 ساعة في وسط زراعة
مصل الأبقار الجنيني (10٪) مكملSigmaF4135-100MLلوسائط زراعة الخلايا.
ملقط دقيق للتشريحأدوات العلوم الدقيقة11295-20Forcepts المستخدمة في التشريح. تعمل بشكل أفضل عند شحذها.
زجاجات الذبابة لعبورGenessee Scientific32-130هذه الزجاجة كحاوية تسمح للذباب بوضع البيض على طبق العنب.
طبق تشريح الزجاج (3 آبار)لم تعد متوفرة
الجلوتاثيونسيجماG6013يوفر الحماية التأكسدية أثناء زراعة الخلايا.
مصل الماعزSigmaG9023- 10MLعامل حجب
أطباق العنبالمصنوعة في المنزلصنع في المنزلعصير العنب / أطباق الاغاروز لجمع البيض الطازج
Image JImagej.net/fiji/downloadsتحميل مجاني:  https://fiji.scمنصة التصوير التي تستخدم لعد الخلايا وحاضنة إعادة تنشيط
Edu Thermo Fisher Scientificيضمن أن درجة الحرارة والرطوبة والتعرض للضوء متماثلين تماما طوال التجربة.
الأنسولينSigmaI0516المتغير المستقل للتجربة
التدفقلوسائط الثقافة
L-GlutamineSigmaG7513يوفر الدعم أثناء زراعة الخلايا
Nunc 72-well Microwell Mini RysFisher Scientific12-565-154تنفيذ خطوات التلوين المناعي في هذا الدرج
Parafilmيستخدم فيلم Fisher ScientificS37440لإغلاق الألواح من أجل منع التبخر
Pen-StrepSigmaP4458-100mlالمضادات الحيوية المستخدمة لمنع التلوث البكتيري للخلايا أثناء الزراعة.
عازلة الفوسفات ، الرقم الهيدروجيني 7.4صنع في المنزلمذيب يستخدم لغسل الأدمغة بعد خطوات التثبيت والتلوين
اخترأدوات العلوم الدقيقة10140-01تستخدم لقطف اليرقات من صفيحة العنب
حمض البروبيونيكفيشر ScientificA-258مكونات صفيحة
العنب الأرنب 405Abcamab175653الأجسام المضادة المستخدمة في التلوين
Rat 555Abcamab150166الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ المناعة
Rb Scribbleهدية من Chris Doeالأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ المناعة
Rt DeadpanAbcamab195173الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ مناعة
شنايدر ثقافة 21720024 MediumLife Techيحتوي على العناصر الغذائية التي تساعد الخلايا على النمو والتكاثر
SlowFade Diamond مضاد للتلاشي (5 × 2 مل)Life TechS36963يوفر الحماية ضد تلاشي الفلوروفورات
الأوتوكلاف بالماء المعقمMilli-Q الماء المصنوع في المنزلمطلوب للحلول
السكروزفيشرS2-12مكونات صفيحة العنب شرائح
مجهر Superfrostفيشر Scientific12-544-7
Superglueمعظم محلات السوبر ماركت
TegoseptGenesee Scientific20-259مكونات طبق العنب
Triton-X 100SigmaT9284-100MLPBT
Welch عصير العنب 100٪معظم محلات السوبر ماركتمكونات طبق العنب
تستخدم غطاء الصفحي يتم المناعيكاشف

المراجع

  1. Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
  2. Tabar, V., Studer, L. Plur....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

EDU