هنا ، نقدم بروتوكول فحص كيميائي محسن. الهدف من هذا البروتوكول هو تقليل خطوات وتكاليف طرق التاكسي الكيميائي البكتيرية التقليدية والعمل كمورد قيم لفهم التفاعلات بين النبات والميكروبات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هنا ، نقدم بروتوكول فحص كيميائي محسن. الهدف من هذا البروتوكول هو تقليل خطوات وتكاليف طرق التاكسي الكيميائي البكتيرية التقليدية والعمل كمورد قيم لفهم التفاعلات بين النبات والميكروبات.
تحديد التاكسي الكيميائي مهم جدا للبحث وتطبيق البكتيريا المعززة لنمو الريزوسفير. أنشأنا طريقة مباشرة لتحديد الجاذبات الكيميائية بسرعة والتي يمكن أن تحفز الحركة الكيميائية للبكتيريا المعززة لنمو الريزوسفير على شرائح زجاجية معقمة عبر خطوات بسيطة. تمت إضافة محلول البكتيريا (OD600 = 0.5) والمحلول المائي الجاذب الكيميائي المعقم قطرة على الشريحة الزجاجية بفاصل زمني قدره 1 سم. تم استخدام حلقة تلقيح لتوصيل المحلول المائي الجاذب الكيميائي بالمحلول البكتيري. تم الاحتفاظ بالشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على المقعد النظيف. وأخيرا ، تم جمع المحلول المائي الجاذب الكيميائي للعد البكتيري والمراقبة المجهرية. في هذه الدراسة ، من خلال مقارنات متعددة للنتائج التجريبية ، تغلبت الطريقة على أوجه قصور متعددة في طرق التاكسي الكيميائي البكتيرية التقليدية. قللت الطريقة من خطأ عد اللوحات وقصرت الدورة التجريبية. لتحديد المواد الجاذبة للكيماويات ، يمكن لهذه الطريقة الجديدة توفير 2-3 أيام مقارنة بالطريقة التقليدية. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه الطريقة لأي باحث بإكمال تجربة التاكسي الكيميائي البكتيري بشكل منهجي في غضون 1-2 أيام. يمكن اعتبار البروتوكول موردا قيما لفهم التفاعلات بين النبات والميكروبات.
يعتبر التاكسي الكيميائي مهما لاستعمار البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات (PGPR) على الجذور ولفهم التفاعلات بين النبات والميكروبات1. تحفز فئة من المركبات منخفضة الوزن الجزيئي (الجاذبات الكيميائية) في إفرازات جذور النباتات الحركة الكيميائية ل PGPR إلى الريزوسفير2. حمض الماليك وحمض الستريك والمكونات الأخرى في إفرازات الجذر تحفز التاكسي الكيميائي لسلالات العصوية3. على سبيل المثال، الجلوكوز وحامض الستريك وحمض الفوماريك في إفرازات جذور الذرة تجند البكتيريا إلى سطح الجذر4. D-galactose ، المشتق من إفرازات الجذر ، يحفز التاكسي الكيميائي ل Bacillus velezensis SQR95. تؤثر الأحماض العضوية ، بما في ذلك الفومارات وحمض الماليك والسكسينات ، على التاكسي الكيميائي واستعمار مختلف PGPR في كاجانوس كاجان - Zea mays نظام المحاصيل البينية 6. حمض الأوليانوليك في إفرازات جذر الأرز ، يعمل كعامل جذب كيميائي للسلالة FP357. يمكن أن تلعب الإفرازات النباتية الأخرى (بما في ذلك الهيستيدين والأرجينين والأسبارتات) دورا حاسما في الاستجابة الكيميائية للبكتيريا8. تعمل إفرازات النبات كإشارة لتوجيه حركة البكتيريا ، وهي الخطوة الأولى أثناء استعمار الريزوسفير. استعمار النبات بواسطة PGPR هو عملية ذات أهمية هائلة ، حيث أن PGPR مفيد لمضيف النبات.
تم استخدام العديد من الطرق لتحليل التاكسي الكيميائي البكتيري. طريقة لوحة السباحة هي واحدة من الطرق الموضحة سابقا9. في هذه الطريقة ، تم تصنيع الألواح بوسط شبه صلب. تمت إضافة مخزن مؤقت كيميائي يحتوي على أجار (1.0٪ ، ث / v) إلى اللوحة. يتم تسخين المخزن المؤقت ، ثم يتم خلطه مع الجاذب الكيميائي. ثم ، تمت إضافة 8 ميكرولتر من تعليق البكتيريا إلى منتصف اللوحة وتم وضع اللوحة في حاضنة عند 28 درجة مئوية. تمت ملاحظة اللوحة وتصويرها بانتظام. ومع ذلك ، كانت الدورة التجريبية لطريقة لوحة السباحة طويلة جدا. في الطريقة الشبيهة بالشعيرات الدموية10 ، يعمل طرف الماصة كغرفة لحمل 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري. تم استخدام إبرة حقنة 1 مل كشعيرات دموية. تم إدخال إبرة حقنة تحتوي على جاذبات كيميائية ذات تدرجات تركيز مختلفة في طرف ماصة 100 ميكرولتر. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات ، تمت إزالة إبرة المحقنة ، وتم تخفيف المحتوى وطلائه على الوسط. تم تمثيل التراكم البكتيري في المحقنة بوحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) في اللوحات. ومع ذلك ، كان الخطأ التجريبي داخل النسخ المتماثلة للطريقة الشبيهة بالشعيرات الدموية كبيرا. استخدمت طريقة أخرى جهاز SlipChip ميكروفلويديك 11. باختصار ، تم حقن محلول ألبومين مصل البقر (BSA) في جميع القنوات وإزالته باستخدام فراغ. تمت إضافة المحاليل التي تحتوي على جاذبات كيميائية مختلفة (تركيز 1 mM للكشف النوعي فقط) ، والخلايا البكتيرية المعلقة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ومخزن ملحي مخزن بالفوسفات (التحكم السلبي) إلى الآبار الدقيقة العلوية والوسطى والسفلية ، على التوالي. ثم تم إجراء الحضانة في بيئة مظلمة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم تم الكشف عن الخلايا البكتيرية في الآبار الصغيرة. ومع ذلك ، كان جهاز SlipChip الموائع الدقيقة باهظ الثمن. لذلك ، كان لكل طريقة من الطرق الموضحة أعلاه مزايا وعيوب.
أنشأنا مقايسة كيميائية محسنة للتعرف السريع على الجاذبات الكيميائية الريزوبكتيرية في إفرازات الجذر باستخدام شرائح زجاجية معقمة دون خطوات معقدة. في هذه الدراسة ، من خلال مقارنات متعددة للنتائج التجريبية ، تغلبت الطريقة على أوجه قصور متعددة في طرق التاكسي الكيميائي البكتيرية التقليدية. قللت الطريقة من خطأ عد اللوحات وقصرت الدورة التجريبية. لذلك ، إذا تم استخدامها لتحديد مادة جاذبة كيميائيا ، فإن هذه الطريقة الجديدة يمكن أن توفر 2-3 أيام وتقلل من تكلفة المواد التجريبية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. المواد والمعدات
ملاحظة: تم عزل Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) من ريزوسفير الأرز في شمال شرق الصين12,13 لهذه الدراسة.
2. جمع إفرازات الجذر
3. تحليل الكروماتوغرافيا السائلة لقياس الطيف الكتلي لإفرازات الجذر
4. فحص التاكسي الكيميائي
5. تحليل النتائج

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم الكشف عن ما مجموعه 584 و 937 مستقلبا معروفا في مؤشرات الأيونات الإيجابية والسالبة ، على التوالي. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الجاذبات الكيميائية هي عادة الأحماض العضوية والأحماض الأمينية والكربوهيدرات17،18.
في هذه الدراسة ، تم اختيار 16 نوعا من الجاذبات الكيميائية من دراسات LC-MS في إفرازات ريزوسفير الأرز للتجارب اللاحقة (الجدول 1). باستخدام طريقة لوحة السباحة ، قمنا بفحص المركبات ذات الوزن الجزيئي المنخفض التي يف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تشير الأبحاث المتزايدة إلى أن التفاعلات بين النبات والبكتيريا تحدث بشكل رئيسي في الريزوسفير وتتأثر بإفرازات الجذر20،21،22،23،24. تشمل إفرازات جذور النباتات مجموعة متنوعة من الأيضات الأولية ، بما في ذلك الأحماض الفينولية والأحماض العضوية والأحماض الأمينية بالإضافة إلى المركبات الثانوية الأكثر تعقيدا 25،26
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31870493) ، ومشاريع البحث والتطوير الرئيسية في هيلونغجيانغ ، الصين (GA21B007) ، ورسوم البحوث الأساسية للجامعات في مقاطعة هيلونغجيانغ ، الصين (رقم 135409103).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2،5-حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| أسيتات الأمونيوم | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| حمض الكافيين | Beijing InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 331-39-5 | |
| أجهزة الطرد المركزي | الحرارية فيشر العلمية | هيريوس فريسكو17 | |
| حامض الستريك | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 77-92-9 | |
| مقعد نظيف | شنغهاي Boxun الصناعية المحدودة | BJ-CD | |
| حمض الفيروليك | Beijing InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 1135-24-6 | |
| حمض الفورميك | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| الفركتوز | Beijing InnoChem Science & amp التكنولوجيا C.، المحدودة. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & amp التكنولوجيا C.، المحدودة. | 59-23-4 | |
| جلايسين | بكين InnoChem Science & amp التكنولوجيا C.، المحدودة. | 56-40-6 | |
| مطحنة طحن | شنغهاي Jingxin للتنمية الصناعية المحدودة | JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 71-00-1 | |
| المعيار الداخلي: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.، Ltd. | 103616-89-3 | |
| ليوسين | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 61-90-5 | |
| حمض الماليك | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 6915-15-7 | |
| مانوز | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 3458-28-4 | |
| مطياف الكتلة | الحرارية فيشر Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| المجهر البصري | أوليمبوس | BX43 | |
| فينيل ألانين | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 63-91-2 | |
| برولين | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 147-85-3 | |
| مقاييس | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & amp التكنولوجيا C.، المحدودة. | 56-45-1 | |
| ثريونين | بكين InnoChem Science & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| أداة الموجات فوق الصوتية | شنتشن Leidebang Electronics Co.، Ltd. | PS-60AL | |
| فالين | بكين InnoChem العلوم & التكنولوجيا C.، المحدودة. | 7004-03-7 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.