في المختبر توصيف مرافقي هيستون باستخدام المقايسات التحليلية والمنسدلة والمرافقة

تشكل النيوكليوسومات المكونة من الحمض النووي وبروتينات هيستون الوحدة الهيكلية للكروماتين وتنظم العديد من الأحداث الخلوية الحرجة. يتم تغيير موضع النيوكليوسومات ديناميكيا وإعادة تشكيلها لجعل الحمض النووي في متناول العمليات المختلفة مثل النسخ المتماثل والنسخ والترجمة ^1,2. الهستونات الأساسية للغاية إما تميل إلى التفاعل مع البروتينات الحمضية في الوسط الخلوي أو تخضع للتجميع ، مما يؤدي إلى عيوب خلوية مختلفة³،^4،5. تساعد مجموعة من البروتينات المخصصة تسمى مرافقو هيستون في نقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة ومنع أحداث تجميع الحمض النووي الهستون الشاذة ^6,7. بشكل أساسي ، تقوم معظم مرافقات الهستون بتخزين ونقل الهستونات إلى الحمض النووي بالقوة الأيونية الفسيولوجية ، مما يساعد على تكوين النيوكليوسومات ^8,9. بعض مرافقي هيستون لديهم تفضيل واضح لأوليغومرات هيستون H2A / H2B أو H3 / H4¹⁰.

تتميز مرافقات هيستون بناء على قدرتها على تجميع النيوكليوسومات المعتمدة أو المستقلة عن تخليق الحمض النووي¹¹. على سبيل المثال ، يعتمد عامل تجميع الكروماتين -1 (CAF-1) بينما منظم هيستون A (HIRA) مستقل عن تخليق الحمض النووي^12,13. وبالمثل ، تشارك عائلة النيوكليوبلازمين من مرافقي هيستون في تكثيف كروماتين الحيوانات المنوية وتجميع النيوكليوسوم¹⁴. يسهل أفراد عائلة بروتين تجميع النيوكليوسوم (NAP) تكوين هياكل تشبه النيوكليوسوم في المختبر ويشاركون في نقل الهستونات بين السيتوبلازم والنواة¹⁵. تعتبر كل من بروتينات عائلة النيوكليوبلازمين وبروتينات عائلة NAP مرافقين هيستون وظيفيين ولكنهما لا يشتركان في أي ميزات هيكلية. بشكل أساسي ، لا توجد ميزة هيكلية واحدة تسمح بتصنيف البروتين على أنه مرافقة هيستون¹⁶. يعمل استخدام المقايسات الوظيفية والفيزيائية الحيوية جنبا إلى جنب مع الدراسات الهيكلية بشكل أفضل في توصيف مرافقي الهستون.

يصف هذا العمل الطرق البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لتوصيف البروتين على أنه مرافقة هيستون تساعد على تجميع النيوكليوسوم. أولا ، تم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتحليل حالة قلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار منسدل لتحديد القوى الدافعة والطبيعة التنافسية لتفاعلات هيستون المرافقة والهيستون. ومع ذلك ، لا يمكن حساب المعلمات الهيدروديناميكية لهذه التفاعلات بدقة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية بسبب شكل البروتين ومعقداته التي تؤثر على هجرتها عبر العمود. لذلك ، تم استخدام الطرد المركزي التحليلي الفائق ، والذي يوفر خصائص جزيئية كبيرة في المحلول تشمل الوزن الجزيئي الدقيق ، والقياس المتكافئ للتفاعل ، وشكل الجزيئات البيولوجية. استخدمت الدراسات السابقة على نطاق واسع مقايسة مرافقة هيستون في المختبر لتوصيف مرافقي هيستون وظيفيا مثل yScS116 17 و DmACF¹⁸ و ScRTT106p¹⁹ و HsNPM1²⁰. كما تم استخدام مقايسة مرافقة هيستون لتوصيف البروتينات وظيفيا على أنها مرافقة هيستون.

1. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتوضيح الحالة قليلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون

1. تحليل الحالة قليلة القسيمات لمرافقي هيستون
   1. موازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (SEC) سعة 24 مل مع حجم عمود 1.2 (CV)، أي 28.8 مل من المخزن المؤقت SEC المنزوع الغازات [20 mM من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5)، و300 من mM كلوريد الصوديوم، و1 mM من β-mercaptoethanol (β-ME)] عند 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن تحديد نوع العمود وتكوين المخزن المؤقت ودرجة الحموضة العازلة بناء على البروتين محل الاهتمام. يجب ألا يتجاوز حجم حقن العينة 500 ميكرولتر لعمود 24 مل. أيضا ، يجب الحفاظ على ضغط العمود أقل من 5 ميجا باسكال.
   2. من محلول مخزون بروتين عالي التركيز ، قم بإعداد 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل في محلول SEC منزوع التفريغ وحقنه في العمود المتوازن مسبقا باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
   3. راقب ملف شطف البروتين عن طريق قياس الامتصاص بطول موجي يبلغ 280 نانومتر. عند التعامل مع البروتينات التي تفتقر إلى المخلفات العطرية ، قم بقياس الامتصاص عند 214 نانومتر.
   4. استخدم حجم شطف البروتين لحساب وزنه الجزيئي التقريبي بالكيلو دالتون باستخدام منحنى المعايرة القياسي²¹.
      ملاحظة: يتم تحضير منحنى المعايرة عن طريق رسم حجم الاحتفاظ ببروتينات الوزن الجزيئي المعروفة مقابل سجل الأوزان الجزيئية الخاصة بها (log Mr) ، والتي يتم استخلاصها باستخدام نفس العمود.
2. تحليل الاستقرار الحراري لمرافقي هيستون
   1. خذ 500 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل من عينة البروتين المحضرة في محلول SEC منزوع التفريغ (نفس المستخدم في 1.1.1) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية وقم بتسخين كل أنبوب إلى درجة حرارة معينة تتراوح بين 20 درجة مئوية و 90 درجة مئوية (20 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 90 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق في حمام مائي.
   2. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات المعالجة حراريا عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وجمع المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة ، وحقن كل عينة على حدة باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي ، متوازنة مسبقا مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
   3. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
   4. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.
3. تحليل الاستقرار الكيميائي لمرافقي هيستون
   1. لفحص استقرار الملح لمرافقي الهستون ، احتضان 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل محضرة في محلول تريس [20 مللي مول من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 1 مللي مول من β-ME] مكملة بتركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم (300 مللي متر ، 600 مللي متر ، 1 م ، 1.5 م ، و 2 م) في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي للعينات عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية والاحتفاظ بالطارد.
   2. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات البروتين بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم بشكل فردي ، باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي المتوازن مسبقا ب 1.2 CV (28.8 مل) من المخزن المؤقت المعني الذي يحتوي على تركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
   3. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي من 0.2-0.3 مل / دقيقة مع 1 CV (24 مل) من المخزن المؤقت المعني عند 4 درجات مئوية.
   4. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.
   5. وبالمثل ، لتحليل استقرار اليوريا ، احتضان 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل محضرة في محلول تريس [20 مللي مول من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 1 مللي مول من β-ME] تستكمل بتركيزات اليوريا المتزايدة (1 م ، 2 م ، 3 م ، 4 م ، و 5 م) في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بالطرد المركزي للعينات عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واحتفظ بالطارد.
   6. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات البروتين المعالجة باليوريا بشكل فردي باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي المتوازن مسبقا ب 1.2 CV (28.8 مل) من المخزن المؤقت المقابل الذي يحتوي على تركيزات مختلفة من اليوريا في درجة حرارة الغرفة.
   7. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع 1 CV (24 مل) من المخزن المؤقت المعني في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: لا تقم بإجراء التجارب باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على اليوريا عند درجة حرارة منخفضة لأن اليوريا تميل إلى التبلور وإتلاف العمود.
   8. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.

2. مقايسات منسدلة قائمة على تدرج الملح لفهم نوع التفاعلات التي تساهم في التكوين المعقد بين أوليغومرات هيستون ومرافقة هيستون

1. لكل تفاعل من مقايسة السحب لأسفل ، ماصة 40 ميكرولتر من راتنج Ni-NTA في عمود دوران وتغسل بالماء المقطر المزدوج المعقم. بعد ذلك ، قم بموازنة الراتنج مع 100 CV (4 مل) من محلول التوازن [20 mM من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 300 mM من NaCl ، 10 mM من imidazole ، 10 μg / mL من BSA ، و 1 mM من β-ME] (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: يمكن أيضا إجراء السحب لأسفل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
2. قم بإعداد العينة عن طريق خلط 5 ميكرومتر من مرافقة هيستون الموسومة بعلامة His-taged مع 20 ميكرومتر من هيستون H2A / H2B dimer أو H3 / H4 tetramer في مخزن التوازن المؤقت. احتضان العينة على الجليد لمدة 1 ساعة.
   ملاحظة: يتم تحضير ثنائي H2A / H2B ورباعي H3 / H4 من الهستونات البشرية المؤتلفة²¹ ، ويتم تأكيد سلامة oligomers بناء على الكتل الجزيئية المقدرة بواسطة الطرد المركزي التحليلي الفائق (AUC). تم استخدام نفس أوليغومرات هيستون لجميع التجارب المذكورة أدناه.
3. قم بتحميل العينات في أعمدة دوران منفصلة متوازنة مسبقا براتنج Ni-NTA من الخطوة 2.1 ، كل منها مسمى لتركيز ملح معين ، واحتفظ بالأعمدة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي الأعمدة في 1000 × ز لمدة 1 دقيقة.
4. بعد ذلك ، اغسل الأعمدة ب 100 CV (4 مل) من محلول الغسيل [20 mM من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 50 mM من الإيميدازول ، و 0.2٪ من Tween-20 ، و 1 mM من β-ME] تحتوي على تركيزات ملح مختلفة (أي 300 mM ، 500 mM ، 600 mM ، 700 mM ، 800 mM ، 900 mM و 1 M NaCl). اغسل كل عمود بمخزن مؤقت يحتوي على تركيز ملح معين.
5. بعد خطوة غسل الملح ، قم بإخراج البروتين من الأعمدة المختلفة باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الشطف [20 مللي متر من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 300 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، 300 مللي متر من إيميدازول ، و 1 مللي متر من β-ME].
6. بعد ذلك ، قم بإخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE²² وتصور الجل بعد تلطيخه باستخدام Coomassie Brilliant Blue R250 (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكنك تحميل الراتنج مباشرة على هلام SDS-PAGE بدلا من استخلاص البروتين المرتبط من راتنج Ni-NTA.
   ملاحظة: يمكن تعديل تركيبات الموازنة والغسيل والشطف المؤقت ودرجة الحموضة اعتمادا على البروتين محل الاهتمام.

3. مقايسة منسدلة تنافسية لتحديد تفضيل مرافق هيستون ل H2A / H2B أو H3 / H4

1. تحضير عمود الدوران كما هو موضح في الخطوة 2.1
2. احتضان 5 ميكرومتر من مرافقة هيستون مع 20 ميكرومتر من ثنائي H2A / H2B في 300 ميكرولتر من مخزن التوازن المؤقت (محضر في الخطوة 2.1) لمدة 30 دقيقة على الجليد.
   ملاحظة: يمكن اختيار نسبة أوليغومر هيستون إلى هيستون تشابيرون في التفاعل بناء على بيانات القياس المتكافئ المعروفة ؛ استخدم هيستون الزائد بخمسة أضعاف في حالة عدم توفر معلومات.
3. قم بالطرد المركزي لمركب histone chaperone-H2A / H2B عند 16200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي راسب. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة على عمود الدوران المتوازن مسبقا مع مخزن التوازن المؤقت (المعد في الخطوة 2.1) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
4. اغسل العمود ب 100 CV (4 مل) من محلول الغسيل [20 ملي مول من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، و 300 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي متر من الإيميدازول ، و 0.2٪ من Tween-20 ، و 1 ملي متر من β-ME] لإزالة ديمر H2A / H2B الزائد. بعد ذلك ، امزج مركب هيستون chaperone-H2A / H2B مع 20-60 ميكرومتر من رباعي H3 / H4 واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الجليد.
5. أعد غسل العمود ب 100 CV (4 مل) من مخزن الغسيل المؤقت (معد في الخطوة 3.4) لإزالة أي رباعي H3 / H4 غير منضم وتخفيف العينة باستخدام مخزن الشطف المؤقت (معد في الخطوة 2.5). قم بإخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE وتصورها بعد تلطيخها باستخدام Coomassie Brilliant Blue R250.
   ملاحظة: يمكن عكس الفحص حيث ، أولا ، يمكن خلط رباعي H3 / H4 مع المرافق ، ويسمح للمجمع بالارتباط بخرز Ni-NTA ، ثم يتم تحضين المركب بتركيزات متفاوتة من H2A / H2B dimer.

4. تجارب الطرد المركزي التحليلي - سرعة الترسيب (AUC-SV) لتحليل القياس المتكافئ بين مرافقي الهستون والهستونات

1. تحضير العينة للجامعة الأمريكية بالقاهرة
   1. قم بتحليل هيستون H2A / H2B dimer المعاد تشكيله ، ورباعي H3 / H4 ، ومرافقة هيستون بشكل منفصل من خلال أنبوب غسيل الكلى المقطوع 7 كيلو دالتون 23 ، مقابل مخزن غسيل الكلى [²⁰ mM من Tris (درجة الحموضة 7.5) ، 300 mM من كلوريد الصوديوم ، و 1 mM من β-ME] (انظر جدول المواد). لتقليل خطأ الخلفية بسبب عدم تطابق المخزن المؤقت ، قم بإجراء غسيل الكلى على نطاق واسع ضد المخزن المؤقت لغسيل الكلى ، ويفضل ثلاث مرات خلال فترة 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن يكون للOD 280 الأولي لعينات البروتين قيمة أعلى بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف لتحقيق OD₂₈₀ النهائي من 0.3-0.5. يتم ذلك بشكل أساسي لإبطال آثار التخفيف.
   2. قم بتنقية H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer ومرافقة هيستون بشكل فردي باستخدام المخزن المؤقت لغسيل الكلى ، باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (كما هو مذكور في الخطوة 1). احفظ المخزن المؤقت من المدى لإعداد المزيد من التخفيفات لاحقا واستخدامها كمرجع في خلية AUC.
2. تحميل عينة للجامعة الأمريكية بالقاهرة
   1. امزج البروتينات المنقاة في حجم نهائي قدره 450 ميكرولتر باستخدام محلول غسيل الكلى من الخطوة 4.1.1 للوصول إلى_{OD 280} من 0.3-0.6. امزج مرافقة هيستون مع H2A / H2B dimer أو رباعي H3 / H4 لتشكيل معقد في أنابيب تفاعل منفصلة. احتضان مخاليط البروتين لمدة 2-3 ساعات.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على بيانات الترسيب باستخدام نظام المسح الضوئي المتداخل في جهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق. بشكل منفصل ، لخلط البروتينات النقية ، قم بإصلاح تركيز هيستون تشابيرون واحتضانه بتركيزات متزايدة من أوليغومرات هيستون للحصول على القياس المتكافئ الدقيق.
   2. قم بتجميع الخلية بقطعة مركزية مزدوجة القطاع ونوافذ كوارتز لتجربة AUC-SV باستخدام كاشف امتصاص لجهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق كما هو موضح سابقا بالتفصيل²⁴.
   3. املأ 400 ميكرولتر من محلول العينة و 420 ميكرولتر من محلول غسيل الكلى في القطاعين (العينة والقطاعات المرجعية ، على التوالي) للخلية.
      ملاحظة: يتم استخدام حجم أكبر من المخزن المؤقت في القطاع المرجعي للحفاظ على الغضروف المفصلي المرجعي فوق الغضروف المفصلي للعينة. ومع ذلك ، أثناء استخدام نظام التداخل البصري ، املأ القطاعين بحجم متساو.
   4. قم بوزن الخلايا وموازنتها بدقة وتحميلها في دوار من التيتانيوم بأربعة أماكن (انظر جدول المواد). قم بمحاذاة الخلايا باستخدام العلامات المتوفرة في الجزء السفلي من الخلايا والدوار. قم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء واتركه يحدث فراغا حتى ينخفض الضغط إلى أقل من 15 ميكرون من الزئبق وتستقر درجة حرارة الدوار إلى 20 درجة مئوية (عادة ما يستغرق 2-2.5 ساعة).
      ملاحظة: تتضمن معلمات تشغيل AUC درجة الحرارة التجريبية وسرعة الدوار والفاصل الزمني بين عمليات المسح وعدد عمليات المسح التي سيتم جمعها. في حالة تجارب SV ، يتم إعطاء الفاصل الزمني للمسح وفقا للكتلة الجزيئية للبروتين. تتطلب البروتينات الأصغر فترات زمنية أكبر بين عمليات الفحص. يتم ضبط سرعة الدوار أيضا وفقا للكتلة الجزيئية المتوقعة للبروتين ، ويتم إجراء التجربة عند 20 درجة مئوية. تتم مراقبة بيانات الامتصاص عند 280 نانومتر.
   5. للحصول على القياس المتكافئ الدقيق ، حافظ على تركيز هيستون تشابيرون ثابتا واحتضان بتركيزات متزايدة من أوليغومرات هيستون لتحقيق التشبع.
3. تحليل بيانات الجامعة الأمريكية بالقاهرة
   1. قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح سابقا²⁵. باختصار ، احسب الكثافة واللزوجة لمكونات المخزن المؤقت باستخدام برنامج SEDNTERP²⁶ (انظر جدول المواد). وبالمثل ، احسب الحجم النوعي الجزئي للبروتين بناء على تركيبة الأحماض الأمينية ، باستخدام SEDNTERP أيضا.
   2. قم بتحميل البيانات من جهاز AUC إلى برنامج SEDFIT²⁷ وحدد الغضروف المفصلي (الخط الأحمر) وأسفل الخلية (الخط الأزرق) وحدود تحليل البيانات (الخطوط الخضراء). اختر توزيع C (s) المستمر كنموذج.
   3. بعد ذلك ، قم بتعيين الدقة القصوى حتى 100 ؛ ضبط معامل الترسيب (S) ، S دقيقة: 0 و S كحد أقصى: 10-15 ؛ اضبط نسبة الاحتكاك على 1.2 في البداية واختر التعويم لاشتقاق النسبة من البيانات ؛ ضبط مستوى الثقة (نسبة F ؛ التي تحدد حجم التنظيم) إلى 0.68 لتنظيم 1 سيغما ؛ قم بتعيين قيم الحجم النوعي الجزئي وكثافة المخزن المؤقت ولزوجة المخزن المؤقت كما تم الحصول عليها من SEDNTERP.
   4. اضغط على RUN للسماح للبرنامج بحل معادلة لام²⁷. اضبط المعلمات إذا كان هناك عدم تطابق كبير في البيانات. بعد ضبط المعلمات ، اضغط على FIT لتحسين جميع المعلمات. قم بتقييم جودة الملاءمة بناء على قيمة انحراف الجذر والمتوسط التربيعي (RMSD) ، والتي يجب أن تكون أقل من 0.01 وحدة إشارة.
   5. قم بتقدير الكتل الجزيئية للقمم عن طريق تحديد الخيار: إظهار الذروة "Mw in c (s)" في وظيفة العرض لشريط الأدوات الرئيسي ، والتي ستوفر معلومات حول "s" للجزيء / المجمع.

5. مقايسة البلازميد فائقة اللف لتأكيد وظيفة مرافقة هيستون

1. تفاعل تجميع النيوكليوسوم
   1. امزج 2 ميكرومتر من رباعي H3 / H4 و 4 ميكرومتر من ثنائي H2A / H2B مع تركيزات متزايدة من مرافقة هيستون (1-6 ميكرومتر) في مخزن تجميع [20 مللي متر من Tris HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 مللي متر من DTT ، 1 مللي متر من MgCl₂ ، 0.1 مجم / مل من BSA ، و 100 مللي متر من كلوريد الصوديوم] إلى حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر. احتضان الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. في نفس الوقت ، في تفاعل منفصل ، قم بمعالجة 500 نانوغرام من بلازميد pUC19 ذو اللف الفائق السالب مع 1 ميكروغرام من إنزيم topoisomerase I (انظر جدول المواد) في مخزن التجميع المؤقت في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يعمل Topoisomerase I على إرخاء الحمض النووي البلازميد المزدوج الملتف عن طريق توليد شق مفرد تقطعت به السبل. يمكن استخدام إنزيم توبويزوميراز I من أصل حقيقي النواة ، مثل توبويزوميراز الأول من جنين القمح المتاح تجاريا أو ذبابة الفاكهة المعبر عنها بشكل مؤتلف ذبابة الفاكهة ميلانوجاستر توبويزوميراز I.
   3. بعد ذلك ، ادمج رباعي H3 / H4 ، و H2A / H2B dimer ، وخليط histone chaperone (من الخطوة 5.1.1) ، وخليط تفاعل الحمض النووي البلازميد المريح (من الخطوة 5.1.2) ، واحتضان أكثر عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
      ملاحظة: قم بإعداد تفاعلين للتحكم للفحص ؛ أحدهما يحتوي على مرافقة هيستون والحمض النووي البلازميد المريح (ولكن ليس الهستون) والآخر يحتوي على أوليغومرات هيستون والحمض النووي البلازميد المريح (ولكن ليس مرافقة هيستون).
   4. أوقف تفاعل التجميع بإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2x (40 مللي متر من EDTA ، و 2٪ من SDS ، و 0.4 مجم / مل من البروتيناز K) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: إيقاف المخزن المؤقت يزيل البروتين من الحمض النووي البلازميد عن طريق تمسخ وتحلل البروتين من هستونات مرتبطة.
2. استخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الإيثانول
   1. أضف حجما متساويا من الفينول المشبع بالتريس في الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل من الخطوة 5.1.4 واخلطه جيدا ، متبوعا بالطرد المركزي عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. اجمع برفق المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد مع ماصة دقيقة واخلطها مع حجم متساو من الكلوروفورم. دوامة الخليط وأجهزة الطرد المركزي في 16200 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تضمين كحول الأيزو أميل في هذه الخطوة لتجنب وجود واجهة غامضة بين المرحلتين المائية والعضوية.
   3. بعد ذلك ، اجمع المرحلة المائية العليا ، وأضف 1/10 حجم 3 م أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.5) و 2.5 حجم من الإيثانول المثلج (انظر جدول المواد). امزج المحلول جيدا عن طريق قلب الأنبوب 3-4 مرات واحتفظ بالمزيج في مجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لترسيب كامل للحمض النووي البلازميد.
   4. قم بالطرد المركزي للعينة من الخطوة 5.2.3 بسرعة 16200 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية برفق. أبق الأنابيب مفتوحة في درجة حرارة الغرفة حتى تتبخر كميات ضئيلة من الإيثانول ، تاركة الحمض النووي البلازميد المترسب في الأنبوب.
3. أداء الكهربائي هلام agarose لمراقبة تأثير supercoiling البلازميد.
   1. قم بإذابة الحمض النووي البلازميد المترسب من الخطوة 5.2.4 في ماء مقطر مزدوج معقم.
   2. قم بتحليل العينات على هلام أغاروز 1٪ في 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) عازلة (40 مللي متر من Tris ، و 20 mM من حمض الخليك ، و 1 mM من EDTA) (انظر جدول المواد).
   3. قم بتلطيخ الجل بتركيز 0.2-0.5 ميكروغرام / مل من بروميد الإيثيديوم وراقبه تحت الأشعة فوق البنفسجية لتصور نطاقات الحمض النووي على الجل.

تعرض مجال نيوكليوبلازمين N-terminal المؤتلف للبروتين FKBP53 من Arabidopsis thaliana ل SEC التحليلي. تم رسم حجم ذروة الشطف مقابل المنحنى القياسي لتحديد حالته قليلة القسيمة. كشفت نتائج SEC التحليلية أن المجال موجود كمحلول خماسي ، بكتلة جزيئية تقريبية تبلغ 58 كيلو دالتون (الشكل 1 أ ، ب). علاوة على ذلك ، تم تحليل مجال النيوكليوبلازمين من أجل الاستقرار الحراري والكيميائي بالتزامن مع SEC التحليلي. لم تظهر عينة النيوكليوبلازمين الخاضعة للمعالجة الحرارية حتى 90 درجة مئوية أي تحول واضح في حجم الشطف وارتفاع الذروة مقارنة بالعينات المحفوظة عند 20 درجة مئوية ، مما يشير إلى أن المجال شديد الثبات للحرارة (الشكل 1C). وبالمثل ، أظهر مجال النيوكليوبلازمين استقرارا للملح يصل إلى 2 M من كلوريد الصوديوم (الشكل 1D) واستقرار اليوريا حتى 4 M (الشكل 1E). ومع ذلك ، بدأ بنتامر النيوكليوبلازمين في الانفصال بتركيزات أعلى من اليوريا.

تم إجراء اختبار منسدل لتحديد نوع التفاعلات التي تساهم في التكوين المعقد بين مرافقة هيستون (مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53) وأوليغومرات هيستون H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer باستخدام غسل الملح المتدرج. كان تفاعل مجال النيوكليوبلازمين مع ثنائي H2A / H2B مستقرا حتى تركيز ملح يبلغ 0.4 M NaCl (الشكل 2A). وبالمقارنة ، كان الارتباط مع H3 / H4 مستقرا بشكل معقول حتى 0.7 مليون كلوريد الصوديوم (الشكل 2 ب). تشير قدرة مجمعات chaperone-histone على تحمل تركيز الملح العالي إلى دور التفاعلات الكارهة للماء في تثبيت المجمعات. يشير مركب chaperone مع استقرار H3 / H4 حتى في تركيزات الملح العالية إلى دور سائد للتفاعلات الكارهة للماء في التكوين المعقد. يكشف الاستقرار المنخفض لمجمع H2A / H2B-chaperone في تركيزات الملح العالية عن دور مهم للتفاعلات الكهروستاتيكية في التكوين المعقد. في تجربة أخرى ، تم استخدام اختبار السحب لأسفل لفحص ما إذا كان المرافق يفضل إما H2A / H2B dimer أو H3 / H4 tetramer. كشفت النتائج أن المرافق يرتبط ب H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer في وقت واحد وبغض النظر عن الترتيب الذي يتم إضافتهما به إلى المرافق (الشكل 2C ، D). هذا يشير إلى أن chaperone يمتلك مواقع منفصلة لتفاعله مع oligomers.

تم إجراء تجارب AUC-SV (الشكل 3) لدراسة القياس المتكافئ للتفاعل بين أوليغومرات الهستون والمرافقين. قدم تحليل بيانات AUC-SV قيمة معامل (معامل) ترسيب تبلغ 5.40 S لمجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53 في مجمع مع H2A / H2B يتوافق مع كتلة جزيئية تبلغ 104 كيلو دالتون. أعطى مجمع مجال النواة مع H3 / H4 قيمة معامل الترسيب 7.35 S ، أي ما يعادل 129 كيلو دالتون. تكشف الكتلة الجزيئية المقدرة للمجمعات أن بلازمين النيوكليوبلازمين الخماسي يتشكل معقدا مع كل من H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer في قياس متكافئ 1: 1.

من الضروري إظهار أن البروتين يمكن أن يودع أوليغومرات هيستون في الحمض النووي للتأكد من أنه مرافقة هيستون. تحقيقا لهذه الغاية ، تم اعتماد اختبار البلازميد الفائق (الشكل 4). تم تحضين البلازميد الدائري المريح مع أوليغومرات هيستون H2A / H2B و H3 / H4 مع مرافقي هيستون النبات المؤتلف من عائلة NAP - AtNRP1 و AtNRP228. أدى وجود المرافقون إلى زيادة كمية البلازميد فائق الالتفاف ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يودع الهستونات على الحمض النووي لتكوين النيوكليوسومات ، مما يتسبب في الالتفاف الفائق للحمض النووي.

الشكل 1: حالة قلة القسيمات واستقرار مجال بلازما النيوكليوبلازمين في AtFBP53. (أ) ملف كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لمجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53. (ب) منحنى المعايرة الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتينات الكروية ذات الكتلة الجزيئية المعروفة. تمثل النقاط الزرقاء الكتلة الجزيئية للبروتينات المعروفة ، بينما تمثل النقطة الحمراء مجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53. (440 كيلو دالتون - فيريتين ، 158 كيلو دالتون ألدولاز ، 75 كيلو دالتون كون ألبومين ، 44 كيلو دالتون أوفالبومين ، 6.5 كيلو دالتون أبروتينين). (C) كروماتوجرام تحليلي لاستبعاد الحجم يبلغ 500 ميكرولتر من مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53 الخاضع للمعالجة الحرارية عند درجات حرارة مختلفة: 20 درجة مئوية (خضراء) ، 40 درجة مئوية (برتقالي) ، 60 درجة مئوية (أسود) ، 90 درجة مئوية (أزرق فاتح). (د) كروماتوجرام تحليلي لاستبعاد الحجم يبلغ 500 ميكرولتر من مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53 في مخازن مؤقتة تحتوي على تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم: 0.3 م (أرجواني) ، 0.6 م (أحمر) ، 1.0 م (أزرق فاتح) ، 1.5 م (أخضر) ، 2.0 م (أسود). (ه) كروماتوجرام استبعاد الحجم التحليلي لمجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53 في مخازن مؤقتة بتركيزات مختلفة من اليوريا: 0 M (تحكم ؛ أزرق فاتح) ، 1.0 M (وردي) ، 2.0 M (أسود) ، 3.0 M (أزرق غامق) ، 4.0 M (أخضر) ، 5.0 M (بني). يظهر بنتامر النيوكليوبلازمين ثباتا عاليا لظروف الإجهاد الحراري والكيميائي. الشكل مقتبس من المرجع21. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: المقايسات المنسدلة لتفاعل مجال النيوكليوبلازمين ل AtFKBP53 مع أوليغومرات الهيستون. يتم عرض 18٪ من صور SDS-PAGE لكسور الشطف من المقايسات هنا. مقايسة السحب لأسفل ل ( A ) 20 μM H2A / H2B dimer و (B) 20 μM H3 / H4 tetramer مع 5 μM AtFKBP53 مجال نيوكليوبلازمين في تركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم في نطاق 0.3 M و 0.5 M و 0.6 M و 0.7 M و 0.8 M و 0.9 M و 1.0 M. 5 ميكرومتر AtFKBP53 FKBD تم استخدامه كعنصر تحكم سلبي هنا. بالنسبة لتجربة الربط التنافسي ، ( C ) تم استخدام خليط من مجال نيوكليوبلازمين 5 μM AtFKBP53 و 20 μM H3 / H4 tetramer محتضن بمدى 20-60 μM H2A / H2B dimer و (D) خليط من 5 μM AtFKBP53 مجال نيوكليوبلازمين و 20 ميكرومتر H2A / H2B dimer محتضنة مع مجموعة من 20-60 μM H3 / H4 tetramer. تتوافق التسمية AtFKBP53 مع مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53. تظهر كسور الشطف ارتباطا متزامنا لكل من أوليغومرات هيستون بالنيوكليوبلازمين. الشكل مقتبس من المرجع21. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تجربة الطرد المركزي التحليلي - سرعة الترسيب (AUC-SV) لأوليغومرات هيستون ، ومجال بلازما النيوكليوبلازمين ل AtFKBP53 ، ومعقداتها. توزيع المسافة بين الجامعة الأمريكية بالقاهرة مقابل معامل الترسيب (S) المؤامرة. يتم أيضا توفير قيم معامل (معامل) الترسيب التي تم الحصول عليها والكتل الجزيئية. تتوافق التسمية AtFKBP53 مع مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53. تكشف الكتل الجزيئية المقدرة عن قياس متكافئ 1: 1 لمجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53 مع أوليغومرات هيستون H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer. تم استخدام 450 ميكرولتر من جميع عينات البروتين التي تحتوي على OD280 من 0.3-0.5 لتجارب AUC-SV. الشكل مقتبس من المرجع21. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: مقايسة البلازميد الفائق اللفائف. مقايسة البلازميد الفائقة لمرافقي هيستون AtNRP1 و AtNRP2. تمت معالجة 500 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد pUC19 ب 1 ميكروغرام من Topoisomerase I للتجربة. 4 ميكرومتر AtNRP1 ، 4 ميكرومتر AtNRP2 ، وخليط من 4 ميكرومتر H2A / H2B dimer و 2 μM H3 / H4 رباعي كانت كعنصر تحكم لا يظهر أي نشاط فائق الالتفاف عند حضنها بالحمض النووي pUC19 المعالج مسبقا. تظهر الممرات التي تحتوي على خليط من 4 μM H2A / H2B من dimer و 2 μM H3 / H4 من tetramer و 4 μM لكل من AtNRP1 و AtNRP2 تكوين الحمض النووي فائق الالتفاف عند الحضانة مع الحمض النووي pUC19 المعالج مسبقا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.