تم إنشاء طريقة لإعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الهادئة في خلايا دماغ ذبابة الفاكهة المستزرعة . باستخدام هذه الطريقة ، يمكن فصل دور الإشارات الجهازية عن الإشارات الجوهرية للأنسجة في تنظيم هدوء الخلايا الجذعية العصبية ودخولها وخروجها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعادة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية في ذبابة الفاكهة المستزرعة في الدماغ
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) لديها القدرة على التكاثر والتمايز والخضوع لموت الخلايا المبرمج وحتى الدخول والخروج من السكون. يتم التحكم في العديد من هذه العمليات من خلال التفاعل المعقد بين البرامج الجينية الجوهرية NSC مع العوامل الخارجية NSC ، المحلية والنظامية. في الكائن الحي الوراثي النموذجي ، ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، NSCs ، والمعروفة باسم الأرومات العصبية (NBs) ، تتحول من السكون إلى الانتشار أثناء الانتقال الجنيني إلى اليرقات. خلال هذا الوقت ، تخرج اليرقات من قشر البيض وتبدأ في الزحف ، بحثا عن العناصر الغذائية الغذائية. استجابة لتغذية الحيوانات ، ينتج الجسم الدهني ، وهو عضو غدد صماء يتمتع بسعة تخزين الدهون ، إشارة يتم إطلاقها بشكل منهجي في الهيموليمف المتداول. استجابة للإشارة المشتقة من الجسم الدهني (FBDS) ، يتم إنتاج الببتيدات الشبيهة بالأنسولين (Dilps) وإطلاقها من الخلايا العصبية الإفرازية العصبية في الدماغ والدبقية ، مما يؤدي إلى تنشيط المصب لإشارات نمو PI3-kinase في NBs ومكانتها الدبقية والقصبة الهوائية. وعلى الرغم من أن هذا هو النموذج الحالي لكيفية تحول الاستراتيجيات وخطط العمل الوطنية من السكون إلى الانتشار، فإن طبيعة الإشارة الخارجية ل FBDS لا تزال بعيدة المنال. لفهم أفضل لكيفية تنظيم الإشارات الجهازية الخارجية NB للخروج من السكون ، تم تطوير طريقة لزراعة أدمغة اليرقات المبكرة في المختبر قبل إطعام الحيوانات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن توفير العوامل الخارجية لوسائل الإعلام الثقافية وخروج NB من فحص السكون. وجدنا أن الأنسولين الخارجي المنشأ يكفي لإعادة تنشيط NBs من السكون في الدماغ كله explants. نظرا لأن هذه الطريقة مناسبة تماما للشاشات واسعة النطاق ، فإننا نهدف إلى تحديد إشارات خارجية إضافية تنظم هدوء NB مقابل قرارات الانتشار. نظرا لأن الجينات والمسارات التي تنظم قرارات انتشار NSC محفوظة تطوريا ، فإن نتائج هذا الفحص يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحسين العلاجات التجديدية في العيادة.
المقدمة
الخلايا الجذعية ذات أهمية كبيرة بسبب إمكانية استخدامها في الطب التجديدي 1,2. تحتفظ العديد من الحيوانات ، وخاصة تلك التي تعيش طويلا ، بالخلايا الجذعية داخل أنسجتها البالغة. تعمل هذه الخلايا الجذعية المقيمة للحفاظ على توازن الأنسجة وتستخدم للإصلاح بعد الإصابة الجسدية أو المرض 3,4. معظم الخلايا الجذعية في الحيوانات البالغة هادئة ، وهي حالة نائمة نسبيا تتميز باحتجاز دورة الخلية وتعطيل إشارات النمو5. استجابة للإشارات الخارجية ، تخرج الخلايا الجذعية من السكون ، وتدخل دورة الخلية وتبدأ في توليد ذرية ابنة خاصة بنوع أنسجتها. على سبيل الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. جمع يرقات ذبابة الفاكهة
ملاحظة: قم بإعداد طبق الخميرة ومعجون العنب وشقة Fly قبل البدء:
- معجون الخميرة: في وعاء صغير ، امزج 5 غرام من الخميرة الجافة النشطة مع 10 مل من الماء لتشكيل عجينة تحتوي على اتساق زبدة الفول السوداني. قم بتغطية معجون الخميرة بغلاف بلاستيكي واستخدم شريطا مطاطيا لإرفاقه بإحكام بالحاوية.
ملاحظة: سوف يتوسع معجون الخميرة الطازجة في حاويته وسوف ينبثق من الغطاء ما لم يتم تثبيته بإحكام. سوف يستمر معجون الخميرة لعدة أيام في درجة حرارة الغرفة (RT). - أطباق العنب: اتبع وصفة صنع أطباق العنب (الجدول 1). في حالة استخدام ألواح مخزنة عند 4 درجات مئوية، تأكد من تسخين الأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تشريح أدمغة أوريغون آر الطازجة من النوع البري وزراعتها لمدة 24 ساعة في وسائط شنايدر المكملة (SSM) بالأنسولين. تم إصلاح الأنسجة وتلطيخها وفقا للبروتوكول. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تم إنشاؤها ضد Deadpan (Dpn) للكشف عن NBs و Scribble لتسمية أغشية الخلايا. تمت إضافة التناظرية ثيميدين 5-إيثينيل-2′-ديوكسي يوريدين (Edu) للكشف عن دخول المرحلة S وإعادة تنشيط NB. وجدنا Edu إيجابي كبير الحجم و Dpn إيجابي NBs بعد 24 ساعة في الثقافة (الشكل 6A-C). بعد ذلك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن تنفيذ الطريقة الموصوفة هنا لزراعة الدماغ في معظم بيئات المختبرات. الأدوات المطلوبة ، وكذلك الإجراءات وجمع البيانات ، بسيطة ومباشرة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء اختبار مجموعة متنوعة من الفرضيات ، بما في ذلك تلك المتعلقة بشلالات إشارات الخلايا والعوامل الخارجية التي تنظم إعادة تنشيط NB وانتشاره. هنا ، باستخدام أوريغون آر البرية ، وجدنا أن الأنسولين الخارجي كان كافيا لإعادة تنشيط NBs من السكون بشكل مستقل عن الإشارات الجهازية الأخرى الخاصة بالحيوانات. باستخدام نظام GAL4 / UAS ، يمكن للمرء أيضا هدم مكونات مسار الأن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
نحن نعترف ببرنامج LSAMP Bridges to Doctorate للتمويل (CNK) وكذلك NIH / NIGMS (R01-GM120421 و R35-GM141886). ونحن ممتنون للدكتور كونور سيب على الشكل 1. كما نشكر جميع أعضاء مختبر Siegrist على دعمهم المستمر وإرشادهم. ونشكر بشكل خاص تشافي سود وغاري تيترز على قراءتهما المتأنية للمخطوطة وعلى تقديمهما تعليقاتهما.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 وميكرو ؛ L نصائح الماصة | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 & micro ؛ L نصائح الماصة | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 & micro ؛ L Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16٪ بارافورمالدهيد (10 × 10 مل) علوم | المجهر الإلكتروني | 2912.60.0000 | تستخدم لتثبيت أدمغة اليرقات |
| 20 & L ماصة | جيلسون | P20 | |
| 200 & micro; L نصائح الماصة | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24 بئر لوحات ثقافة متعددة الآبار | فيشر Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 مم أطباق بتري | فيشر Scientific | 08-757-100A | مكونات طبق العنب |
| 4 درجة ؛ ثلاجة C | Fisher Scientific | توفر درجة حرارة مثالية لمدة >24 ساعة من الحضانات في محلول الأجسام المضادة | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| الخميرة الجافة النشطة | معظم محلات السوبر ماركت | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | مكونات طبق العنب |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit للتصوير ، Alexa Fluor 647 صبغة | Thermo Fisher Scientific | C10340 | لتسمية الخلايا المتكاثرة |
| المجهر متحد البؤر | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 مم × 22 مم × 1 مم ، 10 عبوات من 4 أوقية | Fisher Scientific | 12-544-10 | يتم لصق اثنين من الغطاء بشكل كبير على نهايات شريحة المجهر. هذا يخلق مساحة تسمح للأدمغة بالطفو في مضاد للتلاشي أثناء التصوير. |
| أغطية ، 22 مم × 50 مم × 1 مم | Fisher Scientific | 12-545E | يتم وضع الغطاء على غطاءين مربعين على شريحة المجهر لضمان عدم تحرك الدماغ في مضاد التلاشي أثناء التصوير. |
| تشريح المجهر | Zeiss | Stemi 2000 | |
| الإيثانول 200 دليل (100٪) ، مختبرات Decon ، زجاجة 1 جالون | Fisher Scientific | 2701 | تستخدم لغسل اليرقات قبل 24 ساعة في وسط زراعة |
| مصل الأبقار الجنيني (10٪) مكمل | Sigma | F4135-100ML | لوسائط زراعة الخلايا. |
| ملقط دقيق للتشريح | أدوات العلوم الدقيقة | 11295-20 | Forcepts المستخدمة في التشريح. تعمل بشكل أفضل عند شحذها. |
| زجاجات الذبابة لعبور | Genessee Scientific | 32-130 | هذه الزجاجة كحاوية تسمح للذباب بوضع البيض على طبق العنب. |
| طبق تشريح الزجاج (3 آبار) | لم تعد متوفرة | ||
| الجلوتاثيون | سيجما | G6013 | يوفر الحماية التأكسدية أثناء زراعة الخلايا. |
| مصل الماعز | Sigma | G9023- 10ML | عامل حجب |
| أطباق العنب | المصنوعة في المنزل | صنع في المنزل | عصير العنب / أطباق الاغاروز لجمع البيض الطازج |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | تحميل مجاني: https://fiji.sc | منصة التصوير التي تستخدم لعد الخلايا وحاضنة إعادة تنشيط |
| Edu Thermo Fisher Scientific | يضمن أن درجة الحرارة والرطوبة والتعرض للضوء متماثلين تماما طوال التجربة. | ||
| الأنسولين | Sigma | I0516 | المتغير المستقل للتجربة |
| التدفق | لوسائط الثقافة | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | يوفر الدعم أثناء زراعة الخلايا |
| Nunc 72-well Microwell Mini Rys | Fisher Scientific | 12-565-154 | تنفيذ خطوات التلوين المناعي في هذا الدرج |
| Parafilm | يستخدم فيلم Fisher Scientific | S37440 | لإغلاق الألواح من أجل منع التبخر |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | المضادات الحيوية المستخدمة لمنع التلوث البكتيري للخلايا أثناء الزراعة. |
| عازلة الفوسفات ، الرقم الهيدروجيني 7.4 | صنع في المنزل | مذيب يستخدم لغسل الأدمغة بعد خطوات التثبيت والتلوين | |
| اختر | أدوات العلوم الدقيقة | 10140-01 | تستخدم لقطف اليرقات من صفيحة العنب |
| حمض البروبيونيك | فيشر Scientific | A-258 | مكونات صفيحة |
| العنب الأرنب 405 | Abcam | ab175653 | الأجسام المضادة المستخدمة في التلوين |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ المناعة |
| Rb Scribble | هدية من Chris Doe | الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ المناعة | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ مناعة |
| شنايدر ثقافة 21720024 Medium | Life Tech | يحتوي على العناصر الغذائية التي تساعد الخلايا على النمو والتكاثر | |
| SlowFade Diamond مضاد للتلاشي (5 × 2 مل) | Life Tech | S36963 | يوفر الحماية ضد تلاشي الفلوروفورات |
| الأوتوكلاف بالماء المعقم | Milli-Q الماء المصنوع في المنزل | مطلوب للحلول | |
| السكروز | فيشر | S2-12 | مكونات صفيحة العنب شرائح |
| مجهر Superfrost | فيشر Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | معظم محلات السوبر ماركت | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | مكونات طبق العنب |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch عصير العنب 100٪ | معظم محلات السوبر ماركت | مكونات طبق العنب |
المراجع
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Plur....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
