مقالة منهجية

استخدام تلطيخ أليزارين الأحمر للكشف عن فقدان العظام المستحث كيميائيا في يرقات الزرد

DOI:

10.3791/63251

⸱

ديسمبر 28, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، استخدمنا تلطيخ أليزارين الأحمر لإظهار أن التعرض لأسيتات الرصاص يسبب تغيرا في كتلة العظام في يرقات الزرد. يمكن تكييف طريقة التلوين هذه للتحقيق في فقدان العظام في فقدان يرقات الزرد الناجم عن المواد السامة الخطرة الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يؤدي فقدان العظام المستحث كيميائيا بسبب التعرض للرصاص (Pb) إلى مجموعة من الآثار الضارة على كل من أنظمة الهيكل العظمي البشري والحيواني. ومع ذلك ، فإن الآثار والآليات المحددة في الزرد لا تزال غير واضحة. يحتوي Alizarin red على تقارب كبير لأيونات الكالسيوم ويمكن أن يساعد في تصور العظام وتوضيح الكتلة المعدنية للهيكل العظمي. في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى الكشف عن فقدان العظام الناجم عن أسيتات الرصاص (PbAc) في يرقات الزرد باستخدام تلطيخ أليزارين الأحمر. وعولجت أجنة أسماك الزرد بسلسلة من تركيزات PbAc (0، 5، 10، 20 ملغم/لتر) بين 2 و120 ساعة بعد الإخصاب. تم إجراء تلطيخ الهيكل العظمي بالكامل على اليرقات في 9 أيام بعد الإخصاب ، وتم تحديد إجمالي المساحة الملطخة باستخدام برنامج ImageJ. أشارت النتائج إلى أن الأنسجة المعدنية كانت ملطخة باللون الأحمر ، وانخفضت المنطقة الملطخة بشكل ملحوظ في مجموعة التعرض ل PbAc ، مع تغير يعتمد على الجرعة في تمعدن العظام. تقدم هذه الورقة بروتوكول تلطيخ للتحقيق في التغيرات الهيكلية في عيوب العظام التي يسببها PbAc. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة في يرقات الزرد للكشف عن فقدان العظام الناجم عن المواد الكيميائية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أكدت الدراسات الحديثة أن هشاشة العظام بسبب الجلوكوكورتيكويد ومثبطات الأروماتاز والاستهلاك المفرط للكحول أمر شائع 1,2. الرصاص (Pb) هو معدن سام موجود في النباتات والتربة والبيئات المائية3. على الرغم من أن الآثار الضارة للرصاص على جسم الإنسان قد جذبت الكثير من الاهتمام ، إلا أن تأثيره الذي لا رجعة فيه على العظام يحتاج إلى مزيد من التحقيق. يسبب التسمم بالرصاص مجموعة متنوعة من التغيرات المرضية في كل من الهيكل العظمي النامي والبالغ ، مما يؤثر على أنشطة الحياة الطبيعية. وجدت الدراسات ارتباطا بين التعرض المزمن ل Pb وتلف العظام4 ، بما في ذلك ضعف هياكل العظام 5,6 ، وانخفاض كثافة المعادن في العظام ، وحتى زيادة خطر الإصابة بهشاشة العظام7.

الأنسجة المعدنية لها أهمية كبيرة لقوة العظام8 ، وترسب مصفوفة تمعدن العظام هو مؤشر حاسم لتكوين العظام9. يحتوي Alizarin red على تقارب كبير لأيونات الكالسيوم ، وتلوين Alizarin الأحمر هو إجراء قياسي لتقييم تكوين العظام10. وفقا لهذه الطريقة ، تكون الأنسجة المعدنية ملطخة باللون الأحمر ، بينما تظل جميع الأنسجة الأخرى شفافة. ثم يتم تحديد المنطقة الملطخة عن طريق تحليل الصور الرقمية11.

الزرد هو كائن نموذجي مهم يستخدم على نطاق واسع في اكتشاف الأدوية ونماذج الأمراض. أظهرت الدراسات الجينية في الزرد والبشر أوجه تشابه في الآليات الأساسية لتكوين الهيكل العظمي على المستوىالجزيئي 12. علاوة على ذلك ، فإن فحص الأدوية أو الجزيئات الحيوية عالي الإنتاجية أكثر جدوى في براثن الزرد الكبيرة من نماذج الفئران ، مما يسهل الدراسة الميكانيكية للجزيئات proosteogenic أو السامة للعظام13. كثيرا ما يستخدم التلوين التفاضلي للهيكل العظمي في توتو10 في دراسة خلل التنسج الهيكلي في الفقاريات الصغيرة والأجنة الثديية. تم إجراء تلطيخ أحمر Alizarin للتحقيق في السمية التنموية للعظام للمواد الكيميائية في يرقات الزرد. هنا ، استخدمنا الرصاص كمثال لوصف بروتوكول للكشف عن عيوب العظام التي تسببها أسيتات الرصاص في يرقات الزرد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الموضحة هنا والموافقة عليها من قبل معهد رعاية الحيوان التابع للجنة الأخلاقيات بجامعة سوشو.

1. تربية الأسماك وجمع الأجنة 14

  1. إطعام الأسماك ثلاث مرات كل يوم ؛ تأكد من الحفاظ على سمك الزرد عند 28.5 ± 0.5 درجة مئوية مع دورة ضوء / مظلمة 14:10 ساعة.
  2. فصل ذكور وإناث الأسماك البالغة بواسطة ألواح عزل في أحواض التفريخ بنسبة 2: 1 من الذكور إلى الإناث في المساء.
  3. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة ألواح العزل في الساعة 9:00 صباحا وجمع الأجنة بعد 2 ساعة.
  4. ضع الأجنة في حاضنة كيميائية حيوية يتم الحفاظ عليها عند 28.5 درجة مئوية قبل التجربة.

2. التعرض الكيميائي

  1. تحضير المرق الأم: وزن ثلاثي هيدرات خلات الرصاص (5 غرام) ، ويذوب في ماء عالي النقاء (50 مل) مع التحريك.
    تنبيه: PbAc سام. ارتد أقنعة الغبار المناسبة والملابس الواقية والقفازات. إجراء التجربة تحت غطاء الدخان.
  2. اختيار أجنة الزرد وتوزيعها عشوائيا في ألواح نظيفة من 6 آبار (30 جنينا لكل بئر في 3 مل من مياه تربية الزرد ؛ انظر الجدول 1 لتكوينها). علاج الأجنة باستخدام PbAc (0 ، 5 ، 10 ، 20 مجم / لتر) من 2 إلى 120 ساعة بعد الإخصاب (HPF).
    ملاحظة: اختيرت تركيزات PbAc وفقا لتجارب تحديد نطاق الجرعة. أظهرت النتائج أن LC50 من أسيتات الرصاص على أجنة الزرد كان 41.044 ملغم / لتر عند 120 hpf. وبالتالي ، تم تعيين أعلى تركيز إلى نصف LC50 وسلسلة من الحلول التي أعدها التخفيف 2 أضعاف.
  3. إطعام اليرقات مرتين في اليوم من 5 أيام بعد الإخصاب (dpf). الحفاظ على أجنة الزرد عند 28.5 ± 0.5 درجة مئوية مع دورة ضوئية / مظلمة 14:10 ساعة.
  4. قم بتحديث الوسط الخالي من الرصاص (مياه تربية الزرد) كل 24 ساعة حتى 9 dpf.
    ملاحظة: عند الانتهاء من التجارب ، تم سكب جميع المحاليل المحتوية على الرصاص في خزان سائل مخصص ومعالجتها بواسطة مركز إدارة التجارب.

3. اليزارين تلطيخ أحمر

ملاحظة: ارتد أقنعة غبار مناسبة وملابس واقية وقفازات أثناء عملية التلوين بأكملها. يتم عرض تركيبات جميع الحلول في الجدول 1.

  1. خطوات تلطيخ محددة
    ملاحظة: تم تنفيذ عملية الصباغة في لوحة 24 بئر في درجة حرارة الغرفة. بعد إضافة كل محلول ، ضع لوحة 24 بئرا على طاولة الاهتزاز الموضوعة بسرعة منخفضة.
    1. قم بإزالة 10 يرقات من أسماك الزرد بشكل عشوائي من كل مجموعة بمعدل 9 dpf وثبت الأسماك في 1 مل من 2٪ بارافورمالدهيد / 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة 2 ساعة.
    2. صب المحلول واغسل يرقات الزرد ب 100 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) / 10 mM MgCl2 لمدة 10 دقائق.
    3. صب المحلول واحتضان اليرقات في المحاليل التالية لمدة 5 دقائق لإزالة البقع منها: محلول الإيثانول اللامائي (EtOH) (80٪ EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2 ، 50٪ EtOH / 100 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5) ، و 25٪ EtOH / 100mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5).
    4. صب المحلول ، وأزل الصباغ عن طريق التبييض بمحلول يتكون من 3٪ H 2 O2و 0.5٪ KOH ، ولاحظ مرة واحدة كل 10 دقائق حتى تتم إزالة الصبغة تماما.
    5. اشطف يرقات الزرد عدة مرات باستخدام 25٪ جلسرين / 0.1٪ KOH لمدة 10 دقائق لكل منهما حتى لا تكون هناك فقاعات.
      ملاحظة: من المهم تجنب الفقاعات. خلاف ذلك ، ستظهر الفقاعات في جسم الزرد كمجال رؤية أسود تحت المجهر ، مما سيؤثر على الملاحظات والتحليل الكمي.
    6. وصمة عار اليرقات عن طريق نقع في 1 مل من 0.01 ٪ alizarin لمدة 50 دقيقة.
    7. صب المحلول وأضف 1 مل من 50٪ جلسرين / 0.1٪ KOH لمدة 10 دقائق لمسح الخلفية. قم بتخزين الأسماك في 50٪ جلسرين طازج / 0.1٪ KOH للمراقبة اللاحقة.

4. الحصول على الصور

  1. انقل يرقة واحدة على الشريحة الزجاجية في كل مرة ، مع إبقاء اليرقة في منتصف قطرة السائل.
  2. مراقبة اليرقات تحت المجهر ستيريو.
  3. قم بتشغيل الكاميرا وافتح البرنامج (انظر جدول المواد) واحتفظ بالإعدادات الافتراضية.
  4. انقر فوق AE ، واختر وقت التعرض المناسب (60 مللي ثانية في هذه التجربة) للحصول على أفضل صورة.
  5. التقط جميع الصور تحت نفس الإعدادات. احفظ الصور بتنسيق .tif لتحليلها لاحقا.

5. تحليل الصور

ملاحظة: راجع الملف التكميلي للحصول على مثال مع مجموعة من الرسوم البيانية النموذجية لتحليل الصور.

  1. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز ImageJ وقم بتحليل الصور المحفوظة في الخطوة 4.5.
    1. انقر فوق ملف | افتح لفتح الصور المحفوظة في الخطوة 4.5.
    2. انقر على الصورة | اكتب ، حدد 8 بت.
    3. انقر فوق تحرير | عكس.
    4. انقر فوق تحليل | معايرة ، حدد OD غير معاير في الواجهة المنبثقة ، تحقق من المعايرة العامة في الجزء السفلي الأيسر من الواجهة السفلية ، وانقر فوق موافق.
    5. انقر فوق تحليل | ضبط الميزان | انقر لإزالة المقياس في الواجهة المنبثقة ، وتحقق من Global أدناه ، وانقر فوق موافق.
    6. انقر فوق تحليل | قم بتعيين القياسات ، وحدد منطقة العنصر في الواجهة المنبثقة ، وحدد الحد إلى الحد أدناه (لقياس النطاق المحدد فقط) ، وانقر فوق موافق.
    7. انقر على الصورة | ضبط | Threshold ، حرك شريط التمرير في منتصف الواجهة المنبثقة لتحديد العتبة المناسبة (تغيير الحد لكل صورة) بحيث يتم تحديد جميع الأهداف المراد اختبارها في صورة واحدة ، وانقر فوق تعيين.
    8. انقر فوق تحليل | التدبير. سجل تواريخ كل مجموعة.
  2. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey للمقارنة المتعددة لتحليل الاختلافات ، واضبط مستوى الأهمية على p < 0.001 (***).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلطيخ Alizarin الأحمر هو طريقة حساسة ومحددة لقياس التغيرات في تمعدن العظام في يرقات الزرد. في هذه الدراسة ، لاحظنا أن PbAc كان له آثار ضارة على يرقات الزرد ، بما في ذلك الموت والتشوه وانخفاض معدل ضربات القلب وتقصير طول الجسم. علاوة على ذلك ، تم تقييم مناطق الهيكل العظمي المعدني ليرقات الزرد لفحص فقدان العظام الناجم عن PbAc. عند 9 dpf (الشكل 1A) ، يتم تمعدن العديد من عظام الهيكل العظمي للرأس وبالتالي تلطيخها باللون الأحمر ، مثل parasphenoid (PS) ، opercle (OP) ، ceratobranchial (CB) ، و notoc...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد هو نموذج مناسب لدراسة أمراض التمثيل الغذائي للعظام. بالمقارنة مع نماذج القوارض ، فإن نماذج الزرد سريعة نسبيا في التأسيس ، وقياس شدة المرض أسهل. في يرقات الزرد من النوع البري ، يحدث تمعدن الهيكل العظمي للرأس عند 5 dpf والهيكل العظمي المحوري عند 7 dpf15. وبالتالي ، تم تطوير عظام الجمجمة مثل PS و OP و CB و NC بشكل جيد عند 9 dpf. بعد إزالة البقع وتبييضها بالكامل ، تم تنظيف الأنسجة الرخوة ، مما أدى إلى ظهور شفاف لجسم السمكة. تمت إضافة كاشف تلطيخ أحمر أليزارين لتلطيخ وتصور العظام المعدنية في الزرد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81872646 ؛ 81811540034 ؛ 81573173) وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5)Solarbio ، بكين ، الصين21لاحتجاز
4٪ حل إصلاح ParaformaldehydeBBI ، شنغهاي ، الصين14أنسجة تثبيت
10x PBS عازلةBBI ، شنغهاي ، الصين15لإصلاح
35٪ H2< / sub>O2< / sub>Yonghua ، جيانغسو ، الصين8إزالة الصباغ
50 مل أنبوب الطرد المركزيAKX ، جيانغسو ، الصين4
95٪ الإيثانول اللامائيإينوكس ، جيانغسو ، الصين2destaining
Alizarin الأحمر (نقاء 99.5٪)Solarbio ، بكين ، الصين1تلطيخ
حاضنة الكيمياء الحيويةYiheng ، شنغهاي ، الصين3رفع أجنة الزرد
مقياس إلكترونيSartorius ، ألمانيا5وزن المواد الخام الصلبة
الجلسرين (نقاء 99.5٪)BBI ، شنغهاي ، الصين7تخزين الأسماك الملطخة
ImageJ (البرنامج)الولايات المتحدةالأمريكية 9التحليل الرقمي
KOH (نقاء 99.9٪)سيجما ، أمريكا10محلول تبييض
أسيتات الرصاص ثلاثي الهيدرات (نقاء 99.5٪) علاءالدين ، شنغهاي ، الصين11
MgCl 2 < / فرعي > (نقاء 99.9٪)علاء الدين ، شنغهاي ، الصين12حل تنظيف
NIS-Elements F (برنامج)نيكون ، اليابان13مراقبة والتقاط الصور
الأنابيبAKX ، جيانغسو ، الصين18إزالة الأجنة وألواح
المحلول (24 بئر)كورنينج ، أمريكا17حاوية لتلوين ألواح الأجنة
(6 بئر)كورنينج ، أمريكا16حاوية لتربية الأجنة هز
الجدولبيوتيم ، الصين19خلط الحل
مجهر ستيريونيكون ، اليابان20مراقبة والتقاط الصور
تجربة الزردالزرد بجامعة سوشو ، سوتشو ، الصين22تجريبي
مركز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
  3. Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).
  4. Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).
  5. Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
  6. Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
  7. Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
  8. Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
  9. Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
  10. Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
  11. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
  14. Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).
  15. Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).
  16. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  17. Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).
  18. Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ImageJ

مقالات ذات صلة